Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ogólnym celem tej eksperymentalnej strategii jest zidentyfikowanie odrębnych zespołów funkcjonalnych, w które białko może być zaangażowane, poprzez biodrową elektroforezę w natywnym żelu poliakrylamidowym, frakcjonowanie oczyszczonych kompleksów białkowych o powinowactwie i profilowanie korelacji spektrometrii mas. Ta metoda może pomóc w dodaniu informacji organizacyjnych do list białek generowanych przez masowe eksperymenty spektrometryczne z oczyszczaniem powinowactwa. Głównymi zaletami tej procedury jest to, że jest prosta do wykonania, ma dobrą rozdzielczość i zajmuje niewiele więcej pracy niż konwencjonalny żelowy CMSMS.

Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych od 200 do 500 milionów komórek wyrażających endogenne poziomy białka znakowanego flagą. Po rozmrożeniu osadu komórkowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodaj pięć mililitrów lodowatego buforu do lizy zawierającego DTT i inhibitory proteazy do zawiesiny komórek i zawiruj, aby wymieszać. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.

Przenieść zawiesinę komórkową do homogenizatora w niskiej temperaturze. Lizuj komórki za pomocą 20 do 30 uderzeń, używając ciasnego tłuczka, aż nie będzie zauważalnej lepkości, a następnie przenieś homogenat do zimnych mikroprobówek wirówkowych. Po odwirowaniu probówek przenieś oczyszczony lizat do czystej zimnej probówki, pozostawiając około 50 mikrolitrów lizatu.

Zaoszczędź 35 mikrolitrów podwielokrotności lizatu, aby zmierzyć stężenie białka i monitorować oczyszczanie. Następnie usuń bufor z wcześniej przygotowanych koralików. Ponownie zawiesić kulki jednym mililitrem lizatu, a następnie wymieszać z resztą lizatu.

Inkubować mieszaninę na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Zbierz koraliki z boku rurki za pomocą magnesu. Zebrać 30 mikrolitrów podwielokrotności supernatantu i wyrzucić resztę.

Ponownie zawiesić kulki w 0,5 mililitra buforu IPP150, pipetując od czterech do sześciu razy. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej zimnej rurki. Następnie przemyj kulki trzykrotnie 0,5 mililitra natywnego buforu elucji FLAG.

Przy ostatnim praniu przenieś koraliki do nowej zimnej rurki. Dokładnie usuń bufor. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach po 200 mikrogramów na mililitr peptydu 3X5 w natywnym buforze elucyjnym.

Następnie inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut z delikatnymi obrotami. Zbierz kulki za pomocą magnesu i przenieś supernatant do zimnej nowej probówki. Powtórz ten krok dwa razy przed pobraniem wszystkich eluatów.

Zagęścić eluat do 25 mikrolitrów w odśrodkowym zespole filtrującym przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj próbkę, dodając 4X natywny bufor ładujący próbkę i 0,5% dodatku do próbki G-250 do 25 mikrolitrów skoncentrowanego eluatu. Załaduj próbkę i natywne markery masy cząsteczkowej, pozostawiając między nimi pustą studzienkę.

Następnie załaduj od 10 do 20 mikrolitrów 1X natywnego bufora ładującego próbkę do wszystkich pustych studzienek. Ostrożnie napełnij komorę katodową 200 mililitrami 1X natywnego ciemnoniebieskiego bufora katodowego PAGE, aby nie naruszyć próbek. Napełnij komorę anodową 550 mililitrami 1X natywnego bufora anody PAGE.

Uruchom żel przy napięciu 150 woltów przez 30 minut. Po zatrzymaniu biegu usuń ciemnoniebieski bufor katodowy za pomocą pipety serologicznej i zastąp go 1X jasnoniebieskim buforem katodowym. Po kontynuowaniu pracy przez 60 minut otwórz kasetę z żelem i wyrzuć jedną z płytek kasety.

Żel pozostaje przymocowany do drugiej płytki kasety. Umieść żel na tacy zawierającej wystarczającą ilość roztworu utrwalającego, aby go przykryć, i inkubuj przez 30 minut, delikatnie wstrząsając. Następnie usuń roztwór utrwalający i zastąp go wodą przed zeskanowaniem żelu.

