Przegląd ekspresji genów
Ekspresja genów to proces, w którym informacje zawarte w DNA komórki są wykorzystywane do wytwarzania funkcjonalnych produktów. Ta starannie zaplanowana procedura jest regulowana na kilku etapach, a nieprawidłowa regulacja może często prowadzić do chorób, takich jak rak.
Ten film zawiera przegląd historii badań nad ekspresją genów, kluczowe pytania, metody w tej dziedzinie oraz sposób stosowania tych technik.
Zaczniemy od przeglądu kilku ważnych odkryć dotyczących ekspresji genów.
Pierwszy przekonujący model tego, w jaki sposób DNA może przenosić informację genetyczną, powstał w 1953 roku, kiedy Francis Crick i James Watson, z pomocą danych Rosalind Franklin, rozwiązali strukturę DNA – podwójnej helisy zbudowanej z dwóch liniowych łańcuchów zasad nukleotydowych, które są ułożone w określoną, ale nieskończenie zmienną sekwencję.
Pięć lat później Crick zaproponował dwie ważne idee, które stanowiły podstawę naszego zrozumienia ekspresji genów. Jego "hipoteza sekwencji" sugerowała, że sekwencja nukleotydowa DNA jest używana, za pośrednictwem niestabilnego produktu pośredniego RNA, jako kod dla sekwencji aminokwasowych białek. W tym samym czasie jego "główny dogmat" wysunął hipotezę o różnych przepływach informacji genetycznej, które mogą wystąpić, a w szczególności utrzymywał, że informacja nie może być przenoszona z białka z powrotem do kwasów nukleinowych.
W 1960 roku François Jacob i Jacques Monod – dzięki swojej pracy nad genami metabolizującymi laktozę u bakterii – zaproponowali model regulacji ekspresji genów. Zasugerowali, że ekspresja "genów strukturalnych", które pełnią funkcje strukturalne lub enzymatyczne, jest kontrolowana przez produkty "genów regulatorowych", które wiążą się z sąsiednimi miejscami regulatorowymi. Obecnie wiemy, że zasadniczo podobne sposoby regulacji genów, w których pośredniczą białka zwane czynnikami transkrypcyjnymi, występują we wszystkich organizmach.
Rok później, w 1961 roku, Jacob – wraz z Sydney Brenner – odkrył posłańca lub "m"-RNA jako niestabilny produkt pośredni między DNA a białkami zaproponowany przez Cricka. W tym samym roku Brenner i Crick zaczęli łamać "kod genetyczny", który określa, w jaki sposób informacja w DNA koduje białka. Ustalili, że każda tryplet sąsiadujących ze sobą nukleotydów, czyli "kodon", określa jeden z 20 aminokwasów tworzących białka.
W ciągu następnych kilku lat naukowcy kierowani przez Marshalla Nirenberga, Har Gobinda Khorana i Severo Ochoa zastosowali wiele podejść do zdefiniowania aminokwasów kodowanych przez wszystkie 64 możliwe kodony. Wraz ze złamaniem kodu genetycznego naukowcy kontynuowali badania, w jaki sposób ekspresja genów jest regulowana.
Wielkie odkrycie miało miejsce w 1974 roku, kiedy Roger Kornberg i współpracownicy wykazali, że DNA w komórkach eukariotycznych, takich jak komórki zwierząt i roślin, jest "owinięte" wokół kompleksów białek histonowych, tworząc struktury zwane obecnie "nukleosomami". Teraz wiemy, że zmiany w strukturze chromatyny odgrywają ważną rolę w regulacji genów.
Kolejny zwrot nastąpił w 1977 roku, kiedy Phil Sharp i Rich Roberts odkryli, że sekwencje mRNA nie są całkowicie komplementarne z odpowiadającymi im matrycami DNA. Pewne "brakujące regiony", zwane obecnie intronami, są usuwane spomiędzy egzonów kodujących białka w dojrzałym transkryptie RNA w procesie znanym jako "splicing". Pięć lat później grupa badawcza Ronalda Evansa wykazała, że "alternatywny" splicing tego samego transkryptu może wytworzyć warianty lub "izoformy" tego samego białka o różnych funkcjach.
