Name: Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy Aβ42 i Aβ40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów. Ta metoda ułatwia badania nad chorobą Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować firmie Agilent za pomoc techniczną. Kate Markham i Rafael Palomino są uznawani za ich początkową pomoc w syntezie i oczyszczaniu peptydu Aβ, a dr Hsiau-Wei Lee dziękuje się za pomoc w przygotowaniu ryciny 1 manuskryptu.

1. Oczyszczanie preparatywne peptydu Aβ40 lub Aβ42 metodą HPLC
<ol>
	<li>Przygotuj następujące bufory do oczyszczania metodą HPLC.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor A (20 mM NH4OH), dodając 1,3 mL NH4OH (roztwór 28%) do 1000 mL wody ultra czystej.</li>
		<li>Przygotuj bufor B (80% acetonitryl z 20 mM NH4OH), dodając 1,3 mL NH4OH (roztwór 28%) do roztworu zawierającego 800 mL chromatograficznie czystego acetonitrylu i 200 mL wody ultra czystej.</li>
		<li>Przygotuj bufor do rozpuszczania próbki (0,1% NH4OH), dodając 100 µL NH4OH (roztwór 28%) do 100 mL wody ultra czystej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj aparat HPLC zgodnie z rysunkiem 1.
	<ol>
		<li>Podłącz butelki z buforem A i buforem B do wejść pompy HPLC za pomocą węży polimerowych. Przymocuj węże polimerowe do pompy HPLC za pomocą jednokomponentowego złączki. Upewnij się, że wąż polimerowy każdego buforu jest podłączony do odpowiedniego zaworu wejściowego aparatu. Wyposaż pompę HPLC w odgazownik.</li>
		<li>Połącz pompę HPLC z wejściem kolumny preparatywnej 300 Å 8 µm 25 mm х 300 mm za pomocą węży polimerowych (rysunek 1B, kolumna najbardziej z lewej strony, patrz lista materiałów).
		<ol>
			<li>Przymocuj węże polimerowe do kolumny preparatywnej za pomocą jednokomponentowej złączki dokręcanej ręcznie. Upewnij się, że kolumna polimerowa jest zorientowana poprawnie. 
			UWAGA: Faza stacjonarna kolumny preparatywnej składa się z cząstek poli(styren-divinylbenzenu). Poprawna orientacja kolumny polimerowej jest oznaczona na zewnętrznej obudowie pojedynczą strzałką kierunkową.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Połącz wyjście kolumny z detektorem o podwójnej długości fali za pomocą węży polimerowych i ustaw detektor na długości fali 214 nm i 280 nm.
		<ol>
			<li>Zmień długość fali, modyfikując parametry długości fali detekcji w opcji metody konfiguracji aparatu w wbudowanym oprogramowaniu HPLC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przymocuj węże polimerowe do wejścia detektora długości fali za pomocą jednokomponentowej złączki dokręcanej ręcznie. Przymocuj węże polimerowe do zaworu wyjściowego detektora długości fali. Przymocuj węże polimerowe do zaworu wyjściowego detektora HPLC za pomocą jednokomponentowej złączki dokręcanej ręcznie. Będzie to wąż do zbierania próbek. 
		UWAGA: Brak silnego chromoforu w peptydzie Aβ oznacza, że jako podstawową długość fali ultrafioletowej (UV) do zbierania pików należy użyć 214 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ chromatografii cieczowej o wysokiej wydajności (HPLC) do rozdzielania i analizy związków." src="/files/ftp_upload/55482/55482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat układu doświadczalnego aparatury HPLC wykorzystanej do oczyszczania peptydów beta-amyloidowych. (A) Czwórkowy pompą HPLC wyposażoną w odgazowywacz i detektor o zmiennych długościach fali ustawiony na 214 nm i 280 nm; (B) Kolumny HPLC używane do oczyszczania peptydów beta-amyloidowych, od lewej do prawej: kolumna preparatywna 25 x 300 mm2, kolumna półpreparatywna 7,5 x 300 mm2 oraz kolumna analityczna 4,6 x 250 mm2; (C) Ręczny dozownik z 20 µL stalowym pętlą dozującą, używany do HPLC analitycznego; (D) Ręczny dozownik z 10 mL stalowym pętlą dozującą, używany do oczyszczania preparatywnego i półpreparatywnego. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="3">
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie HPLC tak, aby uruchomić metodę oczyszczania zgodnie z Tabelą 1. Wprowadź metodę oczyszczania, zmieniając parametr harmonogramu rozpuszczalnika (w opcji konfiguracji metody instrumentu wbudowanej w oprogramowanie HPLC). Włącz pompę HPLC, klikając przycisk „on” w oprogramowaniu HPLC. 
	UWAGA: Pompa rozpocznie dostarczanie początkowego stosunku buforu A i buforu B przez kolumnę preparatywną oraz instrument HPLC.
	<ol>
		<li>Pozostaw system w stanie równowagi przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas / min</td>
			<td>% buforu Aa</td>
			<td>% buforu Bb</td>
			<td>Przepływd / mL min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>80</td>
			<td>20</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>75,5</td>
			<td>24,5</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45,01</td>
			<td>80</td>
