Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ogólnym celem tej metody obrazowania fluorescencyjnego jest monitorowanie zmian w transporcie białek błonowych i dystrybucji wewnątrzkomórkowej. Metoda ta dostarcza informacji na temat zmian w transporcie białek, takich jak wpływ mutacji genetycznych lub czynników farmakologicznych na szybkość dostarczania pęcherzyków i ekspresję białka na powierzchni komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomiary mogą być wykonywane szybko, w wysokiej rozdzielczości, w czasie rzeczywistym, bez niszczenia próbki.

48 godzin przed obrazowaniem komórki mysiego nerwiaka zarodkowego 2A są transfekowane konstruktem plazmidowym zawierającym SEP, wrażliwy na pH fluorofor wbudowany w zewnątrzkomórkowy obszar białka będącego przedmiotem zainteresowania. Gdy transfekowane komórki są gotowe do obrazowania, za pomocą fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia lub mikroskopii TIRF, dodaj do komórek dwa mililitry roztworu zewnątrzkomórkowego o pH 7,4 lub ECS. Umieść miskę z komórkami na stoliku translacyjnym i użyj uchwytów do etapów, aby zabezpieczyć szalkę na miejscu.

W trybie epifluorescencji ustaw ostrość mikroskop i zlokalizuj transfekowane komórki fluorescencyjne. Komórki pozostaną wyostrzone na kilku płaszczyznach ostrości. Zlokalizuj pojedyncze, odizolowane komórki, aby kontynuować pracę z TIRF.

W programie do obrazowania ustaw czas ekspozycji na 200 milisekund i zoptymalizuj intensywność fluorescencji, ustawiając wzmocnienie EM. Przenieś wiązkę laserową na TIRF za pomocą silnika krokowego, aby przesunąć wiązkę przez obiektyw w sposób stopniowy. W miarę zbliżania się kąta krytycznego wiązka będzie widocznie przesuwać się w poprzek krawędzi naczynia, aż zbiegnie się w punkcie całkowitego wewnętrznego odbicia na płaszczyźnie próbki, w którym to momencie wiązka nie jest już widoczna wzdłuż krawędzi naczynia.

Sprawdź, czy komórki są w trybie TIRF, regulując pokrętło ostrości. W TIRF tylko jedna płaszczyzna komórek może być zogniskowana, co daje wysoce zdefiniowany obraz błony plazmatycznej o wysokiej rozdzielczości. Aby rozpocząć tę procedurę, zlokalizuj zdrowe transfekowane pojedyncze komórki w płaszczyźnie obrazowania.

Uzyskaj ostry obraz komórek o pH 7,4. Receptory znakowane SEP na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym powinny być widoczne. Szybko zablokuj wiązkę lasera przed dotarciem do próbki, aby zapobiec wybielaniu zdjęć.

Użyj oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, które może rejestrować wiele lokalizacji XY, aby zarejestrować pozycje stolika odpowiadające każdej komórce. W ten sposób uchwyć obrazy od 20 do 30 komórek na antenę, używając oprogramowania do rejestrowania pozycji każdej komórki. Po zebraniu wszystkich obrazów komórek o pH 7,4 należy ręcznie usunąć ECS o pH 7,4 za pomocą pipetowania bez dotykania naczynia.

Ostrożnie dodaj do naczynia dwa mililitry pH 5,4 ECS i odczekaj 10 minut. W tym czasie zapisz wcześniej pozyskane obrazy. W identycznym zestawie warunków używanych do zbierania obrazów o pH 7,4 przesuń stolik do każdej zapisanej pozycji i uzyskaj obraz tej samej komórki o pH 5,4.

Komórki powinny wyglądać na mniej zdefiniowane, ponieważ cała wykryta fluorescencja pochodzi z receptorów znakowanych SEP w retikulum endoplazmatycznym. Zapisz obrazy komórek o pH 5,4. Aby zobrazować przyczepy pojedynczych pęcherzyków, najpierw zastąp pożywkę wzrostową transfekowanych komórek dwoma mililitrami pH 7,4 ECS.