Aby przygotować się do spektrometrii mas, najpierw umieść stożkową płytkę 96-dołkową na innej płytce 96-dołkowej, aby zebrać odpady. Przebij dno studzienek stożkowej płytki dołkowej 96 dołków za pomocą igły o rozmiarze 21. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 50% acetonitrylu, 0,25% kwasu mrówkowego do dołków przebitej płytki.

Inkubować stos płytek w wytrząsarce przez 10 minut. Następnie odwirować płytkę o temperaturze 500 razy G przez jedną minutę, aby ciecz przepłynęła przez otwory do płytki do zbierania odpadów. Po dwukrotnym powtórzeniu kroków mycia napełnij studzienki przebitej 96-dołkowej płytki 150 mikrolitrami 50-milimolowego wodorowęglanu amonu.

Następnie umieść żel na czystej powierzchni. Pas zawierający próbkę należy podzielić na 48 identycznych fragmentów. Pokrój każdy plasterek na dwa lub trzy mniejsze kawałki, z wyjątkiem ostatnich pięciu plasterków na górze żelu.

Umieść każdą kromkę kolejno w jednym dołku z przebitym końcem umytej płytki 96-dołkowej. Dodaj 50 mikrolitrów acetonitrylu do każdej studzienki i inkubuj płytkę, wstrząsając przez 30 do 60 minut. Po usunięciu cieczy przez odwirowanie dodaj 200 mikrolitrów dwumilimetrowego TSEB i 50-milimolowego wodorowęglanu amonu do każdej studzienki.

Inkubować płytkę, wstrząsając przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć płyn przez odwirowanie, jak poprzednio. Odwodnić kawałki żelu, dodając 200 mikrolitrów czystego acetonitrylu i inkubować, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aż kawałki żelu staną się białe i nieprzezroczyste. Po usunięciu acetonitrylu dodaj 150 mikrolitrów trypsyny w zimnym wodorowęglanie amonu do każdej studzienki.

Inkubować płytkę, wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie umieść czystą stożkową płytkę dolną pod płytką zawierającą żel, zapewniając prawidłową orientację płytek. Następnie zebrać płyn zawierający peptydy przez odwirowanie w ilości 200 razy G przez jedną minutę.

Umieść płytkę zawierającą peptydy w parowniku odśrodkowym i odparuj ciecz, wykonując następny krok. Dodaj 150 mikrolitrów 50% acetonitrylu, 0,25% kwasu mrówkowego do kawałków żelu. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Zebrać płyn na częściowo wysuszoną płytkę przez odwirowanie w ilości 200 razy G przez jedną minutę. Kontynuuj odparowywanie peptydów zawierających płytkę, wykonując następny krok. Przenieść roztwory peptydów na umytą odśrodkową płytkę filtracyjną.

Umieść pod nią czystą, stożkową płytkę dolną, aby zebrać peptydy i odwirować stos płytek jak poprzednio. Odparuj ciecz w stożkowej płycie dolnej, aż studzienki całkowicie wyschną. Po wyschnięciu płytkę można przykryć silikonową pokrywką i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu wykonania spektrometrii mas i analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Reprezentatywne wyniki hierarchicznego grupowania niebieskich natywnych profili migracji PAGE Mta2 i białek kooczyszczających przedstawiono tutaj w postaci dendrogramu i mapy cieplnej reprezentującej intensywność białek. Profil migracji Mta2 pokazuje dwa piki wskazujące na dwa odrębne kompleksy. Niektóre podjednostki NuRD wykazują podobny wzorzec z największą obfitością w zespole o niższej masie cząsteczkowej.

Natomiast inne podjednostki NuRD są bardziej obfite w zespole NuRD o większej masie cząsteczkowej. Z drugiej strony, interaktor Mta2, Cdk2ap1, jest obecny tylko w zespole NuRD o większej masie cząsteczkowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwa i pół dnia.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby wszystkie próbki i odczynniki trzymać na lodzie, aby uniknąć dysocjacji kompleksów białkowych. Procedura ta może być zastosowana do dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, pod warunkiem, że można je obejrzeć z pożywki powinowactwa przez konkurencyjne elucję w warunkach natywnych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak odwrotna lub sekwencyjna koimmunoprecypitacja w celu walidacji zidentyfikowanych podkompleksów.