Name: Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych. To podejście umożliwia prostą analizę transportu błonowego w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Ricardo Dolmetschowi (Stanford University School of Medicine; obecna afiliacja: Novartis Institutes for Biomedical Research) za pomoc w opracowaniu tej analizy oraz Dr. Matthew Woodowi, Takumie Aiharze i Dongsook Kimowi za ich krytyczne odczytanie manuskryptu.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tsukuba (IACUC).
1. Sekcja
<ol>
	<li>Aby przygotować płody ICR lub C57BL/6 w dniu 13-14 embrionalnym, należy poddać eutanazji ciężarne myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Usuń macicę i włóż ją na szalkę Petriego ze zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS). Dobrze spłucz, aby usunąć krew.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś macicę na nową szalkę Petriego z 70% etanolem w celu sterylizacji.</li>
	<li>Przenieś macicę na nową szalkę Petriego za pomocą HBSS. Usuń płody z macicy za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych i nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Odetnij głowę płodowi za pomocą nożyczek chirurgicznych. Umieść je na nowej szalce Petriego z HBSS.</li>
	<li>Usuń skórę i czaszkę i wyjmij mózgi za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych. Umieść je na szalce Petriego z HBSS. 
	UWAGA: Od tego kroku najlepiej jest przeprowadzać zabieg na czystej ławce.</li>
	<li>Usuń opony mózgowe za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych pod mikroskopem stereoskopowym. Odetnij zwoje podstawy, hipokamp i móżdżek za pomocą kleszczy. Za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką przenieś korę na nową szalkę Petriego za pomocą HBSS.</li>
	<li>Zbierz całą korę za pomocą jednorazowego zakraplacza lub pipety o pojemności 25 ml. Umieścić je w probówce o pojemności 15 ml, a następnie usunąć HBSS za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu enzymu kory mózgowej do probówki zawierającej korę. Umieścić probówkę w łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. 
	UWAGA: Przygotuj enzym do hodowli kory mózgowej składający się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,25% trypsyny i 1 mM EDTA. Sterylizuj filtrem 0,22 μm.</li>
	<li>Dodać kolejne 3 ml roztworu enzymów kory mózgowej do probówki zawierającej korę mózgową i inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez dodatkowe 5 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór enzymu kory mózgowej za pomocą pipety o pojemności 5 ml i dodać 5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Oddzielić korę, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml ze sterylną końcówką P1000. Ponownie odpipetować za pomocą pipety o pojemności 5 ml z końcówką P200.</li>
	<li>Umieść nylonowe sitko o pojemności 40 μm na probówce o pojemności 50 ml i przefiltruj zawiesinę, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Wirować przy 420 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć pożywkę DMEM.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki do hodowli kory mózgowej i delikatnie zawiesić osad komórkowy. 
	UWAGA: Przygotuj pożywkę hodowlaną kory mózgowej składającą się z podłoża podstawowego neuronów uzupełnionego 1x suplementami B-27, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny streptomycyny.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek (w razie potrzeby) za pomocą pożywki do hodowli kory mózgowej.</li>
	<li>Płytka 3.0 × 106 neuronów korowych w 2,0 ml na powlekane naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. 
	UWAGA: Przed posiewem pokryj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 0.1 mg/ml bromowodorkiem poli-D-lizyny (PDL) lub 0.01% poli-L-ornityną (PLO). Inkubować przez 3 godziny – O/N w temperaturze 37 °C i przemywać PBS co najmniej 3 razy.</li>
</ol>
2. Obrazowanie ruchliwości pęcherzyków
<ol>
	<li>Przygotuj plazmidy, które oznaczą każdy rodzaj pęcherzyka. Na przykład użyj EGFP-Rab5 dla wczesnych endosomów, EGFP-Rab7 dla późnych endosomów, LAMP-EGFP dla lizosomów i EGFP-LC3 dla autofagosomów8,13. 
