Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością
April 3rd, 2017
Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów z tkanek często dotkniętych stanem zapalnym wywołanym dietą, takich jak wątroba. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii i zapalenia dotyczące tego, w jaki sposób fenotyp makrofagów rezydujących w tkankach może dyktować postęp przewlekłych chorób zapalnych. Główną zaletą tej metody jest to, że procedura optymalizuje etapy izolacji potrzebne do uzyskania zawiesin jednokomórkowych pochodzących z tkanek dotkniętych przewlekłym stanem zapalnym o niskim stopniu nasilenia, w którym pośredniczy otyłość.
Procedurę zademonstruje Joselyn Allen, doktorantka z mojego laboratorium. Aby odizolować wątrobę, najpierw umieść mysz nasączoną etanolem w pozycji leżącej na desce preparacyjnej z pianki polistyrenowej i zabezpiecz przednią i tylną łapę. Następnie użyj kleszczyków ze średnią końcówką, aby chwycić skórę brzucha w pobliżu ujścia cewki moczowej i użyj ostrych nożyczek preparujących, aby zrobić małe nacięcie w uniesionej skórze.
Włóż dolne ostrze nożyczek w nacięcie między skórą a otrzewną i wykonaj boczne nacięcie od pachwiny do podbródka. Delikatnie odciągnij skórę, aby odsłonić nienaruszoną jamę otrzewnej i ścianę klatki piersiowej i wykonaj boczne nacięcie przez otrzewną. Podnieś mostek i ostrożnie nacinaj przeponę.
Następnie przesuń narządy żołądkowo-jelitowe na bok i zlokalizuj żyłę główną podwątrobową dolną lub IVC. Za pomocą kleszczy hemostatycznych zacisnąć IVC nadwątrobowy, aby utrzymać miejscową perfuzję i podłączyć strzykawkę wypełnioną wstępnie podgrzanym buforem perfuzyjnym do zestawu do pobierania i infuzji krwi o rozmiarze 23. Delikatnie wcisnąć tłok, aż rurka i igła zostaną wypełnione buforem perfuzyjnym i wprowadzić igłę równolegle do podwątrobowego IVC.
Właściwa kaniulacja IVC zapewnia, że bufor dysocjacyjny jest miejscowo rozprowadzany w wątrobie i tkankach obwodowych, optymalizując trawienie tkankowe. Użyj czterocentymetrowego zacisku hemostatycznego, aby zamocować igłę na miejscu i delikatnie naciśnij tłok, aby rozpocząć perfuzję. Jeśli igła zostanie odpowiednio umieszczona, kolor szybko wyczerwieni się z wątroby, a płaty zostaną powiększone.
Natychmiast przeciąć żyłę wrotną, aby umożliwić swobodny przepływ buforu perfuzyjnego przez wątrobę, od czasu do czasu delikatnie masując płaty między kciukiem a palcem wskazującym, aby ułatwić usunięcie krwi. Gdy pozostanie tylko pięć mililitrów buforu perfuzyjnego, zastąp strzykawkę z buforem perfuzyjnym strzykawką wypełnioną wstępnie podgrzanym buforem dysocjacyjnym, kontynuując delikatne masowanie płatów i perfuzję wątroby, aż do całkowitego strawienia. Potwierdź pomyślne trawienie, delikatnie wciskając krawędź kleszczy w lewy płat boczny.
Na powierzchni powinno pojawić się wgłębienie, które powoli wypełnia się po usunięciu kleszczy. Następnie wyjmij igłę i użyj krótkiego, prostego ostrza z nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie przeciąć więzadła łączące, aby wyciąć całą wątrobę i woreczek żółciowy. Przenieś wątrobę do 10-centymetrowego naczynia zawierającego 10 mililitrów lodowatego DMEM i użyj kleszczy zębatych, aby chwycić odcięty IVC nadwątrobowy.
Używając kleszczyków o średnim punkcie, zastosuj szybki ruch głaskania do każdego płata, aby uwolnić komórki z kapsułki Glissona i przepuść nasycony DMEM przez sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów na lodzie. Wysoką wydajność żywotnych komórek można osiągnąć tylko poprzez prawidłowe oddzielenie komórek wątroby od torebki Glissona. Po zebraniu wszystkich komórek odwróć probówkę, aby delikatnie wymieszać zawiesinę komórek i osadzać komórki przez odwirowanie.
Przenieść supernatant do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki na trzy kolejne wirówki o niskim wirowaniu. Po ostatnim odwirowaniu przenieś supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i odwiruj komórki jeszcze raz z większą prędkością. Następnie ponownie zawiesić niemiąższowy osad komórek w buforze FACS w celu zliczenia i rozcieńczyć komórki wątroby do odpowiedniego stężenia zgodnie z ich dalszym zastosowaniem w oznakowanych pięciomililitrowych rurkach z polistyrenu o okrągłym dnie.