Od lat dziewięćdziesiątych XX wieku nasza wiedza na temat złożoności sieci regulacyjnych genów znacznie się poszerzyła wraz z odkryciem wyciszania genów za pośrednictwem RNA. Obecnie wiemy, że kilka różnych rodzin małych RNA, których członkowie mają wielkość 20-30 nukleotydów, reguluje ekspresję genów na różne sposoby.
Po zapoznaniu się z historią badań nad ekspresją genów, przyjrzyjmy się kilku głównym pytaniom w tej dziedzinie.
Jednym z badanych tematów jest to, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne regulują geny. Naukowcy są zainteresowani nie tylko identyfikacją sekwencji genomowych związanych przez czynniki transkrypcyjne, ale także przyglądają się, w jaki sposób białka regulatorowe oddziałują ze sobą w celu integracji sygnałów i regulacji ekspresji genów.
Inni badacze badają alternatywne splicing i sposób, w jaki proces ten jest regulowany w różnych kontekstach biologicznych. Ponadto niektórzy z nich próbują ustalić, czy izoformy białek zawsze pełnią różne, odrębne funkcje.
Wreszcie, wielu badaczy bada mechanizm działania małych RNA i próbuje zidentyfikować ich cele regulacyjne. Rośnie również zainteresowanie tym, czy małe RNA mogą być wykorzystywane jako "biomarkery" do diagnozowania chorób.
Przyjrzyjmy się teraz narzędziom używanym przez naukowców do oceny ekspresji genów.
Popularną metodą jest odwrotna transkrypcja lub "RT"-PCR, która przekształca RNA w komplementarne lub "c"-DNA przed poddaniem go amplifikacji. Uwzględniając cząsteczki fluorescencyjne, które są włączane do DNA podczas PCR, możliwe jest użycie tej techniki do ilościowego pomiaru ekspresji genów i obserwowania wyników w "czasie rzeczywistym."
Do jednoczesnej oceny ekspresji tysięcy genów można użyć mikromacierzy. Tutaj sekwencje DNA są "drukowane" na szkiełkach, które są następnie hybrydyzowane z sondami fluorescencyjnymi wygenerowanymi z próbki RNA. Uzyskany w ten sposób wzór fluorescencji można wykorzystać do identyfikacji ekspresji genów.
Inną techniką profilowania ekspresji genów jest sekwencjonowanie transkryptomu lub wszystkich wyrażonych RNA w komórce. W tym przypadku cDNA generowane z próbek RNA poddawane jest sekwencjonowaniu wysokoprzepustowemu. W przeciwieństwie do mikromacierzy, sekwencjonowanie transkryptomu nie wymaga wcześniej istniejących informacji genomowych i może być wykorzystywane do identyfikacji nieznanych transkryptów lub nowych izoform genów.
Naukowcy mogą również wizualnie ocenić, gdzie gen ulega ekspresji, korzystając z hybrydyzacji in situ. W tej technice RNA jest najpierw hybrydyzowane z komplementarnymi sondami, które można następnie rozpoznać za pomocą przeciwciał sprzężonych z enzymami, które wytwarzają wizualny sygnał koloru lub fluorescencji.
Test reporterowy to kolejna technika, która może zapewnić wgląd w regulację genów. Produkt genu reporterowego generuje sygnał, taki jak kolor lub fluorescencja. Reporter może być połączony bezpośrednio z genem będącym przedmiotem zainteresowania lub zostać umieszczony pod kontrolą sekwencji regulatorowej, takiej jak promotor, który napędza transkrypcję genu, lub bardziej odległy element wzmacniający. Sygnał reporterowy może następnie działać jako odczyt aktywności elementu regulatorowego lub wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Wreszcie, immunoprecypitacja chromatyny lub "ChIP" może być wykorzystana do identyfikacji miejsc genomowych, z którymi wiążą się czynniki transkrypcyjne podczas regulacji ekspresji genów. W tym przypadku kompleksy białek i wiązane przez nie DNA są izolowane przez przeciwciała, a docelowe DNA jest identyfikowane przez PCR lub sekwencjonowanie.
