Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ogólnym celem tej strategii eksperymentalnej jest rozdzielenie odrębnych kompleksów funkcjonalnych, w których może uczestniczyć białko, poprzez frakcjonowanie kompleksów białkowych oczyszczonych metodą powinowactwa za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) oraz profilowanie korelacyjne z wykorzystaniem spektrometrii mas. Metoda ta może pomóc w uzupełnieniu list białek generowanych w eksperymentach oczyszczania powinowactwem połączonego ze spektrometrią mas o informacje organizacyjne. Głównymi zaletami tej procedury są prostota wykonania, dobra rozdzielczość oraz fakt, że wymaga ona niewielkiego nakładu pracy w porównaniu do konwencjonalnego badania żelu metodą CMSMS.

Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych z 200 do 500 milionów komórek wykazujących endogenny poziom ekspresji białka z tagiem FLAG. Po rozmrożeniu osadu komórkowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy dodać do zawiesiny komórkowej pięć mililitrów schłodzonego w lodzie buforu do lizy zawierającego DTT i inhibitory proteaz, a następnie wymieszać poprzez delikatne kręcenie naczyniem. Zawiesinę należy inkubować w lodzie przez 10 minut.

Przenieś zawiesinę komórkową do schłodzonego homogenizatora typu down. Poddaj komórki lizie, wykonując od 20 do 30 pociągnięć ciasno dopasowanym tłuczkiem, aż do ustąpienia zauważalnej lepkości, a następnie przenieś homogenizat do schłodzonych probówek do mikrocentryfugi. Po odwirowaniu zawartości probówek, przenieś oczyszczony lizat do czystej, schłodzonej probówki, pozostawiając około 50 µL lizatu.

Odbierz 35 µL lizatu do oznaczenia stężenia białka i monitorowania procesu oczyszczania. Następnie usuń bufor z wcześniej przygotowanych kulek. Resuspenduj kulki w 1 mL lizatu, a następnie zmieszaj z pozostałą częścią lizatu.

Inkubować mieszaninę na rotatorze w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch godzin. Zebrać kuleczki na ściance probówki za pomocą magnesu. Pobrać 30 µL nadsączu, a resztę odrzucić.

Resuspenduj kulki w 0,5 ml buforu IPP150, pipetując roztwór od czterech do sześciu razy. Następnie przenieś zawiesinę do schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. W kolejnym kroku wypłucz kulki trzykrotnie, używając 0,5 ml natywnego buforu do elucji FLAG.

Po ostatnim przemyciu przenieść kuleczki do nowej schłodzonej probówki. Dokładnie usunąć bufor. Resuspendować kuleczki w 100 µL peptydy 3X5 w stężeniu 200 µg/mL w natywnym buforze elucyjnym.

Następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy łagodnym obracaniu. Zebrać kuleczki za pomocą magnesu, a nadsącz przenieść do nowej schłodzonej probówki. Powtórzyć ten krok dwukrotnie przed zebraniem wszystkich eluatów.

Skoncentruj eluat do objętości 25 µL w jednostce filtra wirowego poprzez wirowanie z prędkością 10 000 ×g w temperaturze 4 °C. Przygotuj próbkę, dodając 4X natywny bufor do ładowania próbek oraz 0,5% dodatek do próbek G-250 do 25 µL skoncentrowanego eluatu. Nałóż próbkę oraz natywne markery masy cząsteczkowej, pozostawiając między nimi pusty dołek.

Następnie w wszystkie puste dołki nanieś od 10 do 20 µL 1X natywnego buforu do ładowania próbek. Komorę katody ostrożnie napełnij 200 mL 1X natywnego ciemnoniebieskiego buforu katodowego do PAGE, aby nie zakłócić próbek. Komorę anody napełnij 550 mL 1X natywnego buforu anodowego do PAGE.

Prowadź elektroforezę w żelu przy napięciu 150 V przez 30 minut. Po zatrzymaniu procesu usuń ciemnoniebieski bufor katodowy za pomocą pipety serologicznej i zastąp go buforem katodowym 1X o jasnoniebieskim kolorze. Po kontynuowaniu elektroforezy przez kolejne 60 minut otwórz kasetę żelową i usuń jedną z płytek kasety.

Żel pozostaje przytwierdzony do drugiej płyty kasety. Umieść żel w kuwecie zawierającej wystarczającą ilość roztworu utrwalającego, aby go przykryć, i inkubuj przez 30 minut przy delikatnym wstrząsaniu. Następnie usuń roztwór utrwalający i zastąp go wodą przed przeskanowaniem żelu.

