Name: Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością. Protokół optymalizuje uzyskiwanie zawiesin jednokomórkowych z wątroby do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Głównemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej w Kompleksie Naukowym Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li>
<li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+with+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease.</a> Nature. 444 (12), 875-880 (2006).</li>
<li>Jung, U., Choi, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Its+Metabolic+Complications%3A+The+Role+of+Adipokines+and+the+Relationship+between+Obesity%2C+Inflammation%2C+Insulin+Resistance%2C+Dyslipidemia+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).</li>
<li>Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+link+between+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome.</a> Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).</li>
<li>Vieira-Potter, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+macrophage+modulation+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues.</a> Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation+%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+at+the+fork+in+the+road+to+health+or+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages at the fork in the road to health or disease.</a> Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).</li>
<li>Italiani, P., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+monocytes+to+M1%2FM2+macrophages%3A+Phenotypical+vs.+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation.</a> Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).</li>
<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+remodeling+of+white+adipose+tissue+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).</li>
<li>Fujisaka, S., Usui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+for+Adipose+Tissue+M1+and+M2+Macrophages+in+Diet+Induced+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice.</a> Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotipic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Qureshi, K., Abrams, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+of+obesity+and+role+of+adipose+tissue+in+the+pathogenesis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).</li>
<li>Bedossa, P., Paradis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+extracellular+matrix+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver extracellular matrix in health and disease.</a> J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).</li>
<li>Tilg, H., Moschen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammation+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+The+multiple+parallel+hits+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis.</a> Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).</li>
<li>Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+Biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+atherosclerosis+and+the+vascular+endothelium%3A+mechanisms+of+reduced+nitric+oxide+bioavailability+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obesity%22%5BJournal%5D)">Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans.</a> Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).</li>
<li>Mestas, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis.</a> Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/ni/journal/v14/n10/full/ni.2705.html">Tissue-resident macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+Identification%2C+and+Excision+of+Murine+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots.</a> J Vis Exp. (94), e52174(2014).</li>
<li>Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://munin.uit.no/handle/10037/4575">http://munin.uit.no/handle/10037/4575</a> 1-10 (2012).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. <a target="_blank" href="http://www.aidic.it/cet/14/38/042.pdf">Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II.</a> Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).</li>
<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Free+Brown+and+White+Fat+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Isolation of Free Brown and White Fat Cells.</a> Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).</li>
<li>Seglen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yu, S., Allen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity%2C+Atherosclerosis%2C+and+Hepatosteatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+%26%2334%3BM2c%26%2334%3B+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires &#34;M2c&#34; polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).</li>
<li>Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+markers+to+delineate+murine+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages.</a> PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).</li>
<li>Rőszer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mysterious+M2+Macrophage+through+Activation+Markers+and+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms.</a> Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).</li>
<li>Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24480353">Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages.</a> Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).</li>
<li>Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+Flow+Cytometry%3A+A+Practical+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13(2014).</li>
<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Modele zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą, które naśladują choroby współistniejące, takie jak miażdżyca, stłuszczenie proste, stłuszczeniowe zapalenie wątroby i cukrzyca typu 2, są szeroko stosowane w celu lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw postępu choroby. Trawienie zależne od kolagenazy jest często stosowane do dysocjacji tkanek w celu uwolnienia komórek z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)16,27. Enzymy, takie jak kolagenaza,...

Modele myszy były szeroko wykorzystywane do badania dynamiki chorób ludzkich. Właściwa izolacja komórek rezydujących w tkance od myszy w stanie chorobowym może stanowić platformę do zrozumienia molekularnego i komórkowego wkładu w patogenezę choroby1. Jednym z zaburzeń, które ma kluczowe znaczenie, jest otyłość. Częstość występowania otyłości rośnie na całym świecie równolegle z insulinoopornością i cukrzycą typu 2, chorobami układu krążenia i stłuszczeniem wątroby2,3. Nadmierne spożycie składników odżywczych jest dodatkowo zniekształcone przez zmniejszoną aktywność fizyczną, która wyzwala zmienione sygnały emanujące z tkanki tłuszczowej, które mogą zmienić środowisko komórkowe innych tkanek obwodowych, takich jak aorta i wątroba4. Takie zaburzenie homeostazy metabolicznej skutkuje przewlekłym ogólnoustrojowym zapaleniem o niskim stopniu nasilenia5.
jove_content<Wykazano, że klasyczna aktywacja makrofagów rezydujących w aorcie i wątrobie>, jak również ich rekrutacja do białej tkanki tłuszczowej (WAT), nie tylko inicjuje rozregulowanie sygnałów metabolicznych, ale także podtrzymuje stan zapalny6,7. Heterogeniczność fenotypowa i funkcjonalna makrofagów jest silnie związana z patogenezą chorób współistniejących związanych z otyłością7. Dynamiczna plastyczność polaryzacji makrofagów pozwala tym komórkom wykazywać szereg aktywowanych fenotypów, które koordynują postęp i ustępowanie stanu zapalnego8. Podczas gdy klasycznie aktywowane makrofagi (M1) są zaangażowane w rozprzestrzenianie się stanu zapalnego, alternatywnie aktywowane makrofagi (M2) są związane z rozdzielczością i naprawą tkanek9,10.