Po zapoznaniu się z metodami badania ekspresji genów, przyjrzyjmy się niektórym z ich zastosowań.
Komórki w populacji mogą wykazywać subtelne różnice w ekspresji genów, które mogą mieć konsekwencje biologiczne. W tym badaniu naukowcy umieścili pojedyncze ludzkie embrionalne komórki macierzyste z tej samej kultury w oddzielnych studzienkach na talerzu. Korzystając z ilościowego RT-PCR, naukowcy ustalili, że ekspresja Nanog – "markera" komórek macierzystych – różniła się w próbce.
Niektórzy badacze badają, czy różne izoformy białek regulatorowych działają inaczej. W tym przypadku ChIP zastosowano do ludzkich komórek odpornościowych w celu zidentyfikowania celów wiązania "długich" i "krótkich" izoform białka. Wyniki sekwencjonowania wykazały, że niektóre cele genów były rozpoznawane tylko przez krótką izoformę, co wskazuje na potencjalne różnice funkcjonalne.
Wreszcie, testy reporterowe można wykorzystać do oceny regulacji genów, w której pośredniczą małe RNA, takie jak mikroRNA. Ponieważ mikroRNA mogą hamować ekspresję genów poprzez wiązanie się z nieulegającymi translacji regionami mRNA o sile 3¢, naukowcy przyłączyli ten region z różnych genów do reportera lucyferazy i wprowadzili każdy z nich do komórek wraz z mikroRNA. Cele genowe mikroRNA zostały następnie zidentyfikowane, szukając komórek o zmniejszonym sygnale luminescencji.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ekspresji genów. Dokonaliśmy przeglądu głównych osiągnięć w badaniach nad ekspresją genów, ważnych pytań i metod w tej dziedzinie oraz niektórych obecnych zastosowań. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Ekspresja genów to złożony proces, w którym komórka wykorzystuje swoją informację genetyczną do wytwarzania funkcjonalnych produktów. Proces ten jest…
Ekspresja genów to proces, w którym informacje zawarte w DNA komórki są wykorzystywane do wytwarzania funkcjonalnych produktów. Ta starannie zaplanowana procedura jest regulowana na kilku etapach, a nieprawidłowa regulacja może często prowadzić do chorób, takich jak rak.
Ten film zawiera przegląd historii badań nad ekspresją genów, kluczowe pytania, metody w tej dziedzinie oraz sposób stosowania tych technik.
Zaczniemy od przeglądu kilku ważnych odkryć dotyczących ekspresji genów.
Pierwszy przekonujący model tego, w jaki sposób DNA może przenosić informację genetyczną, powstał w 1953 roku, kiedy Francis Crick i James Watson, z pomocą danych Rosalind Franklin, rozwiązali strukturę DNA – podwójnej helisy zbudowanej z dwóch liniowych łańcuchów zasad nukleotydowych, które są ułożone w określoną, ale nieskończenie zmienną sekwencję.
Pięć lat później Crick zaproponował dwie ważne idee, które stanowiły podstawę naszego zrozumienia ekspresji genów. Jego "hipoteza sekwencji" sugerowała, że sekwencja nukleotydowa DNA jest używana, za pośrednictwem niestabilnego produktu pośredniego RNA, jako kod dla sekwencji aminokwasowych białek. W tym samym czasie jego "główny dogmat" wysunął hipotezę o różnych przepływach informacji genetycznej, które mogą wystąpić, a w szczególności utrzymywał, że informacja nie może być przenoszona z białka z powrotem do kwasów nukleinowych.
W 1960 roku François Jacob i Jacques Monod – dzięki swojej pracy nad genami metabolizującymi laktozę u bakterii – zaproponowali model regulacji ekspresji genów. Zasugerowali, że ekspresja "genów strukturalnych", które pełnią funkcje strukturalne lub enzymatyczne, jest kontrolowana przez produkty "genów regulatorowych", które wiążą się z sąsiednimi miejscami regulatorowymi. Obecnie wiemy, że zasadniczo podobne sposoby regulacji genów, w których pośredniczą białka zwane czynnikami transkrypcyjnymi, występują we wszystkich organizmach.