	UWAGA: Te plazmidy są dostępne na żądanie w tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Zazwyczaj, 3-5 dni neurony in vitro (DIV) mogą być transfekowane tymi plazmidami za pomocą odczynników do transfekcji.</li>
	<li>Zmieszać 4,0 μg plazmidów z 200 μl pożywki bez surowicy przez pipetowanie. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) w 200 μl pożywki wolnej od surowicy. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmieszać roztwór plazmidu i roztwór regenta do transfekcji w kroku 2.2 przez pipetowanie. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać pożywkę bez surowicy i 400 μl roztworu plazmidu z kroku 2.3 do każdego powlekanego naczynia ze szklanym dnem. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 30 minut. Zastąp pożywkę 2 ml pożywki do hodowli kory mózgowej. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 1-2 dni.</li>
	<li>Po 1 - 2 dniach transfekcji wybierz transfekowane komórki do akwizycji obrazu. 
	UWAGA: Wcześniaki neuronów poniżej 7 DIV mają tendencję do wykazywania dynamicznej ruchliwości pęcherzyków. Wybierz neurony, które umiarkowanie wyrażają sondę fluorescencyjną, ponieważ nie można uzyskać wyraźnych obrazów, gdy wybrany jest neuron o wysokiej ekspresji. Wybierz również typowy kształt neuronu, taki jak neurony piramidowe, które mają długie aksony i skomplikowane dendryty, aby ułatwić identyfikację aksonu i dendrytów (patrz ryc. 1A).</li>
	<li>Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania poklatkowego: 
	Do obrazowania należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD (Charge-Coupled Device) z soczewkami obiektywowymi 40X Plan Apo 0.95NA lub 100X Plan Apo VC NA1.4. Kontrolować temperaturę 37 °C za pomocą systemu inkubacji. Rejestruj obrazy neuronów w jednej klatce/5 s przez okres 100 sekund kontrolowany przez oprogramowanie do akwizycji obrazu. Alternatywnie, rejestruj obrazy w krótszych odstępach czasu i przez dłuższy czas, na przykład z jedną klatką na 2 s w okresie 300 sekund. 
	UWAGA: Dostępnych jest wiele aplikacji do wykonywania zdjęć sekwencyjnych, z których wiele nadaje się do tej metody. Dlatego nie zaleca się żadnej konkretnej aplikacji; Zamiast tego każdy badacz powinien korzystać z dowolnej dostępnej aplikacji.</li>
</ol>
3. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz wszystkie sekwencyjne obrazy w oprogramowaniu ImageJ z ręcznym śledzeniem14. 
	UWAGA: Do tej pory ręczne śledzenie było szeroko stosowane w eksperymentach ze śledzeniem15,16,17,18,19. Śledzenie ręczne zostało opracowane przez dr Fabrice'a Cordelièresa. Szczegółowe instrukcje w formie pisemnej są dostępne online20. Na potrzeby analizy jakość danych obrazowych poprawia się dzięki wystarczającej liczbie obrazów. Zaleca się użycie więcej niż 20 obrazów.</li>
	<li>Aby połączyć obrazy sekwencyjne, wybierz opcję <Obraz> → <Stosy> → <Obrazy do stosu>. Kliknij przycisk <OK>.</li>
	<li>Wybierz <Wtyczki> → <Ręczne śledzenie> pojawi się okno śledzenia.</li>
	<li>Kliknij pole wyboru <Pokaż parametry?> i zdefiniuj parametry śledzenia w sekcji parametrów. 
