Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych
22 maja 2017
Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.
Ogólnym celem tej analizy obrazowej jest obserwacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach i łatwe jej ilościowe określenie. Takie podejście umożliwia analizę transportu błonowego w neuronach w prosty i efektywny czasowo sposób. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś macicę na nową szalkę Petriego z 70% etanolem.
Następnie przenieś macicę na inną szalkę Petriego za pomocą HBSS. Następnie usuń płody z macicy za pomocą wysterylizowanych kleszczy sekcyjnych i nożyczek chirurgicznych. Następnie umieść je na nowej szalce Petriego z HBSS.
Pod mikroskopem stereoskopowym usuń skórę i czaszki i wyjmij mózgi za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych. Następnie przenieś je na inną szalkę Petriego za pomocą HBSS. Usuń opony mózgowe za pomocą wysterylizowanych kleszczy preparacyjnych.
Następnie odetnij dodatkowe obszary. Następnie przenieś korę na nową szalkę Petriego za pomocą HBSS. Zbierz wszystkie korki za pomocą jednorazowego zakraplacza lub pipety o pojemności 25 mililitrów i umieść je w 15-mililitrowej probówce.
Następnie usunąć HBSS przez pipetowanie. Następnie dodaj trzy mililitry roztworu enzymu kory mózgowej do probówki zawierającej korę. Umieść probówkę w łaźni wodnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie dodaj kolejne trzy mililitry roztworu enzymów kory mózgowej do probówki zawierającej korę mózgową i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez dodatkowe pięć minut. Po pięciu minutach usunąć roztwór enzymu kory mózgowej i dodać pięć mililitrów DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej. Oddziel korę, delikatnie pipetując w górę iw dół za pomocą pięciomililitrowej pipety ze sterylną końcówką P1000.
Następnie ponownie pipetować korę mózgową za pomocą pięciomililitrowej pipety z końcówką P200. Umieść 40-mikrometrowe nylonowe sitko komórkowe na 50-mililitrowej rurce i przefiltruj zawiesinę, aby usunąć zanieczyszczenia. Następnie odwirować zawiesinę w ilości 420 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć pożywkę DMEM.
Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki do hodowli kory mózgowej i delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek za pomocą pożywki do hodowli kory mózgowej. Następnie połóż trzy razy 10 do sześciu neuronów korowych w dwóch mililitrach zawiesiny komórkowej dla każdego zakodowanego 35-mililitrowego szklanego naczynia
.W tej procedurze wymieszaj cztery mikrogramy plazmidu z 200 mikrolitrami pożywki bez surowicy. W oddzielnej probówce rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji w 200 mikrolitrach pożywki wolnej od surowicy. Następnie inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po pięciu minutach wymieszaj roztwór plazmidu i roztwór odczynnika do transfekcji i inkubuj mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj mieszaninę do zakodowanych naczyń ze szklanym dnem. Inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie zastąp pożywkę dwoma mililitrami pożywki do hodowli kory mózgowej i inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni. Do obrazowania należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD z soczewkami obiektywowymi 40X. Utrzymuj temperaturę na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą systemu inkubacji.
Rejestruj obrazy neuronów w jednej klatce co pięć sekund przez 100-sekundowy okres kontrolowany przez oprogramowanie do akwizycji obrazu. Aby przeanalizować obrazy, otwórz wszystkie sekwencyjne obrazy w oprogramowaniu ImageJ z ręcznym śledzeniem. Aby połączyć sekwencyjne obrazy, wybierz Obraz, następnie Stosy, a następnie Obrazy do stosu, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Wtyczki, a następnie Śledzenie ręczne.
Pojawi się okno Śledzenie. Kliknij pole wyboru Pokaż parametry i zdefiniuj parametry śledzenia w sekcji Parametry. Następnie kliknij Dodaj ścieżkę, aby rozpocząć nową ścieżkę.
Po określeniu interesujących pęcherzyków kliknij środek sygnałów na sekwencyjnych obrazach, aby zapisać współrzędne xy. Powtórz tę procedurę, aby zebrać współrzędne xy pęcherzyków ze wszystkich kolejnych obrazów, każdy obraz automatycznie przechodzi do kolejnego obrazu po wybraniu punktu odniesienia. Obraz ten pokazuje ruchliwość pęcherzyków zawierających LAMP-EGFP w dendrytach neuronów korowych myszy po dwóch dniach transfekcji, rozpoczętej przy czterech DIV.
Wstawka przedstawia poklatkowy obraz pęcherzyków dodatnich LAMP-EGFP. Czerwony grot strzałki oznacza poruszający się pęcherzyk, a niebieski grot strzałki wskazuje pęcherzyk spoczynkowy. Pomarańczowe groty strzałek wskazują wyższe sygnały fluorescencyjne.
Oto zależne od czasu położenie pęcherzyków dodatnich LAMP-EGFP w osi X. Pęcherzyk w czerwonym kółku, oznaczony b, porusza się, a pęcherzyk w niebieskim kółku, oznaczony a, odpoczywa. Ten wykres słupkowy pokazuje całkowitą odległość ruchu LAMP-EGFP.