Gdy organizm przechodzi stres metaboliczny, biała tkanka tłuszczowa nienormalnie się gromadzi. Rozszerzona tkanka tłuszczowa przyciąga i zatrzymuje komórki zapalne, które głęboko zmieniają normalną funkcję adipocytów, sprzyjając insulinooporności, hiperglikemii i ostatecznie cukrzycy typu 2, insulinooporności lub hiperglikemii11,12. Równolegle biała tkanka tłuszczowa przebudowuje się w odpowiedzi na sygnały zapalne uwalniane przez infiltrowane klasycznie aktywowane (M1) makrofagi tkanki tłuszczowej (ATM)13,14. Ten wielokomórkowy narząd emituje kaskadę sygnałów, które zakłócają normalne funkcjonowanie innych narządów ciała, takich jak aorta i wątroba4.
Wątroba to metaboliczna potęga, która dostosowuje się w odpowiedzi na bodźce pochodzące z pobliskich rozregulowanych WAT15. Makrofagi wątrobowe lub komórki Kupffera, w odpowiedzi na zmiany metaboliczne, wydzielają cytokiny zapalne, które przekształcają zarówno fenotyp komórek miąższowych, jak i niemiąższowych oraz sprzyjają przebudowie tkanek. Nagromadzenie lipidów w wątrobie, stan zapalny, nadmierne złogi macierzy zewnątrzkomórkowej, martwica i ostateczna utrata funkcji następują po urazach zapalnych, przyczyniając się do szerokiego spektrum uszkodzeń wątroby związanych z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby16,17,18.
Równolegle do upośledzenia funkcji WAT i wątroby, duże tętnice gromadzą lipidy w ścianie tętnicy, ponieważ organizm przechodzi przewlekły stres metaboliczny19. Akumulacja lipidów w tętnicach wyzwala wydzielanie chemokin przez aktywowane komórki śródbłonka, a następnie rekrutację monocytów20. Po rekrutacji monocyty namnażają się, różnicują, połykają lipoproteiny i stają się komórkami piankowatymi. Miażdżyca jest inicjowana i podtrzymywana przez prozapalną aktywność rekrutowanych i rezydujących w tkankach makrofagów obciążonych lipidami. Ulegając zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkowym sygnałom stresu przekazywanym w tym aterogennym mikrośrodowisku, makrofagi te angażują się następnie w apoptotyczną kaskadę sygnalizacyjną. Gdy te komórki piankowate obumierają, wnoszą swoją wypełnioną lipidami zawartość do martwiczego rdzenia zmiany, co następnie prowadzi do pęknięcia płytki nazębnej, zawału mięśnia sercowego i udaru.
Łącznie, niejednorodność fenotypów makrofagów częściowo koordynuje otyłość wywołaną zmianami zapalnymi obserwowanymi w rozregulowanych tkankach, takich jak WAT, wątroba i aorta8,21. Charakterystyka zrekrutowanych i rezydujących w tkankach makrofagów może dostarczyć informacji na temat potencjalnych celów molekularnych, które manipulują fenotypem makrofagów1. Aby skutecznie scharakteryzować makrofagi z tkanek zapalnych wywołanych otyłością, można uzyskać zawiesinę jednokomórkową poprzez trawienie enzymatyczne. Takie protokoły dysocjacji muszą być skuteczne w wystarczającej degradacji tkanki łącznej, jednocześnie minimalizując śmierć komórek immunologicznych i zapewniając optymalną wydajność komórek. Mieszanina enzymów zależy od rodzaju tkanki i jej budowy strukturalnej. Sprężyste tkanki, takie jak aorta, wymagają silniejszej aktywności enzymatycznej w porównaniu z wątrobą i WAT, aby osiągnąć dysocjację tkanek. Z zawiesiny pojedynczej komórki można jednoznacznie scharakteryzować lub wyizolować makrofagi rezydujące w tkankach w celu dalszych analiz, takich jak profilowanie transkrypcyjne.