			<td>20</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52,01</td>
			<td>80</td>
			<td>20</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52,02</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92</td>
			<td>5</td>
			<td>95c</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Harmonogram oczyszczania peptydów Aβ42 i Aβ40 przy użyciu kolumny polimerowej 25 × 300 mm. aBufor A – H2O z 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH; cPrzeprowadzono przez 15 min w celu przemywania kolumny przed kolejnym wstrzyknięciem próbki; dAby uzyskać przepływ 6 mL/min na aparaturze HPLC, limit ciśnienia należy zmniejszyć do 200 bar.
<ol start="4">
	<li>Oczyszczanie próbki peptydu Aβ 
	Note: Surowy peptyd uzyskano w wyniku automatycznej syntezy peptydów w fazie stałej.10
	<ol>
		<li>Rozpuść 3 mg surowego peptydu Aβ w 4 mL buforu do rozpuszczania próbek. Sonikuj próbkę przez 30–60 s w temperaturze pokojowej i przy częstotliwości 40 kHz w celu ułatwienia rozpuszczenia.</li>
		<li>Wstrzyknij całą próbkę na kolumnę HPLC za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 mL wyposażonej w stalową igłę o kalibrze 16. Przeprowadź metodę oczyszczania zgodnie z podpunktem 1.3. 
		UWAGA: System umożliwia wstrzyknięcie próbki za pomocą ręcznego dozownika wyposażonego w stalową pętlę dozującą o pojemności 10 mL (Ryc. 1D). Pożądany peptyd Aβ wyeluuje między 72. a 74. minutą jako ostra, dobrze rozdzielona fala (Ryc. 2C).</li>
		<li>Zbierz próbkę do stożkowej probówki do wirowania o pojemności 50 mL. Potwierdź tożsamość fali Aβ za pomocą bezpośredniego wstrzyknięcia i spektrometrii mas zebranego eluatu.11 Przechowuj eluat przez maksymalnie 12 godzin w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Nie zaleca się przechowywania roztworu dłużej niż 12 godzin ze względu na możliwość utleniania peptydu.</li>
		<li>Wyizoluj oczyszczony peptyd poprzez szybkie zamrożenie zebranych porcji peptydu Aβ w ciekłym azocie i liofilizację. Przeprowadź liofilizację przez suszenie pod wakuum w temperaturze -60 °C i pod ciśnieniem 20 mTorr przez 24 godziny.</li>
		<li>Wykonaj analityczną procedurę HPLC zgodnie z poniższym opisem, aby określić czystość peptydu Aβ. Przechowuj peptydy w postaci liofilizowanej w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza białka Aβ po oczyszczeniu metodą HPLC
<ol>
	<li>Przygotuj bufory do HPLC zgodnie z podsekcją 1.1. powyższego protokołu.</li>
	<li>Skonfiguruj analityczny system HPLC zgodnie z krokiem 1.2.1 oraz jak pokazano na rysunku 1, montując kolumnę analityczną 4.6 × 250 mm (rysunek 1B, kolumna najbardziej z prawej) oraz ręczny dozownik z 20 µL stalowym pętlą dozującą (rysunek 1C) na urządzeniu.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie HPLC do uruchomienia metody analitycznej przedstawionej w tabeli 2, postępując zgodnie z instrukcjami podobnymi do tych w kroku 1.3.</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas / min</td>
			<td>% buforu Aa</td>
			<td>% buforu Bb</td>
			<td>Szybkość przepływu / mL min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>95</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Harmonogram analizy czystości peptydu Aβ metodą HPLC. aBufor A – H2O z 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH.
<ol start="4">
	<li>Analiza czystości peptydu Aβ
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór peptydu o stężeniu 1 mg/mL poprzez rozpuszczenie peptydu w buforze próbkowym. 
		UWAGA: przepis na bufor można znaleźć w podsekcji 1.1. Stężenie białka oznacza się poprzez pomiar pochłaniania białka przy 280 nm (A280 nm).12 Współczynnik molarnego wygaszania (ε) używany do wyznaczania stężenia to ε = 1 490 dm3 mol-1 cm-1.13</li>
		<li>Wprowadzić 20 µL 1 mg/mL (222 µM) roztwór na kolumnę HPLC i uruchom metodę analityczną skonfigurowaną w kroku 2.3. 
		UWAGA: Pozostały roztwór nie użyty do analizy można szybko zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować w celu odzyskania peptydu Aβ. Szczegóły liofilizacji podano w podsekcji 1.4.4. Peptyd Aβ eluuje z kolumny analitycznej pomiędzy 16 a 18 minutą (Rysunek 2D). Wykorzystaj wbudowane oprogramowanie analityczne do integracji dostarczane wraz z aparatem HPLC w celu określenia czystości peptydu Aβ. Czystość określa się poprzez zintegrowanie powierzchni poszczególnych pików na chromatogramie i obliczenie procentowej powierzchni piku peptydu. Zwykle po oczyszczeniu &gt;95% powinno zostać potwierdzone.