Rok później, w 1961 roku, Jacob – wraz z Sydney Brenner – odkrył posłańca lub "m"-RNA jako niestabilny produkt pośredni między DNA a białkami zaproponowany przez Cricka. W tym samym roku Brenner i Crick zaczęli łamać "kod genetyczny", który określa, w jaki sposób informacja w DNA koduje białka. Ustalili, że każda tryplet sąsiadujących ze sobą nukleotydów, czyli "kodon", określa jeden z 20 aminokwasów tworzących białka.
W ciągu następnych kilku lat naukowcy kierowani przez Marshalla Nirenberga, Har Gobinda Khorana i Severo Ochoa zastosowali wiele podejść do zdefiniowania aminokwasów kodowanych przez wszystkie 64 możliwe kodony. Wraz ze złamaniem kodu genetycznego naukowcy kontynuowali badania, w jaki sposób ekspresja genów jest regulowana.
Wielkie odkrycie miało miejsce w 1974 roku, kiedy Roger Kornberg i współpracownicy wykazali, że DNA w komórkach eukariotycznych, takich jak komórki zwierząt i roślin, jest "owinięte" wokół kompleksów białek histonowych, tworząc struktury zwane obecnie "nukleosomami". Teraz wiemy, że zmiany w strukturze chromatyny odgrywają ważną rolę w regulacji genów.
Kolejny zwrot nastąpił w 1977 roku, kiedy Phil Sharp i Rich Roberts odkryli, że sekwencje mRNA nie są całkowicie komplementarne z odpowiadającymi im matrycami DNA. Pewne "brakujące regiony", zwane obecnie intronami, są usuwane spomiędzy egzonów kodujących białka w dojrzałym transkryptie RNA w procesie znanym jako "splicing". Pięć lat później grupa badawcza Ronalda Evansa wykazała, że "alternatywny" splicing tego samego transkryptu może wytworzyć warianty lub "izoformy" tego samego białka o różnych funkcjach.
Od lat dziewięćdziesiątych XX wieku nasza wiedza na temat złożoności sieci regulacyjnych genów znacznie się poszerzyła wraz z odkryciem wyciszania genów za pośrednictwem RNA. Obecnie wiemy, że kilka różnych rodzin małych RNA, których członkowie mają wielkość 20-30 nukleotydów, reguluje ekspresję genów na różne sposoby.
Po zapoznaniu się z historią badań nad ekspresją genów, przyjrzyjmy się kilku głównym pytaniom w tej dziedzinie.
Jednym z badanych tematów jest to, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne regulują geny. Naukowcy są zainteresowani nie tylko identyfikacją sekwencji genomowych związanych przez czynniki transkrypcyjne, ale także przyglądają się, w jaki sposób białka regulatorowe oddziałują ze sobą w celu integracji sygnałów i regulacji ekspresji genów.
Inni badacze badają alternatywne splicing i sposób, w jaki proces ten jest regulowany w różnych kontekstach biologicznych. Ponadto niektórzy z nich próbują ustalić, czy izoformy białek zawsze pełnią różne, odrębne funkcje.
Wreszcie, wielu badaczy bada mechanizm działania małych RNA i próbuje zidentyfikować ich cele regulacyjne. Rośnie również zainteresowanie tym, czy małe RNA mogą być wykorzystywane jako "biomarkery" do diagnozowania chorób.
Przyjrzyjmy się teraz narzędziom używanym przez naukowców do oceny ekspresji genów.
Popularną metodą jest odwrotna transkrypcja lub "RT"-PCR, która przekształca RNA w komplementarne lub "c"-DNA przed poddaniem go amplifikacji. Uwzględniając cząsteczki fluorescencyjne, które są włączane do DNA podczas PCR, możliwe jest użycie tej techniki do ilościowego pomiaru ekspresji genów i obserwowania wyników w "czasie rzeczywistym."