	UWAGA: Można ustawić kilka parametrów, w tym interwał czasowy, kalibrację x/y, kalibrację z, rozmiar kwadratu wyszukiwania do wyśrodkowania, rozmiar kropki, szerokość linii i rozmiar czcionki. W tym uproszczonym teście zdefiniowano zarówno przedział czasowy, jak i kalibrację x/y. W innych warunkach eksperymentalnych może być konieczne zdefiniowanie również innych parametrów. Stosowane tutaj parametry są następujące: <Przedział czasowy> wynosi 5 s, a kalibracja <x/y> wynosi 0,26642 μm dla obiektywu 40X Plan Apo 0,95NA lub 0,10657 μm dla soczewki obiektywowej 100X Plan Apo VC NA1.4.</li>
	<li>Po zdefiniowaniu parametrów kliknij <dodaj ścieżkę> aby rozpocząć nową ścieżkę.</li>
	<li>Po określeniu interesujących pęcherzyków (np. pęcherzyków oznaczonych niebieskimi i czerwonymi grotami strzałek na rysunku 1A (prawy panel)), kliknij środek sygnałów na sekwencyjnych obrazach, aby zapisać współrzędne xy. Wyniki zarejestrowanych współrzędnych xy, odległości i prędkości pojawiają się w nowym oknie. 
	UWAGA: W przypadku lizosomów w neuronach często obserwuje się duże jasne sygnały fluorescencyjne (np. Rysunek 1A (prawy panel), pomarańczowy grot strzałki). Ponieważ sygnały te czasami wykazują nagromadzone pęcherzyki lub patologiczne żylaki, należy unikać tych sygnałów w celu ilościowego określenia ruchliwości.</li>
	<li>Powtórz krok 3.6, aby zebrać współrzędne xy pęcherzyków ze wszystkich kolejnych obrazów; każdy obraz automatycznie przechodzi do kolejnego obrazu po wybraniu punktu odniesienia.</li>
	<li>Wyeksportuj te dane do nowej tabeli (np. arkusza kalkulacyjnego). Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby utworzyć odpowiedni wykres (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Aby przeanalizować dane, wybierz kolumnę <Odległość> zsumuj wszystkie wartości tej kolumny i pokaż odległość ruchliwości w postaci wykresu słupkowego, tak jak na rysunku 1B. Dodatkowo powtórz ten krok, oblicz średnią całkowitej odległości ruchliwości i pokaż jako wykres słupkowy, jak na rysunku 1C. Oprogramowanie do tworzenia wykresu słupkowego i danych falowych jest pokazane w tabeli materiałów.</li>
</ol>

<ol><li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li>
<li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra0910494">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li>
<li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+transport+along+the+lysosomal+pathway+in+mucolipidosis%2C+type+IV+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).</li>
<li>Venugopal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic%2C+gastric%2C+and+opthalmologic+pathologies+in+a+murine+model+of+mucolipidosis+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV.</a> Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+to+regulate+lysosome+motility+for+lysosome+positioning+and+tubulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation.</a> Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).</li>
<li>Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIKfyve+regulates+CaV1.2+degradation+and+prevents+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death.</a> J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).</li>
<li>Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIKfyve+mediates+the+motility+of+late+endosomes+and+lysosomes+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites.</a> Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).</li>
<li>McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3%2C5-bisphosphate%3A+low+abundance%2C+high+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance.</a> Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).</li>
<li>Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plentiful+PtdIns5P+from+scanty+PtdIns%283%2C5%29P2+or+from+ample+PtdIns%3F+PIKfyve-dependent+models%3A+Evidence+and+speculation+%28response+to%3A+DOI+10.1002%2Fbies.201300012%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012).</a> Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).</li>
<li>Chow, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Vac14%2C+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3%2C5-bisphosphate%2C+results+in+neurodegeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017).</li>
<li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102(2011).</li>
<li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105(2013).</li>
<li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li>
<li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails%3A+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Ecol%22%5BJournal%5D)">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li>
<li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790(2016).</li>
<li>Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf</a> (2017).</li>
<li>ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498(2013).</li>
<li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+solutions%3A+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten wprowadza procedurę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków. W neuronach pierwotnych endosomy i lizosomy wykazują tendencję do wykazywania wysokiej ruchliwości w młodszych neuronach (4-6 DIV). Biorąc pod uwagę, że neurony muszą dostarczyć pewne składniki do krawędzi natarcia, aby wydłużyć procesy neuronalne, transport błonowy powinien zachodzić dynamicznie na tym etapie. Dlatego ważne jest, aby używać młodszych neuronów do obserwacji dynamicznej ruchliwości dendrytów neuronalnych. Ponadto większe pęch...