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Wyniki chromatografii, wykres absorbancji w funkcji czasu, analiza rozdziału białek, oznaczone piki." src="/files/ftp_upload/55482/55482fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Przykładowe chromatogramy HPLC peptydu Aβ42. (A) Tradycyjna C4 oczyszczanie krzemionkowe, warunki: bufor A: H2O z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA), bufor B: MeCN (acetonitryl) z 0,1% TFA, gradient: od 20 do 27% buforu B w ciągu 40 min, a następnie izokratycznie 27% buforu B; (B) Oczyszczanie przygotowawcze z użyciem kolumny 25 x 300 mm2 kolumna polimerowa, warunki: Bufor A: H2O z 20 mM NH4OH, bufor B: 80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH, gradient: 20 do 27% buforu B w ciągu 70 min, a następnie izokratycznie 27% buforu B; (C) Optymalizowana oczyszczalna oczyszczanie przy użyciu kolumny 25 x 300 mm2 kolumna polimerowa, warunki opisano w tabeli 1 znajdującej się w podsekcji 1.3 tekstu opisu protokołu; (D) HPLC analityczne przy użyciu kolumny 4,6 x 250 mm2 kolumna polimerowa, warunki: bufor A: H2O z 20 mM NH4OH, bufor B: 80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH, gradienta 5–50% buforu B w ciągu 30 min. Na częściach A, B i C szczyt odpowiadający Aβ42 oznaczono gwiazdką. Zbieranie oznaczonego szczytu Aβ42 na części C wykazuje czystość &gt;95%, jak pokazano na części D. Identyfikację pików Aβ42 wykonano metodą spektrometrii masowej. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>McGowan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%CE%B242+Is+Essential+for+Parenchymal+and+Vascular+Amyloid+Deposition+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice.</a> Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/18/10417.abstract">Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Oligomers+of+the+Amyloid+%CE%B2-Protein+Impair+Synaptic+Plasticity+and+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior.</a> Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).</li>
<li>Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+and+Chemical+Factors+Affecting+Amyloid+%CE%B2+Peptide+Amyloidogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity.</a> Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).</li>
<li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2346586/">Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide.</a> J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).</li>
<li>Fezoui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+preparing+the+amyloid+beta-protein+for+fibrillogenesis+and+neurotoxicity+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments.</a> Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).</li>
<li>Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+on+polystyrene-divinylbenzene+columns+for+the+rapid+separation+and+purification+of+acid-soluble+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins.</a> J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).</li>
<li>Thess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-engineered+mRNA+Without+Chemical+Nucleoside+Modifications+Enables+an+Effective+Protein+Therapy+in+Large+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals.</a> Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).</li>
<li>Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+D-glutamate+at+a+critical+residue+of+A%CE%B242+stabilizes+a+pre-fibrillary+aggregate+with+enhanced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity.</a> Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).</li>
<li>Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+High-performance+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometric+Investigation+of+Amyloid-%CE%B2+Peptide+Variants+Found+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).</li>
<li>Layne, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279960568_Spectrophotometric_and_Turbidimetric_Methods_for_Measuring_Proteins">Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins.</a> Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).</li>
<li>Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X1400469X">Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer.</a> Food Hydro. 46, 216-225 (2015).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-Induced+Cross-Linking+of+Unmodified+Proteins+%28PICUP%29+Applied+to+Amyloidogenic+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides.</a> J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12506200">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oczyszczanie peptydu Aβ metodą HPLC jest w dużym stopniu zależne od wyboru zarówno fazy stacjonarnej zastosowanej w oczyszczaniu, jak i fazy ruchomej wybranej do elucji peptydu. Niski punkt izoelektryczny peptydu i wysoka skłonność do agregacji sprawiają, że tradycyjne warunki chromatograficzne do rozdzielania białek hydrofobowych (faza stacjonarna C4 lub C8 sprzężona z kwaśnym mobilnym eluentem) są trudne, a peptyd Aβ eluuje jako przedłużony szeroki, nierozwiązany pik (Figura 2A).
<p class="jove_con...

