Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów
27 marca 2017
Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.
Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie oczyszczania HPLC do wytworzenia peptydów amyloidu beta 42 i beta-amyloidu o wysokiej czystości, które są zdolne do tworzenia oligomerów. Właściwości biochemiczne peptydu beta amyloidu często mogą utrudniać jego oczyszczanie. Dlatego uzyskanie peptydu o wysokiej czystości, który jest zdolny do tworzenia oligomerów, może być trudne. Ta procedura pomaga złagodzić to wyzwanie. Dla tego protokołu HPLC należy przygotować zapasy A i B, a także bufor do rozpuszczenia próbki. Aby skonfigurować HPLC, najpierw dopasuj butelki buforu A i B do wlotów pompy. Używaj rurek polimerowych i jednoczęściowych złączek i nie mieszaj zaworów. Podłączyć rurkę polimerową od wylotu pompy do wlotu kolumny preparatywnej. Dokręć palcami jednoczęściowy element i upewnij się, że kolumna jest we właściwej orientacji. Teraz przymocuj kolejną rurkę polimerową od wylotu kolumny do detektora o podwójnej długości fali. Użyj jednoczęściowych złączek dokręcanych palcowo, a następnie w oprogramowaniu konfiguracyjnym HPLC ustaw detektor długości fali tak, aby mierzył piki przy 214 i 280 nanometrach. Następnie podłącz zawór wyjściowy detektora długości fali do zaworu wylotowego detektora HPLC za pomocą rurki polimerowej i jednoczęściowej złączki dokręconej palcem. Będzie on służył jako rurka do pobierania próbek. Teraz zaprogramuj oprogramowanie HPLC, aby uruchomić metodę oczyszczania. W opcji Set up Instrument Method (Konfiguracja metody instrumentalnej) wprowadź metodę oczyszczania, zmieniając parametr harmonogramu rozpuszczalnika. Na koniec włącz pompę HPLC w oprogramowaniu HPLC. Teraz pompa zacznie podawać stosunek początkowy buforu A i buforu B przez kolumnę preparatywną w instrumencie HPLC. Bardzo ważne jest, aby teraz pozwolić systemowi na zrównoważenie przez 30 minut przed przystąpieniem do pobierania próbek. Na początek rozpuść trzy miligramy surowego A
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu przedstawiono dostosowany protokół oczyszczania metodą HPLC w celu uzyskania wysokiej czystości peptydów amyloid beta 42 (Aβ42) oraz amyloid beta 40 (Aβ40). Peptydy te są znane ze swojej skłonności do agregacji i są zaangażowane w patogenezę choroby Alzheimera, co sprawia, że ich oczyszczanie stanowi istotne wyzwanie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biochemia
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wstęp
- Peptydy beta-amyloidowe są hydrofobowe i wykazują tendencję do agregacji.
- Oczyszczanie tych peptydów jest kluczowe dla badania ich roli w chorobie Alzheimera.
- Do badań nad tworzeniem się oligomerów niezbędne są peptydy o wysokim stopniu czystości.
- Istniejące metody oczyszczania mogą nie zapewniać wystarczającej czystości.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu oczyszczania metodą HPLC.
- Uzyskanie wysokiej czystości peptydów Aβ42 i Aβ40.
- Ułatwienie dalszych badań nad oligomerami beta-amyloidu.
Zastosowane metody
- Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
- Dostosowane protokoły oczyszczania
- Charakterystyka czystości peptydów
- Ocena zdolności do tworzenia oligomerów
Główne wyniki
- Skuteczne oczyszczanie peptydów Aβ42 i Aβ40.
- Wysoki poziom czystości uzyskany dzięki nowemu protokołowi.
- Wykazanie zdolności peptydów do tworzenia oligomerów.
- Skuteczność protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami.
Wnioski
- Dostosowany protokół HPLC jest skuteczny w oczyszczaniu peptydów.
- Wysokiej czystości peptydy beta-amyloidowe są niezbędne do badań nad chorobą Alzheimera.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych analiz oligomerów beta-amyloidu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Uzyskanie peptydów beta-amyloidu o wysokiej czystości stanowi krytyczne wąskie gardło w walidacji celów terapeutycznych w chorobie Alzheimera oraz w badaniach nad oligomeryzacją. Niniejszy protokół oczyszczania metodą HPLC umożliwia powtarzalną produkcję peptydów Aβ42 i Aβ40 o czystości >95%, co wspiera wiarygodne testy tworzenia oligomerów. Metoda ta zapewnia skalowalne, zestandaryzowane podejście do ograniczania ryzyka w badaniach nad zaangażowaniem celu i badaniach mechanistycznych w procesie odkrywania leków na choroby neurodegeneracyjne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów oligomeryzacji beta-amyloidu z wykorzystaniem peptydów o wysokiej czystości.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalny materiał peptydowy do spójnych testów walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera badania korelacji struktura-funkcja, niezbędne do potwierdzenia wiarygodności celu w programach badawczych nad chorobą Alzheimera.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie oczyszczonych peptydów odpowiednich do testów oligomeryzacji i wiązania.
- Powtarzalność: Zapewnia spójność między partiami w ramach kampanii wysokoprzepustowych przesiewów.
- Skalowalność: Możliwość dostosowania do skali analitycznej i półpreparatywnej w zależności od zapotrzebowania na ilość peptydów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Pozwala na generowanie peptydów, które odwzorowują kluczowe gatunki patologiczne w modelach choroby Alzheimera.
- Ciągłość translacyjna: Łączy produkcję peptydów na etapie odkryć z przedklinicznymi badaniami toksyczności oligomerów.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza zmienność odczytów tworzenia oligomerów, zwiększając pewność prognostyczną.
Integracja potoków i przepływów pracy
Protokół ten wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, dostarczając zwalidowanych odczynników peptydowych do testów oddziaływania z celem, oligomeryzacji oraz toksyczności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków agregacji amyloidu beta z wykorzystaniem czystych wzorców peptydowych.
- Opracowywanie testów: Umożliwia przygotowanie spójnych odczynników do testów tworzenia oligomerów i wiązania przeciwciał.
- Analityka: Dostarcza mierzalne, wysokiej czystości materiały wejściowe do HPLC, spektrometrii masowej i charakterystyki biofizycznej.
- Badania translacyjne: Łączy oczyszczanie peptydów z późniejszymi modelami oligomeryzacji i toksyczności komórkowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę oczyszczania wielokrotnego użytku dla wielu izoform amyloidu beta w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Peptydy o wysokiej czystości umożliwiają wiarygodne badania oligomeryzacji oraz wyjaśnienie mechanizmu działania celu.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowana metoda HPLC zapewnia powtarzalność i zmniejsza odsetek niepowodzeń w procesie oczyszczania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję szumu biologicznego w testach oligomeryzacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów terapeutycznych w chorobie Alzheimera z uwzględnieniem ryzyka dzięki spójnej jakości peptydów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w opracowywaniu metod HPLC oraz w pracy z peptydami.
- Wymagany jest dostęp do systemów preparatywnego HPLC z kolumnami PLRP-S i detekcją dwufalową.
- Wymagane są ustandaryzowane protokoły przygotowywania buforów i rozpuszczania próbek.
- Należy uwzględnić konieczność adaptacji metody w zależności od ilości peptydów i progów czystości.
- Metoda jest ograniczona przez rozpuszczalność i tendencję do agregacji peptydów beta-amyloidu w warunkach oczyszczania.
