Name: Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj spektrometrię mas z jonizacją wodorowo-deuterową do badania struktury i dynamiki białek uporządkowanych oraz nieuporządkowanych. Ta metoda umożliwia monitorowanie reakcji w skali milisekundowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Dr. Markusowi Zweckstetterowi za dostarczenie pliku współrzędnych pdb dla 'rodzimego' zespołu tau przewidzianego na podstawie jego pracy NMR, z narzędziami do analizy dostarczonymi przez Dr. Adnana Sljokę. Finansowanie tych prac zostało zapewnione przez program grantowy ENGAGE Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC).

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem. Opary wytwarzane przez ablację laserową poli(metakrylanu metylu) (PMMA) mogą być toksyczne. Upewnij się, że grawer laserowy jest podłączony do działającego systemu wentylacji. Podczas budowy urządzenia mikroprzepływowego należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli technicznej (wyciąg, pojemnik na ostre przedmioty) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, maska na twarz, rękawice, fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami). Niezwykle ważne jest, aby w miarę możliwości używać odczynników do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), przy czym wszystkie powinny mieć klasę ACS lub wyższą, aby zmniejszyć zanieczyszczenia zakłócające podczas analizy.
1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Budowa platformy mikroprzepływowej PMMA
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w standardowy blok PMMA (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) i dokonaj laserowej ablacji kanału wejściowego do wprowadzania odczynników, komory proteolizy i kanału wyjściowego za pomocą grawera laserowego17,18. 
		UWAGA: Wytrawić komorę proteolizy w wydłużony owalny kształt (30 x 5 x 0,05 mm). Kanał wejściowy i wyjściowy musi rozciągać się do końca bloku PMMA i nie może być większy niż 75 μm zarówno pod względem szerokości, jak i głębokości, aby pomieścić kapilarnę o ciśnieniu 30 ga.</li>
		<li>Pokrój metalową kapilę ze stali nierdzewnej o wadze 30 ga na dwie części po około 10 cm każdy za pomocą narzędzia obrotowego z tarczą tnącą o grubości 1/64 cala. Użyj papieru ściernego, aby wygładzić końce naczyń włosowatych (można to ułatwić, oglądając pod mikroskopem świetlnym).</li>
		<li>Rozpuść kapilary w wytrawionym bloku z poli(metakrylanu metylu) za pomocą lutownicy. Kanał wejściowy zostanie podłączony do zautomatyzowanych pomp strzykawkowych, a kanał wyjściowy zostanie wykorzystany do sprzężenia z MS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa mieszalnika kinetycznego o przepływie ciągłym i rozdzielczości czasowej
	<ol>
		<li>Uzyskać kapilarę ze stopionego szkła krzemionkowego (ID: 75 μm, OD: 150 μm) o długości około 40 cm i włożyć ją do kapilary metalowej ze stali nierdzewnej o długości około 15 cm, o długości około 15 cm. W zależności od wymaganego czasu reakcji, użyj dłuższej zewnętrznej kapilary metalowej lub takiej, która ma większy ID. 
		UWAGA: Określenie "prawdziwej" średnicy wewnętrznej metalowej kapilary ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych czasów reakcji. Można to zrobić, podłączając metalową kapilarnę do HPLC, przepływając rozpuszczalnik przez kapilarnę i rejestrując ciśnienie wsteczne. Można dokonać obliczenia przeciwciśnienia do średnicy wewnętrznej i określić rzeczywistą średnicę wewnętrzną metalowej kapilary. Można to obliczyć za pomocą oprogramowania Kalkulator masy cząsteczkowej (dla systemu Windows w wersji 6.49).</li>
		<li>Wykonaj nacięcie o średnicy 2 mm za pomocą ustawień grawera laserowego o małej mocy na jednym końcu wewnętrznej szklanej kapilary i uszczelnij ten koniec wewnętrznej szklanej kapilary (Rysunek 2). Alternatywnie wykonaj nacięcie za pomocą noża kapilarnego ze szkła ceramicznego lub szlifierki obrotowej z precyzyjnym ostrzem tnącym.</li>
		<li>Wyrównaj wewnętrzną szklaną kapilarnę z końcem metalowej kapilary (można to ułatwić, oglądając pod mikroskopem świetlnym).</li>
		<li>Przymocuj ten mikser kinetyczny do jednego końca trójnika mieszającego (Rysunek 2).</li>
		<li>Przymocuj kapilarę ze stopionego szkła krzemionkowego (ID: 75 μm, OD: 150 μm) o długości około 40 cm do przeciwległego końca mieszalnika kinetycznego na trójniku mieszającym. Służy do dostarczania kwasu (5% kwasu octowego, pH 2,4) w celu wygaszenia reakcji. 