Choroba Alzheimera to zaburzenie neurodegeneracyjne, które dotyka ponad 35 milionów ludzi na całym świecie. 1 Jest silnie zaangażowany w początek i rozwój choroby, jest wysoce podatny na agregację, hydrofobowy peptyd Amyloid beta (Aβ). 2 Aβ ma długość od 36 do 43 aminokwasów, jednak uważa się, że wariant 42-aminokwasowy, amyloid beta 42 (Aβ42), jest najbardziej toksyczną formą białka. 3 Wynika to głównie ze zdolności Aβ42 do łatwego tworzenia rozproszonych, oligomerycznych gatunków, które są uważane za szczególnie neurotoksyczne jednostki. 4 Aby lepiej zrozumieć peptyd Aβ, konieczne jest rutynowe pozyskiwanie materiału o wysokiej czystości. Wykazano, że obecność śladowych zanieczyszczeń radykalnie zmienia właściwości peptydu w zakresie skłonności do agregacji. 5
Tradycyjnie, wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) rozdzielanie hydrofobowych peptydów, takich jak Aβ, odbywa się za pomocą kombinacji faz stacjonarnych na bazie krzemionki C4 lubC 8 i kwaśnej fazy ruchomej. 6 Jednak takie warunki mogą stanowić wyzwanie dla oczyszczania peptydu. Niski punkt izoelektryczny peptydu Aβ (pI około 5,5)7 oznacza, że w warunkach kwaśnych agregacja peptydów jest zwiększona, w wyniku czego powstają szerokie, nierozdzielcze piki HPLC, które często są trudne do wyizolowania (Figura 2A). Co więcej, tak szerokie piki często zawierają zanieczyszczenia, które mogą wpływać na profil agregacji peptydu i zwykle wymagają kolejnych rund oczyszczania, co może dramatycznie wpłynąć na ilość wytwarzanego peptydu.
Faza stacjonarna poli(styrenu/diwinylobenzenu), PLRP-S, stanowi alternatywny sposób oczyszczania peptydów hydrofobowych. Faza stacjonarna została wykorzystana do oczyszczania wielu różnych białek i informacyjnych kwasów rybonukleinowych (mRNA). 8,9 Faza stacjonarna PLRP-S nie wymaga dodatkowego ligandu alkilowego do separacji faz wstecznych, a co ważniejsze, jest stabilna chemicznie przy wysokim pH, co prowadzi do deagregacji peptydu. 7 W niniejszym dokumencie przedstawiamy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40).