Tutaj opisany jest protokół specyficzny dla tkanki, który wykorzystuje trawienie tkanek zależne od kolagenazy i polichromatyczną cytometrię przepływową, aby skutecznie izolować i charakteryzować rezydujące w tkankach makrofagi uzyskane z tradycyjnych modeli myszy indukowanych dietą, miażdżycy, prostego stłuszczenia i stłuszczeniowego zapalenia wątroby. Jednoczesne barwienie markerów powierzchniowych komórek przeciwciałami przeciwko antygenom specyficznym dla leukocytów (CD45 i/lub CD11b) i makrofagów (F4/80) jest często stosowane do identyfikacji populacji makrofagów22. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest potężną strategią stosowaną do sortowania tych zidentyfikowanych populacji o wysokiej czystości. Posortowaną populację można następnie ocenić pod kątem profili genów specyficznych dla fenotypu za pomocą dalszej analizy molekularnej (takiej jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym)23. Chociaż standardowa cytometria przepływowa i sortowanie komórek oparte na cytometrii przepływowej są potężnymi narzędziami do rozróżniania makrofagów w bardzo niejednorodnej zawiesinie komórek, te pierwsze protokoły muszą zostać zoptymalizowane, aby zapewnić pomyślne wyniki. W tym badaniu opisano protokoły, które skutecznie izolują i charakteryzują żywotne makrofagi specyficzne dla tkanki; Co ważniejsze, badanie to dostarcza kluczowych informacji na temat często pojawiających się problemów technicznych, a także proaktywnych i rozwiązywanych strategii zapobiegania im i/lub ich rozwiązywania.

<table><tbody><tr><td>Igły 26 G x 5/8 cala</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>Rurki 23 G x 0,75 cala x 12 cali Zestaw do pobierania krwi</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Służy do kaniulacji podwątrobowego IVC podczas perfuzji wątroby</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 cala. Igły</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml z gumowymi ogranicznikami</td><td></td><td></td> Strzykawka BD 309659 <td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Blok Anti-Mouse CD16/32 FC&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Szczur IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Chomik ormiański IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Szczur IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Szczur niebieski pacyficzny IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m sitka komórkowe</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,7 ml&nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowy roztwór wodny -16x</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, 3.5 cala, proste, 23 mm, ostre&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Używany do ogólnych celów preparacyjnych</td></tr><tr><td>Mikrokleszcze, 4 cale, pełna krzywa, 0,8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>Używany do ogólnych celów preparacyjnych</td></tr><tr><td>Nożyczki do preparowania sprężyn &ndash; 3 mm Krawędź tnąca&nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Służy do rozwarstwiania aorty Kroki od 1.3.3.17 do 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Zakrzywiony 0,07 mm x 0,04&nbsp; mm Kleszcze końcówkowe</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Służy do rozwarstwiania aorty Kroki 1.3.3.17 do 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne (zakrzywione)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sól sodowa</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Hodowla komórkowa/szalki Petriego</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe szalki Petriego (10 cm) z pokrywką</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe&nbsp;( Polipropylen)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 ml rurki z polistyrenu okrągłodennego&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (alkohol etylowy denaturowany, dowolny wodny)</td> <td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasse Typ XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza typu I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 500 ml&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Zacisk hemostatyczny</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zębate</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Filtry jednorazowe</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu Potas (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>Maszynki do golenia (0,22 mm (0,009"))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Żywa/martwa plama</td><td></td><td></td><td>Czerwona plama żywotności (w <silny>Rysunek 1A</mocny>)</td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Otyłość sprzyja przewlekłemu stanowi zapalnemu, w którym pośredniczą głównie makrofagi rezydujące w tkankach, jak również makrofagi pochodzące z monocytów. Otyłość indukowana dietą (DIO) jest cennym modelem w badaniu roli heterogeniczności makrofagów; Jednak odpowiednie izolacje makrofagów są trudne do uzyskania z tkanek objętych stanem zapalnym. W tym protokole przedstawiamy etapy izolacji i niezbędne wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów wynikające z naszych badań w celu uzyskania odpowiedniej populacji makrofagów rezydujących w tkankach od myszy po 18 tygodniach interwencji na diecie wysokotłuszczowej (HFD) lub wysokotłuszczowej/wysokocholesterolowej (HFHCD). Protokół ten koncentruje się na trzech charakterystycznych tkankach badanych w otyłości i miażdżycy, w tym wątrobie, białej tkance tłuszczowej (WAT) i aorcie. Podkreślamy, w jaki sposób dualistyczne zastosowanie cytometrii przepływowej może osiągnąć nowy wymiar izolacji i charakterystyki makrofagów rezydujących w tkankach. Podstawowa sekcja tego protokołu dotyczy zawiłości leżących u podstaw trawienia enzymatycznego specyficznego dla tkanek i izolacji makrofagów, a następnie barwienia przeciwciał na powierzchni komórki do analizy cytometrii przepływowej. Protokół ten odnosi się do istniejących złożoności leżących u podstaw sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) i przedstawia wyjaśnienia dotyczące tych zawiłości, aby uzyskać szeroki zakres charakterystyki z odpowiednio posortowanych populacji komórek. Alternatywne metody wzbogacania są dostępne do sortowania komórek, takich jak gęsta wątroba, co pozwala na elastyczność i zarządzanie czasem podczas pracy z FACS. Krótko mówiąc, protokół ten pomaga badaczowi w ocenie niejednorodności makrofagów z wielu tkanek objętych stanem zapalnym w danym badaniu i dostarcza wnikliwych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, które okazały się skuteczne w korzystnej izolacji komórkowej i charakterystyce komórek odpornościowych w zapaleniu za pośrednictwem DIO.