		UWAGA: Reagenty są dostarczane do urządzenia za pomocą gazoszczelnych strzykawek przez rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) za pomocą automatycznych pomp infuzyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja pepsyny
	<ol>
		<li>Odważyć 20 mg pepsyny z błony śluzowej żołądka świń i zawiesić ją w 1 ml buforu sprzęgającego (0,1 M fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH 6,0).</li>
		<li>Odważyć 50 mg kulek agarozy aktywowanych N-hydroksysukcynimidem (NHS), dodać do ponownie zawieszonej proteazy i delikatnie obracać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę.</li>
		<li>Odessać niezwiązaną proteazę.</li>
		<li>Inkubować agarozę w 1 ml buforu blokującego (1 M Tris-HCl, pH 6,0) i delikatnie obracać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę.</li>
		<li>Zassać bufor blokujący.</li>
		<li>Inkubować agarozę pepsyny z 1 ml 5% kwasu octowego o pH 2,4 przez 5 minut.</li>
		<li>Wiruj w dół przy 1,000 x g przez 2 minuty, aby zebrać żywicę.</li>
		<li>Odessać supernatant.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.3.8 - 1.3.10, co daje w sumie trzy prania.</li>
		<li>Przechowuj kulki w 1 ml kwasu octowego w temperaturze 4 °C do długotrwałego stosowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż urządzenia
	<ol>
		<li>Napełnij komorę proteolizy zawiesiną aktywowanych kulek pepsyny-agarozy w 5% kwasie octowym za pomocą sterylnej szpatułki.</li>
		<li>Umieść platformę mikroprzepływową PMMA pomiędzy dwoma pustymi blokami PMMA jako osłonę do uszczelnienia urządzenia, wyłożoną gumą silikonową, aby uzyskać płynne uszczelnienie.</li>
		<li>Użyj metalowych płytek zaciskowych, aby uszczelnić urządzenie. 
		UWAGA: Zacisk został wykonany na zamówienie, aby pasował do platformy mikroprzepływowej i składa się z dwóch płytek o wymiarach 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm.</li>
		<li>Przepływ 5% kwasu octowego, pH 2,4 z szybkością 10 μl/min. Przepływ 50 mM buforu octanu amonu (pH 6,9) przez linię białkową z szybkością 1 μL/min. 
		UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby kwas octowy stale przepływał przez urządzenie przez cały czas trwania eksperymentu. Upewnij się, że nie ma wycieków i że płyn wypływa tylko z kanału wyjściowego, który będzie służył jako źródło ESI.</li>
		<li>Sprzęgnij urządzenie z przednim końcem zmodyfikowanego kwadrupolowego spektrometru mas czasu przelotu (Q-TOF) za pomocą regulowanego izolowanego stopnia, aby uzyskać optymalne warunki do elektrorozpylania. 
		UWAGA: Przełącznik obejściowy został wprowadzony w celu symulacji obecności komercyjnego źródła ESI. 17</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Czasowo-rozdzielcza jonizacja ElectroSpray Wymiana wodorowo-deuterowa
<ol>
	<li>Pozyskiwanie pepsyny i samych białek Spectra 
	UWAGA: Akwizycja ESI-MS odbywa się w trybie jonów dodatnich o napięciu od +4 500 do +5 000, potencjale deklastrowania 60 V i potencjale ogniskowania 250 V. Widma są rejestrowane w zakresie 350-1,500 m/z z szybkością skanowania 1 s-1.