<table><tbody><tr><td>Pompa ćwiartkowa Agilent 1260 Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7111B</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Podwójny detektor o zmiennej długości fali</td><td>Agilent</td><td>G7114A</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector</td></tr><tr><td>Wtryskiwacz ręczny Agilent 1260 Infinity II wyposażony w pętlę na próbki ze stali nierdzewnej o pojemności 10 ml</td> Wtryskiwacz ręczny <td>Agilent</td><td>0101-1232</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II wyposażony w 20 i mikro; L pętla na próbki ze stali nierdzewnej</td><td>Agilent</td><td>G1328C</td><td></td></tr><tr><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector Pierścień Wspornik montażowy stojaka</td><td>Agilent</td><td>1400-3166</td><td></td></tr><tr><td>Agilent PLRP-S 300 &Aring; 5&nbsp; &mikro; m 4,6 x 250 mm (analityczny)</td><td>Agilent</td><td>PL1512-5501</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td></tr><tr><td>A&beta; 42 lub A&beta; 40 peptydów</td><td></td><td></td><td>Syntetyzowany we własnym zakresie przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora peptydów CEM liberty.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (NH4OH, roztwór 28%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-954-49A Złączka</td><td></td></tr><tr><td>Supelco PEEK Jednoczęściowa dokręcana na palc, opakowanie 5 szt.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z227250</td><td></td></tr><tr><td>Normject 5&nbsp; sterylna strzykawka cc</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481729</td><td></td></tr><tr><td>16 Gauge SS Igła</td><td>Reodyna</td><td>3725-086</td><td></td></tr></tbody></table>