Aby przygotować próbki do spektrometrii mas, najpierw należy umieścić płytkę 96-dołkową z dnem stożkowym na drugiej płytce 96-dołkowej w celu zbierania odpadów. Przebić dno dołków płytki stożkowej igłą o rozmiarze 21 G. Następnie do dołków przebitej płytki dodać 200 µL 50% acetonitrylu z 0,25% kwasem mrówkowym.

Inkubuj stos płytek w wytrząsarce przez 10 minut. Następnie wiruj płytkę z prędkością 500 ×g przez jedną minutę, aby ciecz przepłynęła przez otwory do płytki zbiorczej na odpady. Po dwukrotnym powtórzeniu etapów płukania, napełnij dołki perforowanej płytki 96-dołkowej 150 µL 50 mM wodorowęglanu amonu.

Następnie umieść żel na czystej powierzchni. Podziel ścieżkę zawierającą próbkę na 48 identycznych plastrów. Każdy plaster potnij na dwa lub trzy mniejsze fragmenty, z wyjątkiem pięciu ostatnich plastrów u góry żelu.

Umieść kolejno każdy plasterek w jednym dołku przepastowanej i przemytej płytki 96-dołkowej. Do każdego dołka dodaj 50 µL acetonitrylu i inkubuj płytkę z wytrząsaniem przez 30 do 60 minut. Po usunięciu cieczy poprzez wirowanie, dodaj do każdego dołka 200 µL 2 mM TSEB oraz 50 mM wodorowęglanu amonu.

Inkubować płytkę z wytrząsaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć ciecz poprzez wirowanie, analogicznie jak wcześniej. Odwodnić fragmenty żelu, dodając 200 µL czystego acetonitrylu, i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aż fragmenty żelu staną się białe i nieprzezroczyste. Po usunięciu acetonitrylu, dodać do każdego dołka 150 µL trypsyny w zimnym wodorowęglanie amonu.

Inkubować płytkę wstrząsając w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie umieścić czystą płytkę z dnem stożkowym pod płytką zawierającą żel, dbając o prawidłową orientację płytek. Następnie zebrać ciecz zawierającą peptydy poprzez wirowanie przy 200 ×g przez jedną minutę.

Umieść płytkę zawierającą peptydy w ewaporatorze odwirującym i odparuj ciecz, wykonując jednocześnie kolejny krok. Dodaj 150 µL 50% acetonitrylu i 0,25% kwasu mrówkowego do fragmentów żelu. Inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Zbierz ciecz na częściowo wysuszoną płytkę poprzez wirowanie z prędkością 200 ×g przez jedną minutę. Kontynuuj odparowywanie z płytki zawierającej peptydy podczas wykonywania kolejnego kroku. Przenieś roztwory peptydów na wypłukaną płytkę do filtracji odśrodkowej.

Pod spodem należy umieścić czystą płytkę z dnem stożkowym w celu zebrania peptydów, a następnie odwirować stos płytek w taki sam sposób jak wcześniej. Odparować ciecz z płytki z dnem stożkowym, aż do całkowitego wyschnięcia dołków. Po wyschnięciu płytkę można przykryć silikonową pokrywką i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia spektrometrii mas i analizy danych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawione tutaj wyniki hierarchicznej analizy skupień profilów migracji Mta2 i białek współoczyszczanych w metodzie blue native PAGE ukazano w formie dendrogramu oraz mapy ciepła reprezentującej intensywność białek. Profil migracji Mta2 wykazuje dwa piki wskazujące na dwa odrębne kompleksy. Niektóre podjednostki NuRD wykazują podobny wzorzec z największą obfitością w kompleksie o niższej masie cząsteczkowej.

W przeciwieństwie do nich, inne podjednostki NuRD występują w większej ilości w kompleksie NuRD o wyższej masie cząsteczkowej. Z kolei białko Cdk2ap1, oddziałujące z Mta2, jest obecne wyłącznie w kompleksie NuRD o wyższej masie cząsteczkowej. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w dwa i pół dnia.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymywaniu wszystkich próbek i odczynników w lodzie, aby uniknąć dysocjacji kompleksów białkowych. Procedurę tę można zastosować do dowolnego białka docelowego, pod warunkiem że można je wyizolować z nośnika powinowactwa poprzez elucję konkurencyjną w warunkach natywnych. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak odwrócona lub sekwencyjna koimmunoprecypitacja, w celu walidacji zidentyfikowanych subkompleksów.