Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek, a ogólnym celem spektrometrii mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozdzielczą jest badanie szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej, takie jak krateryzacja przejściowych potwierdzeń białek, które nie są minimalne w stosunku do klasycznych technik wysokiej rozdzielczości, takich jak elektrocystografia i NMR. Główną zaletą tej techniki jest to, że reakcje mogą być monitorowane w milisekundowej skali czasowej, co jest ważne dla scharakteryzowania grzbietów pętlowych, Moltinglobyals i wewnętrznie nieuporządkowanych białek.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zaburzeń neurodegeneracyjnych. Ponieważ często wiążą się one z nieprawidłowym fałdowaniem lub agregacją wewnętrznie nieuporządkowanych regionów białkowych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w tygodniową strukturę białek, może być również stosowana do innych systemów, takich jak enzymy przechodzące obrót katalityczny lub charakterystyka interakcji białkowych, białkowych i białkowych, liganowych.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy za pomocą grawera laserowego przeciąć płytkę przez kanał wejściowy do wprowadzania odczynników, komorę prodializacyjną i kanał wyjściowy na standardowym bloku PMM8. Następnie pokrój metalową kapilę ze stali nierdzewnej o grubości 30 mm na dwa 10-centymetrowe kawałki za pomocą narzędzia obrotowego do odciętego dysku o grubości 164 cali. Użyj papieru ściernego, aby wygładzić koniec naczyń włosowatych, co można ułatwić, oglądając pod mikroskopem świetlnym.

Teraz rozpuść te naczynia włosowate w wytrawionym bloku PMM8 za pomocą żelazka. Aby skonstruować mieszalnik kinetyczny o ciągłym przepływie i rozdzielczości czasowej, włóż 40-centymetrową kapilarnę ze stopionego szkła cilica do stalowej, metalowej kapilary o grubości 28 centymetrów o grubości około 15 centymetrów. Następnie wykonaj dwumilimetrowe nacięcie, używając ustawień grawera laserowego o niskiej mocy na jednym końcu wewnętrznej szklanej kapilary i uszczelnij ten koniec wewnętrznej szklanej kapilary.

Jest to krytyczny krok, który zapewnia ortogonalne i wydajne mieszanie białka, które wychodzi przez wcięcie, które często ulega pogorszeniu. Dwumilimetrowa przestrzeń międzykapilarna między wcięciem a końcem kapilary to mieszanka i objętość. Zamocuj złączki o odpowiednim rozmiarze i tuleje rurek oraz dołącz złącze T, które będzie używane do dostarczania deterium.

Następnie wyrównaj wewnętrzną szklaną kapilarnę z końcem metalowej kapilary, co można ułatwić, oglądając pod mikroskopem świetlnym. Oznacz to jako pozycję zero milimetrów. Przymocuj ten mieszalnik kinetyczny do jednego końca mieszalnika T. Następnie przymocuj 40-centymetrową kapilarnę ze stopionego szkła krzemionkowego do przeciwległego końca mieszalnika kinetycznego na mieszalniku T. W celu aktywacji pepsyny zawiesić 20 miligramów pepsyny z błony śluzowej gazu Porsena w jednym mililitrze buforu sprzęgającego.

Dodaj 50 miligramów prędkości agro aktywowanych przez NHS do zawieszonych protienów i delikatnie obracaj przez noc, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwiruj mieszaninę w proporcji tysiąc razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę. Następnie odessać niezwiązane protiyes.

Następnie inkubuj agros w jednym mililitrze buforu blokującego i delikatnie obracaj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po zebraniu żywicy i zasysaniu buforu blokującego, inkubować aggury pepsyny z jednym mililitrem pięcioprocentowego kwasu octowego przez pięć minut. Odwiruj mieszaninę z prędkością 1000 razy G, przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę, a następnie odessać super natent.

Po powtórzeniu poprzednich kroków, w sumie przez trzy prania, przechowuj kulki w jednym mililitrze kwasu octowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego użytkowania. Aby zmontować urządzenie, należy napełnić komorę protializy zawiesiną aktywowanych kulek pepsyny aggures w pięcioprocentowym kwasie octowym za pomocą sterylnej szpatułki. Umieść platformę mikrofalityczną PMMA pomiędzy dwoma pustymi blokami PMMA jako osłonę do uszczelnienia urządzenia, wyłożoną gumą silikonową, aby uzyskać płynne uszczelnienie.