A ten wykres słupkowy pokazuje średnią odległość ruchliwości pęcherzyków zawierających LAMP-EGFP.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę ilościowego oznaczania ruchliwości pęcherzyków w neuronach, co jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. Zaproponowane podejście umożliwia prostą analizę transportu błonowego w układzie nerwowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Transport błonowy
Wprowadzenie
- Transport błonowy ma kluczowe znaczenie dla funkcji neuronów.
- Mobilność pęcherzyków odgrywa kluczową rolę w tym procesie.
- Zrozumienie tych mechanizmów może dostarczyć wiedzy na temat stanu zdrowia neuronów.
- Obecne metody ilościowego oznaczania ruchu pęcherzyków są często złożone.
Cel badania
- Opracowanie wygodnej metody ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków.
- Ułatwienie analizy transportu błonowego w neuronach.
- Pogłębienie zrozumienia funkcji neuronów poprzez udoskonalenie metodologii.
Zastosowane metody
- Analiza obrazowania w celu obserwacji ruchliwości pęcherzyków.
- Przenoszenie próbek biologicznych do odpowiednich mediów w celu analizy.
- Użycie sterylnych narzędzi do manipulacji próbkami.
- Efektywne czasowo procedury ilościowe.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na łatwą kwantyfikację ruchliwości pęcherzyków.
- Zapewnia ona prosty sposób analizy transportu błonowego.
- Wyniki mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji neuronów.
- Potencjalne zastosowania w różnych obszarach badań nad neuronaukami.
Wnioski
- Ta metoda upraszcza badanie ruchomości pęcherzyków w neuronach.
- Można ją dostosować do różnych zastosowań w neuronauce.
- Dalsze badania mogą opierać się na tym podejściu w celu analizy stanu zdrowia neuronów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie ruchliwości pęcherzyków dostarcza kluczowych informacji na temat mechanizmów transportu błonowego, które wpływają na stan zdrowia neuronów oraz fenotypy chorobowe. Metoda ta umożliwia walidację celów na wczesnym etapie poprzez powiązanie dynamiki subkomórkowej z efektami funkcjonalnymi w modelach chorób neurodegeneracyjnych. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach przesiewowych przedklinicznych, zapewniając ilościowe i powtarzalne wyniki transportu pęcherzykowego w systemach neuronalnych istotnych dla analizowanych jednostek chorobowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar ruchliwości endosomów i lizosomów jako funkcjonalnych wskaźników stanu zdrowia neuronów.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki standaryzowanej kwantyfikacji ruchu pęcherzyków w modelach komórkowych istotnych dla danej choroby.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez korelację defektów ruchliwości ze ścieżkami mechanistycznymi w schorzeniach neuronalnych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych pomiarów dystansu i prędkości motywności do przesiewania związków w neurytach i somie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu dzięki śledzeniu w programie ImageJ z określonymi parametrami oraz obrazowaniu poklatkowemu.
- Skalowalność: Kompatybilność z wieloma typami komórek, w tym z fibroblastami i komórkami śródbłonka, co umożliwia ponowne wykorzystanie metody w różnych platformach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodna ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie dynamiki pęcherzyków z przeżywalnością neuronów i funkcją synaptyczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki spójnym odczytom ruchliwości w różnych modelach.
- Mitygacja ryzyka: Pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko poprzez identyfikację związków, które niwelują defekty transportu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, dostarczając ilościowych danych o motywności, które pozwalają ocenić stopień związania celu oraz modulację szlaków w układach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez kwantyfikację ruchu pęcherzyków jako funkcjonalnego odczytu integralności transportu błonowego.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie analizy dzięki standaryzowanym protokołom obrazowania i śledzenia dla zależnej od czasu analizy pęcherzyków.
- Analityka: Generuje wskaźniki dystansu motylowego i średniego ruchu, które pozwalają na analizę porównawczą w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez powiązanie defektów transportu pęcherzykowego z mechanizmami chorób neurodegeneracyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania, którą można zastosować w różnorodnych liniach komórkowych neuronalnych i nieneuronalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności w powiązaniach mechanistycznych między defektami transportu a fenotypami neuronalnymi.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki analizie opartej na wtyczkach oraz zdefiniowanym parametrom śledzenia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając obiektywnych, ilościowych danych na temat oddziaływania na cele w szlakach mobilności pęcherzyków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację związków modulujących dynamikę endosomów i lizosomów w modelach chorób.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli neuronów, transfekcji i mikroskopii fluorescencyjnej w celu dokładnego znakowania i obrazowania pęcherzyków.
- Zależne od platformy ImageJ z wtyczką Manual Tracking oraz możliwości sekwencyjnego przetwarzania obrazów.
- Wymaga standaryzacji wydajności transfekcji, odstępów czasowych obrazowania oraz parametrów śledzenia we wszystkich eksperymentach.
- Adaptacja do różnych linii komórkowych może wymagać optymalizacji ekspresji markerów i pomiarów bazowych ruchliwości.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od wydajności transfekcji oraz potencjalną fototoksyczność podczas przedłużonego obrazowania time-lapse.