Precyzyjna kontrola transportu endosomu z lizosomem jest niezbędna do regulacji funkcji neuronów. Warto zauważyć, że dynamiczne ruchy tych pęcherzyków są kluczowym czynnikiem leżącym u podstaw regulacji morfologii, rozwoju i przeżycia neuronów. Defekty w tym systemie powodują poważne zaburzenia neuronalne1,2. Mechanizmy molekularne, które łączą transport pęcherzyków z chorobami neuronalnymi, są uważane za skomplikowane, a kilka grup starało się zbadać to znaczenie. Na przykład doniesiono, że zaburzona późna ruchliwość endosomów jest istotnie związana z chorobą Niemanna-Picka C3, dziedziczną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną defektami lizosomów. Innym przykładem jest mutacja w lizosomalnym kanale Ca2+, trpml1, która upośledza ruchliwość lizosomalną, powodując lizosomalne choroby spichrzeniowe4,5,6. Nasza grupa poinformowała, że rozregulowanie obrotu PtdIns(3,5)P2 hamuje ruchliwość endosomów i lizosomów w neuronach, prowadząc do wzrostu podatności na reakcję na stres7,8. Regulacja metaboliczna PtdIns(3,5)P2, która głównie lokalizuje się na późnych endosomach i lizosomach, odgrywa ważną rolę w wielu różnych funkcjach komórkowych, w tym w transporcie pęcherzyków i procesach fuzji-rozszczepienia9,10. Ponieważ upośledzony obrót PtdIns(3,5)P2 powoduje ciężką neurodegenerację11,12, nieprawidłowa regulacja ruchliwości endosomu i lizosomów może być kluczowym czynnikiem dla zrozumienia patogenezy neurodegeneracji. Badanie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw ruchliwości pęcherzyków, może zatem dostarczyć obiecujących wskazówek, które mogą pogłębić naszą wiedzę na temat kilku zaburzeń neuronalnych.
W tym artykule przedstawiamy cenną metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą darmowego pakietu oprogramowania o nazwie Ręczne Śledzenie. Celem było opracowanie metody szybkiej kwantyfikacji do analizy ruchliwości pęcherzyków. Ta kwantyfikacja jest kierowana za pomocą standardowego podejścia polegającego na klikaniu punktu odniesienia w każdej klatce filmu poklatkowego. Korzystanie z oprogramowania do ręcznego śledzenia sprawia, że to podejście jest dość proste i ma szeroką użyteczność, w przeciwieństwie do innych aplikacji. Co więcej, podejście to ma również zastosowanie do innych komórek, takich jak komórki glejowe. Chociaż metoda ta jest prymitywna, można ją zastosować do różnych analiz, w tym ruchliwości komórek i zmian morfologicznych. Na przykład, po zdefiniowaniu punktu odniesienia w sekwencji obrazów, informacje o położeniu punktów odniesienia i czasie w każdej pozycji mogą być wydobyte z obrazów sekwencyjnych za pomocą oprogramowania do analizy danych i przetwarzania obrazów. Podsumowując, metoda ta jest prosta, ale skuteczna i przyczynia się do poprawy efektywności w badaniach opartych na transporcie błonowym, takich jak te badające funkcję endosom-lizosom.