W przypadku użycia myszy C57BL/6 (BL6) z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE KO), utrzymywanych przez 18 tygodni na diecie bogatej w tłuszcze i cholesterol (HCHFD lub HCD), można wyizolować od 1 x 104 do 2 x 104 makrofagów aortalnych CD45+F4/80+ po połączeniu dwóch próbek. Wątroby pobrane od myszy ApoE KO karmionych dietą HFHCD dostarczyły więcej niż 5 x 105 posortowanych komórek Kupffera (liczba ta zależy od dostępnego czasu sortowan...

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest skuteczne wyizolowanie i charakterystyka makrofagów z tkanek często dotkniętych stanem zapalnym wywołanym dietą, takich jak wątroba. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i stanów zapalnych dotyczące tego, w jaki sposób fenotyp makrofagów rezydentnych w tkankach może wpływać na progresję przewlekłych chorób zapalnych. Główną zaletą tego podejścia jest optymalizacja etapów izolacji niezbędnych do uzyskania zawiesin pojedynczych komórek pochodzących z tkanek objętych niskostopniowym przewlekłym stanem zapalnym indukowanym otyłością.Procedurę zaprezentuje Joselyn Allen, doktorantka z mojego laboratorium. Aby wyizolować wątrobę, należy najpierw umieścić mysz nasączoną etanolem w pozycji grzbietowej na styropianowej desce sekcyjnej i unieruchomić przednie oraz tylne łapy. Następnie, używając pęsety z końcówką średniej ostrości, należy chwycić skórę brzucha w pobliżu otworu cewki moczowej i za pomocą ostrych nożyczek sekcyjnych wykonać małe nacięcie w uniesionej skórze.Wprowadź dolne ostrze nożyczek w nacięcie między skórą a otrzewną i wykonaj nacięcie boczne od pachwiny do podbródka. Delikatnie odsunie skórę, aby odsłonić nienaruszoną jamę otrzewną oraz ścianę klatki piersiowej, a następnie wykonaj nacięcie boczne przez otrzewną. Unieś mostek i ostrożnie nacinaj przeponę.Następnie odsunąć organy przewodu pokarmowego na bok i zlokalizować żyłę główną dolną (IVC) poniżej wątroby. Za pomocą kleszczyków hemostatycznych zacisnąć IVC powyżej wątroby, aby utrzymać zlokalizowaną perfuzję, a następnie podłączyć strzykawkę wypełnioną uprzednio ogrzanym buforem perfuzyjnym do zestawu do pobierania i infuzji krwi z igłą 23 G.Prawidłowa kanulacja IVC zapewnia lokalny rozprzestrzenianie się buforu dysocjacyjnego w całej wątrobie i tkankach obwodowych, co optymalizuje trawienie tkanki. Należy użyć czterocentymetrowego zacisku hemostatycznego, aby unieruchomić igłę, a następnie delikatnie nacisnąć tłok, aby rozpocząć perfuzję. Jeśli igła jest odpowiednio umieszczona, kolor wątroby szybko zniknie, a jej płaty powiększą się.Niezwłocznie przetnij żyłę wrotną, aby umożliwić swobodny przepływ buforu perfuzyjnego przez wątrobę, okresowo delikatnie masując płaty kciukiem i palcem wskazującym w celu ułatwienia usuwania krwi. Gdy pozostanie jedynie 5 mL buforu perfuzyjnego, wymień strzykawkę z buforem perfuzyjnym na strzykawkę wypełnioną podgrzanym buforem do dysocjacji, kontynuując delikatne masowanie płatów i perfuzję wątroby aż do jej całkowitego strawienia. Prawidłowość strawienia potwierdź, delikatnie dociskając tępy koniec pęsety do lewego płata bocznego.Na powierzchni powinno pojawić się wgłębienie, które powoli wypełnia się po usunięciu pęsety. Następnie należy usunąć igłę i za pomocą krótkiego prostego ostrza nożyczek sekcyjnych ostrożnie przeciąć więzadła łączące, aby wyciąć całą wątrobę wraz z pęcherzykiem żółciowym. Wątrobę należy przenieść do naczynia o średnicy 10 centymetrów zawierającego 10 mililitrów lodowatego DMEM, a następnie za pomocą pęsety z ząbkami uchwycić przeciętą część nadwątrobową IVC.Używając pęsety o średnim czubku, wykonaj szybkie ruchy pocierające każdy płat, aby uwolnić komórki z torebki Glissona, a następnie przelać nasycony DMEM