	<ol>
		<li>Zdobądź spektrum tylko pepsyny. Wszelkie piki pojawiające się w tym widmie są odejmowane po dodaniu białka.</li>
		<li>Wprowadź 50-100 μM białka tau/fosfo-tau (oczyść i przygotuj zgodnie z wcześniejszym opisem13,19) z szybkością 1 μL/min tam, gdzie wcześniej płynął bufor octanu amonu o pojemności 50 mM.</li>
		<li>Uzyskaj widmo tylko białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie punktów czasowych
	<ol>
		<li>Podczas gdy 100 μM białka tau/fosfo-tau przepływa z prędkością 1 μL/min, wprowadźD2Oz szybkością 3 μL/min przez trójnik i pozwól zareagować w mieszalniku kinetycznym. Odczekać, aż system osiągnie równowagę przez co najmniej 10 minut przed uzyskaniem widma. 
		UWAGA: Po wymianie reakcja znakowania jest wygaszana przez przepływ kwasu octowego o pH 2,4 przy 10 μl/min, a trawienie znakowanego białka zachodzi w komorze proteolitycznej.</li>
		<li>Aby wydłużyć czas etykietowania, należy ręcznie odciągnąć położenie wewnętrznej szklanej kapilary, aby osiągnąć czas mieszania od 42 ms do 8 s. Pozostawić system do zrównoważenia przez co najmniej 10 minut pomiędzy każdym cofnięciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dane i analiza statystyczna
<ol>
	<li>Identyfikacja peptydów i obliczanie procentowej wymiany deuteru
	<ol>
		<li>Wykonaj analizy widm MS za pomocą oprogramowania mMass, wersja 5.5.020.</li>
		<li>Zidentyfikuj peptydy za pomocą serwera proteomicznego ExPASy FindPept i potwierdź za pomocą dysocjacji wywołanej kolizją (CID), gdy jest to wymagane21. 
		UWAGA: W tym przypadku inkorporacja deuteru została zmierzona za pomocą opracowanego przez nas oprogramowania FORTRAN do analizy rozkładu izotopowego22,23.</li>
		<li>Oblicz teoretyczne współczynniki wewnętrzne na podstawie sekwencji pierwotnej za pomocą narzędzia internetowego SPHERE22,24.</li>
		<li>Dopasuj dane za pomocą pojedynczej wykładniczej regresji nieliniowej i znormalizuj za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk (np. SigmaPlot). 
		UWAGA: Stosunek kint / kobs daje współczynnik ochrony (PF), półilościową miarę stopnia, w jakim dany region jest zorganizowany w zespole konformacyjnym</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sapienza, P. J., Lee, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+NMR+to+study+fast+dynamics+in+proteins%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).</li>
<li>Neira, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+tool+to+identify+and+characterize+protein+folding+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).</li>
<li>Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+protein+conformers+be+fractionated+by+crystallization%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Can protein conformers be fractionated by crystallization?</a> Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+conformational+landscape+of+a+dynamic+enzyme+by+multitemperature+and+XFEL+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography.</a> eLife. 4, e07574(2015).</li>
<li>Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+uses+of+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and uses of hydrogen exchange.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).</li>
<li>Engen, J. R., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS.</a> Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li>
<li>Wilson, D. J., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Capillary+Mixer+with+Adjustable+Reaction+Chamber+Volume+for+Millisecond+Time-Resolved+Studies+by+Electrospray+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).</li>
<li>Morgan, C. R., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+solution-phase+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom.+RCM%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+intrinsically+disordered+tau+protein+induces+an+amyloidogenic+shift+in+its+conformational+ensemble%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble.</a> PloS One. 10, e0120416(2015).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).</li>
<li>Hilser, V. J., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+calculation+of+the+equilibrium+folding+pathway+of+proteins.+Correlation+with+hydrogen+exchange+protection+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors.</a> J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Protein+Structural+Models+by+Comparison+of+H%2FD+Exchange+MS+Data+with+Exchange+Behavior+Accurately+Predicted+by+DXCOREX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).</li>
<li>Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microfluidic+chip+for+millisecond+time-scale+kinetic+studies+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).</li>