<table><tbody><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td>Podłoże wolne od surowicy</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptmycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplementy</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2,5% trypsyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowe sitko</td> <td>do komórekCorning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Polietylenoimina "Max" (PEI)</td> <td>polysciences</td><td>24765</td><td>Odczynnik do transfekcji. Jako alternatywę dla Lipofectamine2000 dostępne jest 0,1 mg / ml polietylenoiminy rozpuszczonej w sterylizowanej wodzie. Ale jest to niska wydajność i wysoka toksyczność.</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>Keyence</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>System inkubacji INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism wersja 6.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel wersja 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ wersja 1.47</td><td></td><td>NA NA</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

W mózgu, systemy transportu błonowego odgrywają ważną rolę w regulacji funkcji neuronalnych, takich jak morfologia neuronów, plastyczność synaptyczna, przeżycie i komunikacja glejowa. Do tej pory liczne badania wykazały, że defekty w tych układach powodują różne choroby neuronalne. Tak więc zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw dynamiki pęcherzyków może dostarczyć ważnych wskazówek, które mogą pomóc w leczeniu kilku zaburzeń neuronalnych. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków, takich jak ruchliwość, odległość i szybkość ruchu, przy użyciu wtyczki programowej do platformy ImageJ. Aby uzyskać obrazy do kwantyfikacji, oznaczyliśmy neuronalne struktury endosomy-lizosomów białkami markerowymi pęcherzyków znakowanymi EGFP i obserwowaliśmy ruch pęcherzyków za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta jest bardzo przydatna i upraszcza pomiar ruchliwości pęcherzyków w neurytach, takich jak aksony i dendryty, a także w somie zarówno neuronów, jak i komórek glejowych. Ponadto metoda ta może być stosowana do innych linii komórkowych, takich jak fibroblasty i komórki śródbłonka. Takie podejście może stanowić cenny postęp w naszej wiedzy na temat transportu błonowego.

Niniejszy test został zaprojektowany w celu pomiaru dynamiki pęcherzyków w hodowli in vitro. Test ten wykorzystano do określenia ruchliwości pęcherzyków powiązanej z morfologią i przeżywalnością neuronów. Rysunek 1A oraz B przedstawiają reprezentatywne dane obrazujące ruchliwość lizosomów w neuronach. Neurony korowe przetransfekowano markerem lizosomów, LAMP-EGFP, a następnie obserwowano za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Wcze...

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Ogólnym celem tej analizy obrazowania jest obserwacja oraz łatwa kwantyfikacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Podejście to umożliwia analizę transportu błonowego w neuronach w prosty i efektywny czasowo sposób. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś macicę do nowej szalki Petriego z 70% ethanol.Następnie przenieś macicę do drugiej szalki Petriego z HBSS. Potem wyjmij płody z macicy, używając wysterylizowanej pincety anatomicznej i nożyczek chirurgicznych. Po tym umieść je w nowej szalce Petriego z HBSS.Pod mikroskopem stereoskopowym należy usunąć skórę oraz czaszki i wyjąć mózgi za pomocą wysterylizowanej pęsety sekcyjnej. Następnie przenieść je do innej szalki Petriego z HBSS. Usunąć opony mózgowe za pomocą wysterylizowanej pęsety sekcyjnej.Następnie odetnij nadmiarowe obszary. Potem przenieś korę do nowej szalki Petriego z HBSS. Zbierz całą korę za pomocą jednorazowej pipety zakraplającej lub pipety 25 ml i umieść ją w probówce 15 ml.Następnie usunąć HBSS za pomocą pipety. Potem dodać trzy mililitry roztworu enzymów kory mózgowej do probówki zawierającej korę. Umieścić probówkę w kąpieli wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut.Następnie dodaj kolejne 3 ml