Myszy karmione dietą wysokotłuszczową lub dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową wykazują zwiększoną infiltrację klasycznie aktywowanych makrofagów M1 w dotkniętych tkankach, takich jak aorta. Makrofagi dodatnie F4 / 80 dodatnie w aorty z ekspresją receptora RON CD45 dodatnie F4 / 80, które wykazują fenotyp przeciwzapalny, są zmniejszone u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową, podczas gdy prozapalne makrofagi CD45 dodatnie F4 / 80 dodatnie CD11c znajdują się w zwiększonej liczbie w aortach wyizolowanych od tych zwierząt. Co więcej, posortowane makrofagi wykazujące ekspresję receptora RON pochodzące z trawionych aort wykazują zwiększoną ekspresję genu arginazy 1, dobrze znanego markera makrofagów M2.
Rzeczywiście, charakterystyka makrofagów rezydujących w wątrobie ujawnia dominujący fenotyp subpopulacji eksprymujących receptor RON z prozapalnymi populacjami makrofagów CD11c dodatnich, wykazując zmniejszoną ekspresję genów, które są silnie związane z przeciwzapalnym fenotypem M2. Podobne tendencje obserwuje się w populacjach makrofagów wyizolowanych z trawionej białej tkanki tłuszczowej z prozapalnymi populacjami makrofagów fenotypowych wykazujących zmniejszoną powierzchniową ekspresję receptora RON. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 20 do 30 minut na zwierzę, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak cytometria przepływowa, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i/lub ilościowy PCR, aby dokładniej scharakteryzować fenotyp izolowanych makrofagów tkankowych pochodzących z wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo izolować makrofagi rezydujące w tkankach z chorej wątroby. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia naukowcom izolację i charakteryzację makrofagów stałych tkanki z zapalonych tkanek dotkniętych zaburzeniami metabolicznymi wywołanymi dietą. Metoda koncentruje się na optymalizacji etapów izolacji w celu uzyskania zawiesin jednokomórkowych z tkanek dotkniętych zapaleniem pośredniczonym przez otyłość.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Zapalenie
- Zaburzenia metaboliczne
Tło
- Makrofagy stałe tkanki odgrywają kluczową rolę w przewlekłych chorobach zapalnych.
- Zapalenie wywołane dietą odbija się na różnych tkankach, szczególnie na wątrobie.
- Zrozumienie fenotypu makrofagów może informować o strategiach leczenia.
- Ten protokół poprawia efektywność izolację makrofagów do badań.
Cel badania
- Izolacja i charakteryzacja makrofagów z zapalonych tkanek.
- Badanie roli makrofagów w przewlekłym zapaleniu.
- Dostarczenie niezawodnej metody uzyskania zawiesin jednokomórkowych.
Stosowane metody
- Izolacja tkanki wątroby z modeli wywołanych dietą.
- Użycie myszy nasączonych etanonem do ekstrakcji tkanek.
- Techniki sekcjonowania w celu uzyskania próbek tkanki.
- Charakteryzacja fenotypu makrofagów po izolacji.
Główne wyniki
- Udana izolacja makrofagów z tkanek wątroby.
- Charakteryzacja fenotypu makrofagów związanego z zapaleniem.
- Optymalizacja protokołu poprawia efektywność izolacji komórek.
- Wgląd w rolę makrofagów w zaburzeniach metabolicznych.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w badaniu makrofagów stałych tkanki.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia przewlekłych chorób zapalnych.
- Przyszły badania mogą budować na tej metodologii dla dalszych wglądów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Macrophage heterogeneity in obesity-driven inflammation is a critical determinant of disease progression and therapeutic targeting in metabolic and cardiovascular disorders. This protocol enables robust isolation and phenotypic characterization of tissue-resident macrophages from inflamed liver, aorta, and adipose tissue, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. Reliable access to well-characterized immune cell populations enhances translational continuity and de-risks mechanistic hypotheses across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of macrophage-driven inflammatory pathways in disease-relevant tissues.
- Supports functional target validation by distinguishing pro- and anti-inflammatory macrophage phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative phenotypic analysis of immune cell subsets.
- Improves predictive confidence for portfolio triage in metabolic and cardiovascular indications.
Screening & Assay Development
- Provides standardized single-cell suspensions for downstream flow cytometry and FACS workflows.
- Ensures reproducibility and quantitative output for immune cell profiling assays.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for compound screening.
- Supports reliable evaluation of immunomodulatory agents in disease-relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns macrophage phenotyping with translational biomarker strategies in metabolic disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of immune targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cellular phenotypes to disease progression.
- De-risks preclinical models by enabling precise immune cell characterization.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of macrophage function in inflamed tissues.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immune cell readouts for assay development.
- Analytics: Provides flow cytometry and gene expression data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects immune cell phenotypes to preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for immune cell isolation across metabolic disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes and streamlines immune cell isolation for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune-modulating therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and flow cytometry analysis.
- Demands access to FACS instrumentation and quantitative PCR capabilities for downstream characterization.
- Necessitates cross-team standardization of isolation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to multiple inflamed tissue types, including liver, aorta, and adipose tissue.
- Dependent on careful troubleshooting to optimize cell yield and viability from dense or fibrotic tissues.