Do jednoczesnej oceny ekspresji tysięcy genów można użyć mikromacierzy. Tutaj sekwencje DNA są "drukowane" na szkiełkach, które są następnie hybrydyzowane z sondami fluorescencyjnymi wygenerowanymi z próbki RNA. Uzyskany w ten sposób wzór fluorescencji można wykorzystać do identyfikacji ekspresji genów.
Inną techniką profilowania ekspresji genów jest sekwencjonowanie transkryptomu lub wszystkich wyrażonych RNA w komórce. W tym przypadku cDNA generowane z próbek RNA poddawane jest sekwencjonowaniu wysokoprzepustowemu. W przeciwieństwie do mikromacierzy, sekwencjonowanie transkryptomu nie wymaga wcześniej istniejących informacji genomowych i może być wykorzystywane do identyfikacji nieznanych transkryptów lub nowych izoform genów.
Naukowcy mogą również wizualnie ocenić, gdzie gen ulega ekspresji, korzystając z hybrydyzacji in situ. W tej technice RNA jest najpierw hybrydyzowane z komplementarnymi sondami, które można następnie rozpoznać za pomocą przeciwciał sprzężonych z enzymami, które wytwarzają wizualny sygnał koloru lub fluorescencji.
Test reporterowy to kolejna technika, która może zapewnić wgląd w regulację genów. Produkt genu reporterowego generuje sygnał, taki jak kolor lub fluorescencja. Reporter może być połączony bezpośrednio z genem będącym przedmiotem zainteresowania lub zostać umieszczony pod kontrolą sekwencji regulatorowej, takiej jak promotor, który napędza transkrypcję genu, lub bardziej odległy element wzmacniający. Sygnał reporterowy może następnie działać jako odczyt aktywności elementu regulatorowego lub wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Wreszcie, immunoprecypitacja chromatyny lub "ChIP" może być wykorzystana do identyfikacji miejsc genomowych, z którymi wiążą się czynniki transkrypcyjne podczas regulacji ekspresji genów. W tym przypadku kompleksy białek i wiązane przez nie DNA są izolowane przez przeciwciała, a docelowe DNA jest identyfikowane przez PCR lub sekwencjonowanie.
Po zapoznaniu się z metodami badania ekspresji genów, przyjrzyjmy się niektórym z ich zastosowań.
Komórki w populacji mogą wykazywać subtelne różnice w ekspresji genów, które mogą mieć konsekwencje biologiczne. W tym badaniu naukowcy umieścili pojedyncze ludzkie embrionalne komórki macierzyste z tej samej kultury w oddzielnych studzienkach na talerzu. Korzystając z ilościowego RT-PCR, naukowcy ustalili, że ekspresja Nanog – "markera" komórek macierzystych – różniła się w próbce.
Niektórzy badacze badają, czy różne izoformy białek regulatorowych działają inaczej. W tym przypadku ChIP zastosowano do ludzkich komórek odpornościowych w celu zidentyfikowania celów wiązania "długich" i "krótkich" izoform białka. Wyniki sekwencjonowania wykazały, że niektóre cele genów były rozpoznawane tylko przez krótką izoformę, co wskazuje na potencjalne różnice funkcjonalne.
Wreszcie, testy reporterowe można wykorzystać do oceny regulacji genów, w której pośredniczą małe RNA, takie jak mikroRNA. Ponieważ mikroRNA mogą hamować ekspresję genów poprzez wiązanie się z nieulegającymi translacji regionami mRNA o sile 3¢, naukowcy przyłączyli ten region z różnych genów do reportera lucyferazy i wprowadzili każdy z nich do komórek wraz z mikroRNA. Cele genowe mikroRNA zostały następnie zidentyfikowane, szukając komórek o zmniejszonym sygnale luminescencji.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ekspresji genów. Dokonaliśmy przeglądu głównych osiągnięć w badaniach nad ekspresją genów, ważnych pytań i metod w tej dziedzinie oraz niektórych obecnych zastosowań. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Ekspresja genów to proces, w którym informacje zawarte w DNA komórki są wykorzystywane do wytwarzania funkcjonalnych produktów. Ta starannie zaplanowana procedura jest regulowana na kilku etapach, a nieprawidłowa regulacja może często prowadzić do chorób, takich jak rak.