<li>Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+reactor+for+rapid%2C+low-pressure+proteolysis+with+on-chip+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol.+Clifton+NJ%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mMass+3%3A+a+cross-platform+software+environment+for+precise+analysis+of+mass+spectrometric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data.</a> Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Rob, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Dynamics+in+Weakly+Structured+Regions+of+Proteins+Using+Microfluidics-Enabled+Subsecond+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).</li>
<li>Ferguson, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2FDeuterium+Scrambling+during+Quadrupole+Time-of-Flight+MS%2FMS+Analysis+of+a+Zinc-Binding+Protein+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain.</a> Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17, 75-86 (1993).</li>
<li>Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+isoforms%2C+phosphorylation+and+role+in+neurodegenerative+disorders1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1.</a> Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19551977">Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).</li>
<li>Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+discovery+and+development+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review.</a> Anal. Chim. Acta. , (2016).</li>
<li>Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+and+dynamics+of+interchain+cysteine-linked+antibody-drug+conjugates+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+95+kDa+antigen+in+complex+with+antibody+by+solution-phase+amide+backbone+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+monitored+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).</li>
<li>Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+with+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> The Analyst. 128, 623-628 (2003).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+epitope+mapping+using+site-directed+mutagenesis+and+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis.</a> Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).</li>
<li>Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+and+Type+2+scenarios+in+hydrogen+exchange+mass+spectrometry+studies+on+protein-ligand+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes.</a> The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podczas gdy metody biologii strukturalnej, takie jak krystalografia rentgenowska i NMR, są korzystne, ponieważ zapewniają niezwykle szczegółowe struktury białek, obrazy te są często statyczne. Charakterystyka gatunków przejściowych i słabo ustrukturyzowanych domen nadal pozostaje nieuchwytna, gdy bada się ją tymi konwencjonalnymi metodami. Dlatego, aby uzyskać dynamiczny wgląd w tego typu systemy, ważne jest, aby pracować w szybkich skalach czasowych. Udało nam się zastosować TRESI-HDX-MS w celu uzyskania szczegółowych i...

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat poczyniono znaczne postępy w rozwoju technik analitycznych przeznaczonych do pomiaru struktury i dynamiki białek1,2,3,4. Podczas gdy krystalografia rentgenowska pozostaje głównym narzędziem do określania struktury białek, potrzebne są wysokie stężenia białka i konieczna jest szeroko zakrojona optymalizacja w celu wytworzenia kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Białka, które są trudne do krystalizacji, takie jak białka związane z błoną i wewnętrznie nieuporządkowane, były klasycznie badane za pomocą wymiany wodorowo-deuterowej (HDX) NMR5. Jednak w ostatnich dziesięcioleciach sprzężenie spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) z HDX szybko zyskało na popularności6,7.
Spektrometria mas oferuje rozwiązanie wielu ograniczeń stawianych przez krystalografię rentgenowską i NMR. W szczególności stwardnienie rozsiane jest bardzo wrażliwe (wymagane stężenia od nM do μM) i praktycznie nie ma ograniczeń co do wielkości białka. Ponadto wysoki cykl pracy analizy stwardnienia rozsianego pozwala na badanie białek w trakcie ich przemiany enzymatycznej, nieprawidłowego fałdowania, kompleksowania i innych biologicznie istotnych procesów. Procesy te często zachodzą w skali od milisekundy do sekundy i wymagają szybkiego wymieszania odczynników przed analizą.
Rozwój Time-Resolution ElectroSpray Ionization (TRESI) przez Wilsona i Konermanna w 2003 roku pozwolił na monitorowanie reakcji w pseudo-czasie rzeczywistym przez ESI-MS. Ich konfiguracja obejmowała mieszalnik kapilarny z płynnie regulowaną objętością komory reakcyjnej8. Urządzenie składa się z dwóch koncentrycznych kapilarn, z wewnętrzną kapilarą uszczelnioną i nacięciem wyciętym w jej boku, aby umożliwić mieszanie w wąskiej przestrzeni międzykapilarnej od wcięcia do końca wewnętrznej kapilary (zwykle 2 mm). W przypadku zastosowania do eksperymentów HDX, wewnętrzna kapilara przenosi interesujące białko, zewnętrzna kapilara przenosi znakowany roztwór D2O, który następnie ulega mieszaniu z białkiem przed wejściem do regulowanej komory reakcyjnej, co pozwala na znakowanie HDX przed bezpośrednim przeniesieniem do źródła ESI.