dostosowany protokół oczyszczania hplc, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Peptydy amyloidogenne, takie jak beta amyloid (Aβ) związany z chorobą Alzheimera, mogą stanowić poważne wyzwanie przy próbie uzyskania materiału o wysokiej czystości. Tutaj przedstawiamy dostosowany protokół oczyszczania HPLC do produkcji peptydów amyloidu beta 42 (Aβ42) i beta-amyloidu 40 (Aβ40) o wysokiej czystości. Odkryliśmy, że połączenie dostępnej na rynku hydrofobowej fazy stacjonarnej z poli(styrenu/diwinylobenzenu), polimerowej laboratoryjnej fazy odwróconej - styrenidenylobenzenu (PLRP-S) w warunkach wysokiego pH, umożliwia osiągnięcie wysokiej czystości (>95%) Aβ42 w jednym przebiegu chromatograficznym. Oczyszczanie jest wysoce powtarzalne i może być modyfikowane zarówno do warunków półpreparatywnych, jak i analitycznych, w zależności od ilości materiału, który ma być oczyszczony. Protokół może być również stosowany do peptydu Aβ40 z identycznym powodzeniem i bez konieczności zmiany metody.

Oczyszczanie peptydu Aβ42 przy użyciu kombinacji fazy stacjonarnej PLRP-S i ruchomej fazy o wysokim pH prowadzi do powstania ostrego, wyraźnego piku dla peptydu Aβ w czasie retencji od 72 do 74 min (Rysunek 2C). Tożsamość piku potwierdza się za pomocą bezpośredniej spektrometrii mas zebranego eluentu. Eluent może być przechowywany w roztworze w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 12 h. Dłuższy okres przechowywania może prowadzić do utlenienia białka. W celu wyizolowania...

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie oczyszczania metodą HPLC do otrzymania wysokiej czystości peptydów amyloid beta 42 oraz amyloid beta 40, które są zdolne do tworzenia oligomerów. Właściwości biochemiczne peptydów amyloid beta często utrudniają ich oczyszczanie. W związku z tym uzyskanie wysokiej czystości peptydów zdolnych do formowania oligomerów może być wyzwaniem. Niniejsza procedura pomaga zminimalizować te trudności. Przed przystąpieniem do protokołu HPLC należy przygotować roztwory buforów A i B oraz bufor do rozpuszczania próbek. Aby skonfigurować układ HPLC, najpierw przymocuj butelki z buforem A i B do wlotów pompy. Użyj rurek polimerowych oraz złączy jednoczęściowych i nie pomyl zaworów. Połącz rurkę polimerową z wylotu pompy z wlotem kolumny preparatywnej. Dokręć złącze jednoczęściowe palcami i upewnij się, że kolumna jest ustawiona w odpowiedniej orientacji. Następnie przymocuj kolejną rurkę polimerową od wylotu kolumny do detektora dwudługościowego. Użyj dokręcanych palcami złączy jednoczęściowych, a następnie w oprogramowaniu konfiguracyjnym HPLC ustaw detektor długości fali na pomiar pików przy 214 i 280 nanometrach. Następnie połącz zawór wyjściowy detektora długości fali z zaworem wylotowym detektora HPLC za pomocą rurki polimerowej i dokręconego palcami złącza jednoczęściowego. Będzie to służyć jako rurka do zbierania próbek. Teraz zaprogramuj oprogramowanie HPLC, aby uruchomić metodę oczyszczania. W opcji Set up Instrument Method wprowadź metodę oczyszczania, zmieniając parametr harmonogramu rozpuszczalników. Na koniec włącz pompę HPLC w oprogramowaniu HPLC. Pompa zacznie teraz podawać początkowy stosunek buforu A i buforu B przez kolumnę preparatywną w urządzeniu HPLC. Jest kluczowe, aby pozwolić systemowi na równowagowanie przez 30 minut przed przystąpieniem do analizy próbek. Aby zacząć, rozpuść trzy miligramy surowego A

a-tailored-hplc-purification-protocol-that-yields-high-purity-amyloid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Fotowywołane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) umożliwia charakteryzację rozkładu wielkości oligomerów w metastabilnych mieszaninach białek. Prezentujemy zastosowanie metody PICUP w odniesieniu do trzech reprezentatywnych peptydów amyloidogennych: form 40- i 42-resztkowych białka amyloid β oraz kalcytoniny, a także do kontrolnego peptydu – czynnika uwalniającego hormon wzrostu.

Fotostymulowane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) zastosowane do peptydów amyloidogennych

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Ten film demonstruje protokół izolacji włókienek amyloidu z ekstraktu tkanki mózgowej myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości i trawienia białek nieamyloidowych.

Izolacja włókien amyloidowych z ekstraktu z tkanki mózgowej

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania monomerycznych peptydów amyloidowych do przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego w celu wytworzenia toksyczności amyloidu, naśladując uszkodzenia neuronów obserwowane w chorobie Alzheimera.

Ustalenie modelu choroby Alzheimera w mózgu danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie peptydu amyloidowego

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Poznaj dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy Aβ42 i Aβ40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów. Ta metoda ułatwia badania nad chorobą Alzheimera.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów (Wideo) | JoVE Journal

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Przeglądaj więcej filmów