Ten film zawiera przegląd historii badań nad ekspresją genów, kluczowe pytania, metody w tej dziedzinie oraz sposób stosowania tych technik.
Zaczniemy od przeglądu kilku ważnych odkryć dotyczących ekspresji genów.
Pierwszy przekonujący model tego, w jaki sposób DNA może przenosić informację genetyczną, powstał w 1953 roku, kiedy Francis Crick i James Watson, z pomocą danych Rosalind Franklin, rozwiązali strukturę DNA – podwójnej helisy zbudowanej z dwóch liniowych łańcuchów zasad nukleotydowych, które są ułożone w określoną, ale nieskończenie zmienną sekwencję.
Pięć lat później Crick zaproponował dwie ważne idee, które stanowiły podstawę naszego zrozumienia ekspresji genów. Jego "hipoteza sekwencji" sugerowała, że sekwencja nukleotydowa DNA jest używana, za pośrednictwem niestabilnego produktu pośredniego RNA, jako kod dla sekwencji aminokwasowych białek. W tym samym czasie jego "główny dogmat" wysunął hipotezę o różnych przepływach informacji genetycznej, które mogą wystąpić, a w szczególności utrzymywał, że informacja nie może być przenoszona z białka z powrotem do kwasów nukleinowych.
W 1960 roku François Jacob i Jacques Monod – dzięki swojej pracy nad genami metabolizującymi laktozę u bakterii – zaproponowali model regulacji ekspresji genów. Zasugerowali, że ekspresja "genów strukturalnych", które pełnią funkcje strukturalne lub enzymatyczne, jest kontrolowana przez produkty "genów regulatorowych", które wiążą się z sąsiednimi miejscami regulatorowymi. Obecnie wiemy, że zasadniczo podobne sposoby regulacji genów, w których pośredniczą białka zwane czynnikami transkrypcyjnymi, występują we wszystkich organizmach.
Rok później, w 1961 roku, Jacob – wraz z Sydney Brenner – odkrył posłańca lub "m"-RNA jako niestabilny produkt pośredni między DNA a białkami zaproponowany przez Cricka. W tym samym roku Brenner i Crick zaczęli łamać "kod genetyczny", który określa, w jaki sposób informacja w DNA koduje białka. Ustalili, że każda tryplet sąsiadujących ze sobą nukleotydów, czyli "kodon", określa jeden z 20 aminokwasów tworzących białka.
W ciągu następnych kilku lat naukowcy kierowani przez Marshalla Nirenberga, Har Gobinda Khorana i Severo Ochoa zastosowali wiele podejść do zdefiniowania aminokwasów kodowanych przez wszystkie 64 możliwe kodony. Wraz ze złamaniem kodu genetycznego naukowcy kontynuowali badania, w jaki sposób ekspresja genów jest regulowana.
Wielkie odkrycie miało miejsce w 1974 roku, kiedy Roger Kornberg i współpracownicy wykazali, że DNA w komórkach eukariotycznych, takich jak komórki zwierząt i roślin, jest "owinięte" wokół kompleksów białek histonowych, tworząc struktury zwane obecnie "nukleosomami". Teraz wiemy, że zmiany w strukturze chromatyny odgrywają ważną rolę w regulacji genów.
Kolejny zwrot nastąpił w 1977 roku, kiedy Phil Sharp i Rich Roberts odkryli, że sekwencje mRNA nie są całkowicie komplementarne z odpowiadającymi im matrycami DNA. Pewne "brakujące regiony", zwane obecnie intronami, są usuwane spomiędzy egzonów kodujących białka w dojrzałym transkryptie RNA w procesie znanym jako "splicing". Pięć lat później grupa badawcza Ronalda Evansa wykazała, że "alternatywny" splicing tego samego transkryptu może wytworzyć warianty lub "izoformy" tego samego białka o różnych funkcjach.
Od lat dziewięćdziesiątych XX wieku nasza wiedza na temat złożoności sieci regulacyjnych genów znacznie się poszerzyła wraz z odkryciem wyciszania genów za pośrednictwem RNA. Obecnie wiemy, że kilka różnych rodzin małych RNA, których członkowie mają wielkość 20-30 nukleotydów, reguluje ekspresję genów na różne sposoby.