Krótko mówiąc, HDX opiera się na wodorach amidowych w szkielecie, które są wymieniane z atomami deuteru w roztworze9,10. Wymiana jest katalizowana zasadą przy fizjologicznym pH, przy czym kataliza kwasowa staje się powszechna przy pH poniżej około 2,6. Szybkość wymiany opiera się na czterech głównych czynnikach: pH, temperaturze, dostępności rozpuszczalnika i wewnątrzcząsteczkowych wiązaniach wodorowych. Ponieważ dwa pierwsze czynniki są utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu, szybkość wymiany, szczególnie w pozycjach amidów szkieletu peptydowego, zależy przede wszystkim od struktury białka11. Ciasno pofałdowane obszary z rozległymi, stabilnymi sieciami wiązań wodorowych w α-helisach i β-arkuszach będą pobierać deuter w znacznie wolniejszym tempie w porównaniu z pętlami i nieuporządkowanymi obszarami (a czasami wcale)12. Pozwala to na globalną analizę białek, w której zaburzenia struktury (np. podczas agregacji lub wiązania substratu) prowadzą do zróżnicowanego wychwytu deuteru (ryc. 1).
Kinetyczny mieszalnik kapilarny może być włączony do platformy mikroprzepływowej zawierającej komorę proteolityczną do lokalizacji poboru deuteru. Ta komora proteolityczna jest utrzymywana w niskim pH, aby skutecznie wygasić reakcję wymiany i wymaga unieruchomionej proteazy kwasowej w celu strawienia białka do zlokalizowanych peptydów (ryc. 2). Monitorowanie wymiany szkieletowej w skali od milisekundy do sekundy jest szczególnie ważne dla charakterystyki zmian konformacyjnych w trudnych do scharakteryzowania regionach pętli, stopionych kulełkach i wewnętrznie nieuporządkowanych białkach (IDPs)13,14. Alternatywnie, TRESI-HDX może być również używany do charakteryzowania białek, które obecnie nie mają rozwiązanej struktury atomowej za pomocą metod krystalografii rentgenowskiej i NMR, przy użyciu wymiany deuteru sprzężonej z podejściem algorytmu COREX (DX-COREX)15,16. Ten szczegółowy protokół zastosuje TRESI-HDX do badania tau, IDP, zarówno w jego natywnej formie, jak i w stanie patogennej hiperfosforylacji. Podczas gdy rodzime tau jest jednym z najlepiej przebadanych IDP, niewiele wiadomo o jego amyloidogennym odpowiedniku13.