przez sitko komórkowe 70 µm do probówki stożkowej 50 mL umieszczonej w lodzie. Wysoka wydajność żywych komórek jest możliwa do osiągnięcia jedynie poprzez prawidłową dysocjację komórek wątroby z torebki Glissona. Po zebraniu wszystkich komórek odwróć probówkę, aby delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, a następnie odwirować komórki w celu uzyskania osadu.Przenieś nadsącz do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów i przeprowadź kolejne trzy wirowania z niską prędkością. Po ostatnim wirowaniu przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj komórki jeszcze raz przy wyższej prędkości. Następnie resuspenduj osad komórek nieparenchymalnych w buforze FACS w celu ich policzenia, a następnie rozcieńcz komórki wątroby do odpowiedniego stężenia, zależnie od planowanego zastosowania, w oznakowanych probówkach polistyrenowych o dnie okrągłym o pojemności pięciu mililitrów.Myszy karmione dietą wysokotłuszczową lub dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową wykazują zwiększoną infiltrację klasycznie aktywowanych makrofagów M1 w dotkniętych tkankach, takich jak aorta. Liczba wykazujących fenotyp przeciwzapalny makrofagów aortalnych CD45-dodatnich F4/80-dodatnich wykazujących ekspresję receptora RON jest zmniejszona u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową, podczas gdy w aortach izolowanych od tych zwierząt stwierdza się zwiększoną liczbę prozapalnych makrofagów CD45-dodatnich F4/80-dodatnich CD11c-dodatnich. Co więcej, wyizolowane metodą sortowania makrofagi wykazujące ekspresję receptora RON, pochodzące z trawionych aort, wykazują zwiększoną ekspresję genu Arginazy 1, będącej uznanym markerem makrofagów M2.Rzeczywiście, charakterystyka makrofagów rezydujących w wątrobie ujawnia przeważający fenotyp subpopulacji wykazujących ekspresję receptora RON wraz z populacjami makrofagów prozapalnych CD11c-dodatnich, które wykazują obniżoną ekspresję genów silnie związanych z przeciwzapalnym fenotypem M2. Podobne trendy obserwuje się w populacjach makrofagów wyizolowanych z trawionej białej tkanki tłuszczowej, gdzie populacje makrofagów o fenotypie prozapalnym wykazują obniżoną ekspresję powierzchniową receptora RON. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w czasie od 20 do 30 minut na zwierzę.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak cytometria przepłyewowa, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i/lub ilościowy PCR, aby dalej scharakteryzować fenotyp wyizolowanych makrofagów tkankowych pochodzących z wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo izolować makrofagi tkankowe z chorych wątrób. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Tkanka tłuszczowa (AT) to miejsce intensywnej aktywacji i interakcji komórek odpornościowych.  Prawie wszystkie komórki układu odpornościowego są obecne w AT, a ich proporcje są zmieniane przez otyłość.  Właściwa izolacja, kwantyfikacja i charakterystyka populacji komórek odpornościowych AT mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w chorobie immunometabolicznej.

Izolacja komórek odpornościowych tkanki tłuszczowej

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Ten artykuł opisuje metodę analizy zawartości komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej poprzez izolację komórek odpornościowych z tkanki tłuszczowej i późniejszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej.

Charakterystyka komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej człowieka za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością. Protokół optymalizuje uzyskiwanie zawiesin jednokomórkowych z wątroby do badań immunologicznych.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Przeglądaj więcej filmów