Po zapoznaniu się z historią badań nad ekspresją genów, przyjrzyjmy się kilku głównym pytaniom w tej dziedzinie.
Jednym z badanych tematów jest to, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne regulują geny. Naukowcy są zainteresowani nie tylko identyfikacją sekwencji genomowych związanych przez czynniki transkrypcyjne, ale także przyglądają się, w jaki sposób białka regulatorowe oddziałują ze sobą w celu integracji sygnałów i regulacji ekspresji genów.
Inni badacze badają alternatywne splicing i sposób, w jaki proces ten jest regulowany w różnych kontekstach biologicznych. Ponadto niektórzy z nich próbują ustalić, czy izoformy białek zawsze pełnią różne, odrębne funkcje.
Wreszcie, wielu badaczy bada mechanizm działania małych RNA i próbuje zidentyfikować ich cele regulacyjne. Rośnie również zainteresowanie tym, czy małe RNA mogą być wykorzystywane jako "biomarkery" do diagnozowania chorób.
Przyjrzyjmy się teraz narzędziom używanym przez naukowców do oceny ekspresji genów.
Popularną metodą jest odwrotna transkrypcja lub "RT"-PCR, która przekształca RNA w komplementarne lub "c"-DNA przed poddaniem go amplifikacji. Uwzględniając cząsteczki fluorescencyjne, które są włączane do DNA podczas PCR, możliwe jest użycie tej techniki do ilościowego pomiaru ekspresji genów i obserwowania wyników w "czasie rzeczywistym."
Do jednoczesnej oceny ekspresji tysięcy genów można użyć mikromacierzy. Tutaj sekwencje DNA są "drukowane" na szkiełkach, które są następnie hybrydyzowane z sondami fluorescencyjnymi wygenerowanymi z próbki RNA. Uzyskany w ten sposób wzór fluorescencji można wykorzystać do identyfikacji ekspresji genów.
Inną techniką profilowania ekspresji genów jest sekwencjonowanie transkryptomu lub wszystkich wyrażonych RNA w komórce. W tym przypadku cDNA generowane z próbek RNA poddawane jest sekwencjonowaniu wysokoprzepustowemu. W przeciwieństwie do mikromacierzy, sekwencjonowanie transkryptomu nie wymaga wcześniej istniejących informacji genomowych i może być wykorzystywane do identyfikacji nieznanych transkryptów lub nowych izoform genów.
Naukowcy mogą również wizualnie ocenić, gdzie gen ulega ekspresji, korzystając z hybrydyzacji in situ. W tej technice RNA jest najpierw hybrydyzowane z komplementarnymi sondami, które można następnie rozpoznać za pomocą przeciwciał sprzężonych z enzymami, które wytwarzają wizualny sygnał koloru lub fluorescencji.
Test reporterowy to kolejna technika, która może zapewnić wgląd w regulację genów. Produkt genu reporterowego generuje sygnał, taki jak kolor lub fluorescencja. Reporter może być połączony bezpośrednio z genem będącym przedmiotem zainteresowania lub zostać umieszczony pod kontrolą sekwencji regulatorowej, takiej jak promotor, który napędza transkrypcję genu, lub bardziej odległy element wzmacniający. Sygnał reporterowy może następnie działać jako odczyt aktywności elementu regulatorowego lub wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Wreszcie, immunoprecypitacja chromatyny lub "ChIP" może być wykorzystana do identyfikacji miejsc genomowych, z którymi wiążą się czynniki transkrypcyjne podczas regulacji ekspresji genów. W tym przypadku kompleksy białek i wiązane przez nie DNA są izolowane przez przeciwciała, a docelowe DNA jest identyfikowane przez PCR lub sekwencjonowanie.
Po zapoznaniu się z metodami badania ekspresji genów, przyjrzyjmy się niektórym z ich zastosowań.