Użyj metalowych clamppłyty, aby uszczelnić ciśnieniowo urządzenie. Następnie przymocuj mieszalnik T do wlotu urządzenia za pomocą odpowiednich złączek. Teraz przepływa pięcioprocentowy kwas octowy, który przechodził przez linię kwasu w tempie dziesięciu mikrolitrów na minutę.

Następnie przepuść 50-milimetrowy bufor kwasu amonowego przez linię białkową z szybkością jednego mikrolitra na minutę. Sprzęgnij urządzenie z przednim końcem zmodyfikowanego, kwadrapolowego spektrometru czasu lotu lub spektrometru masowego Qtof, używając regulowanego izolowanego stopnia, aby uzyskać optymalne warunki rozpylania elektrycznego. Po ustawieniu warunków ESI-MS uzyskaj widmo tylko pepsyny.

Następnie wprowadź od 50 do 100 mikromoli białka tau lub fosfo-tau w tempie jednego mikrolitra na minutę, w miejscu, w którym wcześniej płynęł 50-milimetrowy bufor amonianu. Po pozostawieniu układu do zrównoważenia przez co najmniej 10 minut, przed akwizycją, uzyskaj widmo tylko białka. Podczas przepływu białka Tao, czyli fosfo tao, wprowadź tlenek duteru w tempie trzech mikrolitrów na minutę przez łącznik T i pozwól mu zareagować w mieszalniku kinetycznym.

Aby wydłużyć czas etykietowania, należy ręcznie cofnąć położenie wewnętrznej szklanej kapilary, aby uzyskać czas mieszania od 42 milisekund do ośmiu sekund, umożliwiając systemowi równowagę przez co najmniej 10 sekund między każdym cofnięciem. Ta animacja przedstawia przebieg pracy w typowym eksperymencie. Białko wydostaje się przez wgłębienie i miesza się z nadchodzącym duterium.

Wodory szkieletowe M8 są wymieniane w wyznaczonym czasie reakcji, który można zmieniać poprzez odciągnięcie kapilary białka. Reakcja jest następnie wygaszana, a następnie trawiona na platformie mikroprzepływowej zawierającej igłę wylotową ESI. Powstałe widmo zawiera strawione białko.

Procent wychwytu deuteru jest obliczany dla poszczególnych peptydów, a następnie odwzorowywany na strukturze białka 3D. Profile trawienia natywnego i fosfo-tau były podobne, dając pokrycie sekwencji odpowiednio 77,1 i 71,7 procent, najlepiej pasujące rozkłady izotopowe i związane z nimi wartości wychwytu deuteru dla czterech prostych peptydów pokazano tutaj. Obserwowany wykres kinetyczny procentowy wychwytu deuteru w funkcji czasu dla każdego peptydu jest używany do ekstrakcji obserwowanej szybkości eksperymentalnej.

Obliczone losowe profile jakości są pokazane w celach porównawczych i służą do wyodrębnienia teoretycznej oceny wewnętrznej. Zgodnie z oczekiwaniami w tym zakresie nie zaobserwowano żadnych czynników ochronnych, zwykle związanych z drugorzędowymi elementami struktury, co potwierdza, że natywne tau wykazuje słabe wewnętrzne wiązania wodorowe. Znaczną ochronę obserwuje się na końcach N i C, w domenie centralnej i w regionach narażonych na agregację.

W przypadku tau związanego z hiperfosfo zaobserwowano ogólny wzrost wychwytu deuteru przez białko. Obserwuje się znaczne wzrosty na końcach N i C oraz w regionie drugim heksapeptydu. Stopień współczynników ochrony jest oznaczony kolorem tęczy, jak pokazano tutaj.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby używać regionów o klasie HPC lub wyższej, aby zminimalizować zanieczyszczenia, ponieważ mogą one zakłócać analizę. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak znakowanie kowalencyjne, sieciowanie chemiczne, modelowanie obliczeniowe i badania dokumentacyjne w celu dopasowania trójwymiarowych struktur białkowych lub potwierdzenia obszarów interakcji białka białkowego i leginy.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną do badania wewnętrznie nieuporządkowanych białek i domen, które są najczęściej stosowane w chorobach nuerodegeneracyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać jonizacji elektrorozpylania z rozdzielczością czasową, wymiany wodorowo-deuterowej, spektrometrii mas do badania struktury i dynamiki białek.