<table><tbody><tr><td>Poli(metakrylan metylu) lub PMMA</td><td>Profesjonalne tworzywa sztuczne</td><td>SACR.250CCP</td><td>8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm</td></tr><tr><td>Kapilara ze stopionego szkła krzemionkowego</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID: 75 &micro; m, OD: 150 i mikro; </td></tr><tr><td>m Kapilary metalowe</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>Rurka fluorowanego etylenu propylenu (FEP)</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007", OD: 1/16" ID: 0.020", OD: 1/16"</td></tr><tr><td>Standardowy obcinak do rur polimerowych</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>do 1/16" i 1/8" Rurki OD</td></tr><tr><td>Mikrostatyczny trójnik mieszający</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>do 1/16 " Rurka OD</td></tr><tr><td>lub</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>trójnik ze stali nierdzewnej, 0,25&nbsp; mm Bore</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>dla 1/16" Rurka zewnętrzna</td></tr><tr><td>Trójnik PEEK do 1/16 " Rurka OD</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 żeńsko-żeńska Luer</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK Nakrętka dwuskrzydłowa</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>Tuleja do 1/16 " Rurka OD</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>Seria 100 Narzędzie obrotowe</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>Tarcze tnące</td><td>Jobmate</td><td></td><td>Grubość 1/64 "</td></tr><tr><td>Stereomaster Mikroskop z zoomem cyfrowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>Lutownica</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>Laser uniwersalny</td> <td>VersaLaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp; &mikro; Pompy</td></tr><tr><td>strzykawkowe</td> o pojemności L <td>Aparat Harvard</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-aktywowane agarozą</td><td>Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna z błony śluzowej żołądka świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0,6ML</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software/Narzędzia online</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td></td> Kalkulator masy cząsteczkowej Corel <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wersja 6.49</td><td>Open Source MS Tool</td>mMass Wersja 5.5.0 Open Source MS Tool ExPASy FindPept Szwajcarski Instytut Bioinformatyki SigmaPlot Systat Wersja oprogramowania 11.0 PyMOL Schr&ouml;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> dinger</td><td>Wersja 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF Spektrometr masowy AB</td><td>SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) od dawna stanowią wyzwanie dla biologów strukturalnych ze względu na brak stabilnych drugorzędowych elementów strukturalnych. Wymiana wodorowo-deuterowa (HDX) mierzona w szybkich skalach czasowych jest wyjątkowo dostosowana do wykrywania struktur i sieci wiązań wodorowych, które są krótko zapełnione, co pozwala na scharakteryzowanie przejściowych konformerów w natywnych zespołach. Sprzężenie HDX ze spektrometrią mas oferuje kilka kluczowych korzyści, w tym wysoką czułość, niskie zużycie próbki i brak ograniczeń co do wielkości białka. Technika ta znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich kilku dekad, w tym dzięki możliwości monitorowania czasów etykietowania HDX w milisekundowej skali czasowej. Ponadto, dzięki włączeniu przepływu pracy HDX do platformy mikroprzepływowej, w której znajduje się mikroreaktor proteazy kwasowej, jesteśmy w stanie zlokalizować właściwości dynamiczne na poziomie peptydów. W tym badaniu wykorzystano spektrometrię mas z jonizacją elektrorozpylającą w czasie (TRESI-MS) sprzężoną z HDX, aby uzyskać szczegółowy obraz struktury resztkowej w białku tau, a także przesunięć konformacyjnych wywołanych hiperfosforylacją.

Profiley trawienia natywnego białka tau oraz phospho-tau były podobne, zapewniając odpowiednio 7,1% i 71,7% pokrycia sekwencji. Wartości przyłączenia deuteru dla każdego peptydy określono poprzez dopasowanie obserwowanych rozkładów izotopowych do rozkładów teoretycznych generowanych za pomocą opracowanego wewnętrznie oprogramowania w języku FORTRAN. Najlepiej dopasowane rozkłady przedstawiono na (Rysunku 3a) wraz z powiązanymi wartościami przyłączenia deuteru. Następnie w...

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcji białek, a głównym celem spektrometrii mas z wymianą wodoru na deuter z jonizacją elektrospray w czasie rzeczywistym (Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry) jest badanie szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcje białek uporządkowanych i nieuporządkowanych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii strukturalnej, takie jak charakteryzacja przejściowych konformacji białek, co nie jest możliwe przy użyciu klasycznych technik wysokiej rozdzielczości, takich jak krystalografia czy NMR. Główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania reakcji w skali milisekundowej, co jest istotne dla charakterystyki regionów pętli, globularnych domen oraz białek wewnętrznie nieuporządkowanych.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię schorzeń neurodegeneracyjnych, ponieważ często wiążą się one z błędnym fałdowaniem lub agregacją wewnętrznie nieuporządkowanych regionów białek. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w białka o słabej strukturze, może być ona również stosowana w innych układach, takich jak enzymy podlegające obrotowi katalitycznemu, czy w charakterystyce oddziaływań białko-białko oraz białko-ligand.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wygrawerować laserowo w standardowym bloku PMM8 płytkę z kanałem wlotowym do wprowadzania odczynników, komorą do predializy oraz kanałem wylotowym, używając grawerki laserowej. Następnie, za pomocą narzędzia rotacyjnego z zamontowaną tarczą tnącą o grubości 1/64 cala, należy pociąć kapilarę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 30 G na dwa odcinki o długości 10 cm każdy. Końce kapilar należy wygładzić papierem ściernym, co można ułatwić poprzez obserwację pod mikroskopem świetlnym.Następnie, za pomocą lutownicy, wtop kapilary w trawiony blok PMM8. Aby zbudować mieszalnik kinetyczny z rozdzielczością czasową do przepływu ciągłego, włóż 40 centymetrową kapilarę z topionego szkła krzemionkowego do stalowej kapilary o rozmiarze 28G o długości około 15 centymetrów. Następnie, używając grawera laserowego o niskiej mocy, wykonaj dwumilimetrowe wcięcie na jednym końcu wewnętrznej szklanej kapilary, a następnie zapieczętuj ten koniec wewnętrznej szklanej kapilary.Jest to krytyczny krok, który zapewnia ortogonalne i efektywne mieszanie białka, które wypływa przez wcięcie w powszechnym detergencie. Dwumilimetrowa przestrzeń międzykapilarna między wcięciem a końcem kapilary stanowi objętość mieszania. Należy zamocować dopasowane rozmiarowo złączki i tuleje rurek oraz włączyć konektor T, który będzie służył do podawania deuteru.Następnie wyrównaj wewnętrzną kapilarę szklaną z końcem kapilary metalowej, co można ułatwić, obserwując układ pod mikroskopem świetlnym. Oznacz to miejsce jako pozycję zero milimetrów. Przymocuj ten mieszacz kinetyczny do jednego końca trójnika mieszającego. Następnie przymocuj 40 centymetrową kapilarę z topionego szkła kwarcowego do przeciwległego końca mieszacza kinetycznego na trójniku mieszającym. W celu aktywacji pepsyny zawieś 20 miligramów pepsyny z błony śluzowej żołądka Porsena w jednym mililitrze buforu sprzęgającego.Do resuspenderowanych białek dodać 50 mg kulek agro aktywowanych NHS i inkubować podczas delikatnego obracania przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia odwirować mieszaninę z prędkością 1000 ×g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania żywicy. Następnie odessać niezwiązane białka.Następnie inkubuj agros w jednym mililitrze buforu blokującego i delikatnie rotuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po zebraniu żywicy i odessaniu buforu blokującego, inkubuj agguros z pepsyną z jednym mililitrem pięcioprocentowego kwasu octowego przez pięć minut. Wirowuj mieszaninę z prędkością 1 000 ×g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać żywicę, a następnie odessać supernatant.Po powtórzeniu poprzednich kroków, łącznie przez trzy cykle płukania, należy przechowywać koraliki w jednym mililitrze kwasu octowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego użytkowania. Aby złożyć urządzenie, wypełnij komorę proteolizy zawiesiną aktywowanych koralików z agrelozą z pepsyną w pięcioprocentowym kwasie octowym, używając sterylnej szpatułki. Umieść mikroprzepływową platformę PMMA pomiędzy dwoma pustymi blokami PMMA w charakterze pokrywy do uszczelnienia urządzenia, wyłożonymi gumą silikonową w celu zapewnienia szczelności cieczowej.Użyj metalowych płyt zaciskowych, aby uszczelnić urządzenie pod ciśnieniem. Następnie podłącz trójnik mieszający do wlotu urządzenia, używając odpowiednich złączy. Teraz przepuść 5% kwas octowy przez linię kwasową z przepływem 10 µL/min.Następnie przepuść bufor amoniakalny o stężeniu 50 mM przez linię białkową z przepływem 1 µL/min. Połącz urządzenie z przednią częścią zmodyfikowanego spektrometru mas typu quadrupol-time-of-flight (Qtof), używając regulowanego izolowanego podestu w celu uzyskania optymalnych warunków rozpylania elektrospray. Po ustawieniu parametrów ESI-MS zarejestruj widmo zawierające wyłącznie pepsynę.Następnie wprowadź od 50 do 100 µM białka tau lub fosfo-tau z prędkością 1 µL/min w miejsce wcześniejszego przepływu buforu octanowego amonu 50 mM. Po ustabilizowaniu systemu przez co najmniej 10 min, przed rozpoczęciem pomiaru, zarejestruj widmo samego białka. Podczas przepływu białka tau lub fosfo-tau wprowadź D₂O z prędkością 3 µL/min za pomocą złącza T i pozwól na zajście reakcji w mieszalniku kinetycznym.Aby wydłużyć czas znakowania, należy ręcznie cofnąć pozycję wewnętrznej kapilary szklanej, aby uzyskać czasy mieszania od 42 milliseconds do eight seconds, pozwalając systemowi na ustabilizowanie się przez co najmniej 10 seconds pomiędzy każdym cofnięciem. Ta animacja przedstawia przebieg typowego eksperymentu. Białko wypływa przez wcięcie i miesza się z nadchodzącym deuterem.Wodory szkieletowe M8 ulegają wymianie podczas wyznaczonego czasu reakcji, który można zmieniać poprzez wycofanie kapilary z białkiem. Następnie reakcję przerywa się, a białko poddaje trawieniu na platformie mikrofluidycznej wyposażonej w igłę wylotową ESI. Uzyskane widmo zawiera strawione białko.Procent poboru deuteru jest obliczany dla poszczególnych peptydów, a następnie naniesiony na trójwymiarową strukturę białka. Profile trawienia natywnego i fosforylowanego białka tau były zbliżone, zapewniając odpowiednio 77,1% i 71,7% pokrycia sekwencji; tutaj przedstawiono najlepiej dopasowane rozkłady izotopowe oraz powiązane z nimi wartości poboru deuteru dla czterech prostych peptydów. Obserwowany wykres kinetyczny procentu poboru deuteru w funkcji czasu dla każdego peptydu służy do wyznaczenia obserwowanej szybkości eksperymentalnej.Obliczone losowe profile quali przedstawiono w celu porównania i wykorzystano do wyznaczenia teoretycznego stopnia wewnętrznego. Zgodnie z oczekiwaniami, w zakresie zazwyczaj powiązanym z elementami struktury drugorzędowej nie zaobserwowano czynników ochronnych, co potwierdza, że natywne białko tau wykazuje słabe wewnętrzne wiązania wodorowe. Znaczną ochronę odnotowano na końcach N i C, w domenie centralnej oraz w regionach skłonnych do agregacji.W przypadku tau z hiperfosforylacją zaobserwowano ogólny wzrost poboru deuteru w całej białku. Odnotowano znaczące wzrosty na końcach N i C oraz w regionie heksapeptydu dwa. Stopień czynników ochronnych został przedstawiony w schemacie kolorów tęczy, jak pokazano tutaj.Po opanowaniu tej techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta może zająć kilka godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie odczynników klasy HPC lub wyższej, aby zminimalizować obecność zanieczyszczeń, które mogą zakłócać analizę. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak znakowanie kowalencyjne, chemiczne sieciowanie, modelowanie komputerowe i badania dokumentacyjne, w celu dopasowania trójwymiarowych struktur białek lub potwierdzenia obszarów oddziaływań białko-białko oraz białko-ligand.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii strukturalnej do eksploracji białek i domen wewnętrznie nieustrukturyzowanych, najczęściej występujących w chorobach neurodegeneracyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat wykorzystania spektrometrii mas z wymianą wodoru na deuter oraz czasowo rozdzielonej jonizacji elektrorozpylnej do badania struktury i dynamiki białek.

time-resolved-electrospray-ionization-hydrogen-deuterium-exchange

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Poznaj spektrometrię mas z jonizacją wodorowo-deuterową do badania struktury i dynamiki białek uporządkowanych oraz nieuporządkowanych. Ta metoda umożliwia monitorowanie reakcji w skali milisekundowej.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Przeglądaj więcej filmów