Komórki w populacji mogą wykazywać subtelne różnice w ekspresji genów, które mogą mieć konsekwencje biologiczne. W tym badaniu naukowcy umieścili pojedyncze ludzkie embrionalne komórki macierzyste z tej samej kultury w oddzielnych studzienkach na talerzu. Korzystając z ilościowego RT-PCR, naukowcy ustalili, że ekspresja Nanog – "markera" komórek macierzystych – różniła się w próbce.
Niektórzy badacze badają, czy różne izoformy białek regulatorowych działają inaczej. W tym przypadku ChIP zastosowano do ludzkich komórek odpornościowych w celu zidentyfikowania celów wiązania "długich" i "krótkich" izoform białka. Wyniki sekwencjonowania wykazały, że niektóre cele genów były rozpoznawane tylko przez krótką izoformę, co wskazuje na potencjalne różnice funkcjonalne.
Wreszcie, testy reporterowe można wykorzystać do oceny regulacji genów, w której pośredniczą małe RNA, takie jak mikroRNA. Ponieważ mikroRNA mogą hamować ekspresję genów poprzez wiązanie się z nieulegającymi translacji regionami mRNA o sile 3¢, naukowcy przyłączyli ten region z różnych genów do reportera lucyferazy i wprowadzili każdy z nich do komórek wraz z mikroRNA. Cele genowe mikroRNA zostały następnie zidentyfikowane, szukając komórek o zmniejszonym sygnale luminescencji.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ekspresji genów. Dokonaliśmy przeglądu głównych osiągnięć w badaniach nad ekspresją genów, ważnych pytań i metod w tej dziedzinie oraz niektórych obecnych zastosowań. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the central dogma of gene expression?
Francis Crick's central dogma hypothesizes the different flows of genetic information that can occur in cells. It holds that information cannot be transferred from protein back to nucleic acids. This principle, established in 1958, forms a backbone of understanding how genetic information flows from DNA through RNA to proteins, establishing the directional nature of genetic information transfer.
Q2: How do transcription factors regulate gene expression?
Transcription factors are regulatory proteins that bind to adjacent regulatory sites to control the expression of structural genes. Scientists investigate how these regulatory proteins interact with one another to integrate signals and regulate gene expression. Understanding transcription factor binding sites and protein interactions helps reveal mechanisms of gene regulation across all organisms.
Q3: What role do introns and exons play in gene expression?
Introns are non-coding sequences removed from RNA transcripts during splicing, while exons are protein-coding regions that remain in mature RNA. Alternative splicing of the same transcript can produce variants called isoforms with different functions. This process, discovered in 1977, adds complexity to how a single gene can generate multiple protein products.
Q4: How does reverse transcription PCR measure gene expression?
Reverse transcription PCR, or RT-PCR, converts RNA into complementary DNA before amplification. By including fluorescent molecules during PCR, researchers can quantitatively measure gene expression and observe results in real-time using detection and quantification of nucleic acids by real time pcr techniques. This method allows scientists to assess expression levels of specific genes in samples.
Q5: What advantages does transcriptome sequencing offer over microarrays?
Transcriptome sequencing sequences all expressed RNAs in a cell by subjecting cDNA to high-throughput sequencing. Unlike microarrays, this technique does not require preexisting genomic information and can identify unknown transcripts or novel gene isoforms. This flexibility makes transcriptome sequencing valuable for discovering new genes and variants.
Q6: How can chromatin immunoprecipitation identify gene regulation sites?
Chromatin immunoprecipitation, or ChIP, isolates protein-DNA complexes using antibodies and identifies target DNA by PCR or sequencing. This technique reveals genomic sites where transcription factors bind when regulating gene expression. ChIP has been applied to study functional differences between protein isoforms and their distinct gene targets.
Q7: How do small RNAs regulate gene expression?
Small RNAs, including families with members 20-30 nucleotides in size, regulate gene expression through multiple mechanisms. MicroRNAs can inhibit gene expression by binding to the 3' untranslated regions of mRNAs. Researchers investigate small RNA mechanisms and identify their regulatory targets to understand gene silencing and explore their potential as biomarkers for disease diagnosis.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:39
Historical Highlights
5:02
Key Questions
6:09
Prominent Methods
8:57
Applications
10:38
Summary