Następnie umieść miskę z transfekowanymi komórkami na stoliku mikroskopu i użyj uchwytów do stolika, aby zabezpieczyć naczynie na miejscu. Skoncentruj się na pojedynczej komórce w TIRF, jak pokazano wcześniej. Jeśli jest na wyposażeniu, ustaw autofokus tak, aby ostrość nie przesuwała się w okresie obrazowania.

Nagrywaj serię 1 000 klatek, rejestrując obrazy w sposób ciągły z szybkością 200 milisekund. W tym czasie widoczne będą wybuchy fluorescencji, odpowiadające pęcherzykom transportowym o niskim pH łączącym się z błoną plazmatyczną, wystawiając SEP na zewnątrzkomórkowe pH 7,4. Aby rozpocząć analizę fluorescencji SEP w celu określenia lokalizacji subkomórkowej, otwórz obrazy komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ.

Odejmij tło od obrazów o pH 5,4 i pH 7,4, korzystając z ustawienia toczącej się kuli. Używając progu opartego na intensywności do ilościowego określenia fluorescencji z pojedynczej komórki o pH 7,4, najpierw wybierz obraz, dostosuj i próg. Następnie ręcznie wybierz obszar zainteresowania wokół komórki.

Korzystając z wbudowanej funkcji pomiaru na karcie analizy, zmierz powierzchnię komórki, średnią intensywność i zintegrowaną gęstość. Powtórz te pomiary dla tej samej komórki przy pH 5,4. Po uzyskaniu zintegrowanej gęstości dla obrazów komórek zarówno przy pH 7,4, jak i 5,4, oblicz gęstość zintegrowaną błony plazmatycznej, odejmując wartość pH 5,4 od wartości pH 7,4.

Różnica odpowiada względnej liczbie receptorów na błonie plazmatycznej w obszarze wzbudzenia TIRF. Jako miarę transportu należy obliczyć względny procent receptorów znakowanych SEP zlokalizowanych na błonie plazmatycznej w porównaniu z pozostałymi receptorami widocznymi w objętości wzbudzenia TIRF, dzieląc gęstość zintegrowaną błony plazmatycznej przez całkowitą gęstość zintegrowaną przy pH 7,4, pomnożoną przez 100. Aby przeanalizować zdarzenia wprowadzenia pojedynczych pęcherzyków, otwórz serię 1 000 obrazów TIFF za pomocą oprogramowania do analizy obrazów.

Odejmij tło od wszystkich klatek, korzystając z ustawienia toczącej się kuli. Dostosuj balans kolorów nagrania, aby zmaksymalizować intensywne obszary odpowiadające zdarzeniom wprowadzania pęcherzyków. Ręcznie policz wybuchy fluorescencji trwające dłużej niż trzy klatki lub 600 milisekund.

Ten przykład obrazu komórki o pH 7,4 pokazuje receptory zlokalizowane na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym. Przy pH 5,4 receptory na błonie plazmatycznej nie fluoryzują, więc widoczne są tylko receptory rezydujące w retikulum endoplazmatycznym. Różnica między zintegrowaną gęstością fluorescencji przy pH 7,4 i pH 5,4 odpowiada receptorom zlokalizowanym w błonie plazmatycznej.

Pojedyncze zdarzenia przyczepiania się pęcherzyków są wizualizowane przy pH 7,4 jako wybuch fluorescencji na błonie plazmatycznej, trwający co najmniej 600 milisekund. Bezpośrednio przed wprowadzeniem nie ma zauważalnego pęknięcia. Wzrost intensywności fluorescencji jest widoczny wraz z nadejściem pęcherzyka transportowego przenoszącego SEP.

Receptory znakowane SEP następnie dyfundują przez błonę plazmatyczną, aż staną się nie do odróżnienia od wcześniej wstawionych receptorów. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w 45 minut na danie, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować zmiany w dystrybucji białek między obwodowym ER a błoną plazmatyczną.