roztworu enzymów kory mózgowej do probówki zawierającej korę i inkubuj je w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez dodatkowe pięć minut. Po pięciu minutach usuń roztwór enzymów kory mózgowej i dodaj 5 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej. Rozdziel korę, delikatnie pipetując zawartość w górę i w dół za pomocą pipety 5 ml z jałową końcówką P1000.Następnie ponownie przepłucz korę, używając pipety 5 ml z końcówką P200. Umieść sitko komórkowe z nylonu o oczkach 40 µm na probówce 50 ml i przefiltruj zawiesinę w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie odwiruj zawiesinę z prędkością 420 ×g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a potem usuń medium DMEM.Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki do hodowli kory mózgowej i delikatnie resuspenduj pellet komórkowy. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj ich stężenie, używając pożywki do hodowli kory mózgowej. W dalszej kolejności wysiej 3 × 10⁶ neuronów korowych w dwóch mililitrach zawiesiny komórkowej do każdej z oznakowanych szklanych naczyń o dnie płaskim o pojemności 35 mililitrów.W tej procedurze należy zmieszać 4 µg plazmidu z 200 µL pożywki bezsurowiczej. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 8 µL odczynnika do transfekcji w 200 µL pożywki bezsurowiczej. Następnie inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej.Po pięciu minutach wymieszać roztwór plazmidu z roztworem odczynnika do transfekcji i inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść mieszaninę do kodowanych szalek z szklanym dnem. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Następnie zastąp pożywkę dwiema mililitrami pożywki do hodowli kory mózgu i inkubuj neurony w temperaturze 37 °C przez jeden do dwóch dni. Do obrazowania użyj mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD z obiektywem 40X. Utrzymaj temperaturę 37 °C przy użyciu systemu inkubacyjnego.Należy pozyskać obrazy neuronów, wykonując jedno ujęcie co pięć sekund przez okres 100 sekund za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu. Aby przeanalizować obrazy, otwórz wszystkie sekwencyjne ujęcia w programie ImageJ z wtyczką Manual Tracking. Aby połączyć obrazy sekwencyjne, wybierz Image, następnie Stacks, a potem Images to Stack i kliknij OK. Następnie wybierz Plugins, a potem Manual Tracking.Pojawi się okno śledzenia (Tracking). Zaznacz pole wyboru Pokaż parametry (Show Parameters) i zdefiniuj parametry śledzenia w sekcji Parametry (Parameters). Następnie kliknij Dodaj ścieżkę (Add track), aby rozpocząć nowe śledzenie.Po zidentyfikowaniu interesujących pęcherzyków należy kliknąć w centrum sygnałów na obrazach sekwencyjnych, aby zarejestrować współrzędne xy. Powtórz tę procedurę, aby zebrać współrzędne xy pęcherzyków ze wszystkich obrazów sekwencyjnych; każdy obraz automatycznie przechodzi do następnego po wybraniu punktu odniesienia. Ten obraz przedstawia ruchliwość pęcherzyków zawierających LAMP-EGFP w dendrytach neuronów korowych myszy po dwóch dniach od transfekcji, rozpoczętej w czwartym dniu in vitro (DIV).Wstawka przedstawia obraz poklatkowy pęcherzyków pozytywnych pod kątem LAMP-EGFP. Czerwona grot strzałki wskazuje poruszający się pęcherzyk, a niebieska grot strzałki wskazuje pęcherzyk w spoczynku. Pomarańczowe groty strzałek wskazują silniejsze sygnały fluorescencyjne.Poniżej przedstawiono pozycję na osi X w funkcji czasu dla pęcherzyków pozytywnych pod kątem LAMP-EGFP. Pęcherzyk w czerwonym okręgu, oznaczony literą b, przemieszcza się, natomiast pęcherzyk w niebieskim okręgu, oznaczony literą a, pozostaje w spoczynku. Ten wykres słupkowy wskazuje całkowity dystans przemieszczania się LAMP-EGFP.Ten wykres słupkowy przedstawia średni dystans przemieszczania się pęcherzyków zawierających LAMP-EGFP.

quantification-endosome-lysosome-motilities-cultured-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę kwantyfikacji ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych. To podejście umożliwia prostą analizę transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów