Name: Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania kompleksów białkowych z powinowactwa z użyciem Blue Native PAGE i profilowania korelacji masowej spektrometrii. Protokół umożliwia rozdzielenie interaktomów na odrębne kompleksy białkowe z dobrą rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust (WT098051).

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy zastosowanie oczyszczania powinowactwa, po którym następuje elektroforeza w postaci niebieskiego natywnego żelu w połączeniu z ilościową spektrometrią mas w celu rozdzielenia kompleksów białkowych. Podejście to oferuje metodę rozplątywania jednowymiarowych list interakcji białek w funkcjonalne zespoły białek.
Przedstawiamy metodę opartą na wykorzystaniu białek znakowanych epitopami. Jeśli jednak linia komórkowa wykazująca ekspresję znakowanego białka nie jest dostępna, alternatywą może być użycie przeciwciał przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, pod warunkiem, że dostępny jest peptyd umożliwiający osiągnięcie natywnej elucji konkurencyjnej. Ilość materiału wyjściowego i ilość kulek może wymagać modyfikacji w zależności od poziomu ekspresji białka docelowego. Zazwyczaj wykonujemy ten protokół z materiałem wyjściowym 2-5 x10 8 komórek, co jest wystarczające nawet w przypadku białek o niskim poziomie ekspresji. Skład buforu do lizy należy dobrać empirycznie, aby osiągnąć prawie całkowitą rozpuszczalność przynęty. Może to być trudne dla niektórych typów białek, w szczególności białek wiążących chromatynę lub błonowych. Alternatywne opcje obejmują zwiększenie ilości soli, pod warunkiem, że badany kompleks białkowy jest stabilny w wysokiej zawartości soli, lub zastosowanie sonikacji i/lub leczenia nukleazą w celu wiązania białek chromatyny 20,29. W przypadku białek błonowych wskazana może być zmiana detergentu na DDM lub digitoninę 30. W przypadku białek wiążących DNA przydatne jest włączenie nukleazy, takiej jak benzonaza, podczas etapu oczyszczania 20. Całkowite usunięcie kwasów nukleinowych zapewnia, że wykryte interakcje zachodzą między białkami i nie są pośredniczone przez DNA.
Kluczowym elementem, który należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tego podejścia, jest stabilność badanego kompleksu. Procedura jest długa i może polegać na zachowaniu kompleksu białkowego przez noc. Osiągnęliśmy duży sukces z dwoma kompleksami przebudowującymi chromatynę (D. Bode i M. Pardo, dane nie pokazane), ale to powinno zostać ocenione. W razie potrzeby etap oczyszczania powinowactwa może zostać skrócony.
Alternatywne techniki, które umożliwiają natywne frakcjonowanie, takie jak chromatografia wykluczania wielkości, są szeroko stosowane od ponad 50 lat do charakteryzowania kompleksów białkowych. My i inni wykazaliśmy, że rozdzielczość niebieskiej natywnej PAGE jest lepsza niż ta osiągnięta przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości 20,31,32,33. Kolejną zaletą niebieskiej natywnej PAGE jest to, że nie wymaga systemów chromatograficznych, które są drogie, ale raczej wykorzystuje sprzęt elektroforetyczny do białek, który jest szeroko rozpowszechniony w laboratoriach. Jeśli chodzi o czas pracy, metoda ta nie wymaga więcej pracy niż tradycyjne podejście geLC-MS/MS lub frakcjonowanie chromatograficzne offline. Jednak, podobnie jak w przypadku większości technik frakcjonowania, ma ona ograniczenie co do ich rozdzielczości. Kompleksy, które są bardzo jednorodne lub zbliżone pod względem masy i kształtu, mogą wykraczać poza rozdzielczość oferowaną przez niebieską natywną PAGE, a zatem opisany tutaj protokół może nie być uniwersalnie skuteczny w rozdzielaniu odrębnych kompleksów ze współdzielonymi podjednostkami. Zachęcające jest to, że udało nam się wydzielić dwa bardzo podobne kompleksy tetrameryczne dzielące trzy podjednostki (M. Pardo, rękopis w przygotowaniu).
Ponieważ spektrometria mas staje się coraz bardziej czuła, w próbkach AP-MS można wykryć nawet niewielkie ilości niespecyficznych interakcji i zanieczyszczeń. Zaprezentowane tutaj podejście może pomóc w rozróżnieniu rzeczywistych interaktorów od zanieczyszczenia tła w oczyszczaniu powinowactwa poprzez skupienie uwagi na białkach z pikami migracji, które zbiegają się ze szczytami migracji przynęty o wyższej masie cząsteczkowej niż białka monomeryczne.
Kilka grup wykorzystało techniki frakcjonowania, a następnie profilowanie korelacji białek w celu wyznaczenia kompleksów białkowych w skali komórkowej bez konieczności wcześniejszej izolacji 10,11,12,34. Może to jednak spowodować niepowodzenie w wykrywaniu oddziaływań substechiometrycznych. Włączenie etapu wzbogacania poprzez oczyszczanie powinowactwa może pomóc w przezwyciężeniu tego problemu. Opisane tutaj podejście powinno być ogólnie przydatne do badania topologii kompleksów białkowych i odkrywania wielu kompleksów, w których dane białko bierze udział w tym samym kontekście komórkowym. Strategia jest prosta i łatwa do wykorzystania w laboratoriach, które mogą nie mieć drogiego sprzętu do frakcjonowania chromatograficznego do rozdzielania kompleksów białkowych.

W komórkach większość białek spełnia swoje funkcje poprzez przejściowe interakcje białko-białko lub poprzez tworzenie stabilnych zespołów białkowych. Scharakteryzowanie interakcji białkowych ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia procesów komórkowych. Oczyszczanie powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas (AP-MS) jest jedną z najczęściej stosowanych strategii identyfikacji interakcji z białkami natywnymi. Znacząca poprawa możliwości instrumentów osiągnięta w ciągu ostatniej dekady sprawiła, że podejście to stało się niezwykle skuteczne. Ważne jest, aby zauważyć, że interakcje zidentyfikowane w eksperymentach AP-MS obejmują mieszankę bezpośrednich i pośrednich powiązań między przynętą a zdobyczą. Ponadto często białka biorą udział w kilku różnych kompleksach w tym samym kontekście komórkowym, które mogą pełnić różne role biologiczne, a zatem interakcje zidentyfikowane przez AP-MS mogą reprezentować mieszankę różnych zespołów białek lub jednostek funkcjonalnych. Nie jest możliwe uzyskanie takich informacji topologicznych a priori z jednowymiarowych list białek wygenerowanych przez proste eksperymenty AP-MS. Technika ta może być jednak dalej wykorzystywana do definiowania architektury kompleksów białkowych poprzez połączenie jej z jedną lub kilkoma metodami rozwiązywania tych zespołów.
W celu rozwiązania topologii interakcji białkowych zidentyfikowanych przez AP-MS, zastosowano kilka strategii. Jednym ze sposobów jest przeprowadzenie iteracyjnych eksperymentów AP-MS przy użyciu zdobyczy zidentyfikowanych w poprzedniej rundzie eksperymentów jako przynęty 1. Chociaż jest to bardzo pouczające, jest to dość pracochłonne zadanie zarówno eksperymentalnie, jak i analitycznie. Sieciowanie białek w połączeniu ze spektrometrią mas jest coraz częściej wykorzystywane do uzyskiwania informacji topologicznych o kompleksach białkowych 2,3,4,5. Jednak analiza obliczeniowa usieciowanych peptydów nadal pozostaje trudnym zadaniem, a zatem stanowi wąskie gardło w przepływie pracy. Pojawienie się odczynników sieciujących MS powinno ułatwić mapowanie reszt aminokwasowych, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie w oddziałujących białkach 6,7. Inną alternatywą jest połączenie oczyszczania powinowactwa z wcześniejszymi technikami separacji ortogonalnej 8,9. Frakcjonowanie chromatograficzne za pomocą filtracji żelowej lub wymiany jonowej lub frakcjonowanie gradientowe sacharozy są ostatnio stosowane w połączeniu z ilościową spektrometrią mas do opisywania kompleksów wielobiałkowych na poziomie całego systemu, z pominięciem etapu izolacji złożonej 10,11,12,13. Elektroforeza w monoforze w monochromii poliakrylamidowej (BN-PAGE) jest szeroko stosowana do badania interakcji z białkami natywnymi, zazwyczaj z udziałem kompleksów białek błony mitochondrialnej 14. Ta technika separacji została również niedawno wykorzystana w połączeniu z bezznacznikową kwantyfikacją białek i profilowaniem korelacji, nie tylko na kompleksach mitochondrialnych 15,16,17, ale także do odkrywania innych kompleksów białkowych z całych komórek 18,19. Postawiliśmy hipotezę, że połączenie oczyszczania powinowactwa z późniejszymi natywnymi podejściami do frakcjonowania i ilościowym MS powinno zapewnić użyteczną strategię rozwiązywania wielu zespołów białkowych zawierających określone białko.
Tutaj opisujemy metodę, która łączy ogólne oczyszczanie powinowactwa oparte na epitopach z niebieską natywną elektroforezą w żelu poliakrylamidowym izolowanych kompleksów, a następnie ilościową spektrometrią mas i profilowaniem korelacji białek, w celu rozwiązania wielu zespołów, w które białko może być zaangażowane. Wykorzystujemy mysie embrionalne komórki macierzyste, w których białko będące przedmiotem zainteresowania połączone ze znacznikiem epitopu ulega ekspresji z endogennego locus, aby osiągnąć liczebność bliską fizjologicznej i zapewnić wydajną natywną izolację kompleksu. Takie podejście odkrywa wiele interakcji, w które angażuje się białko, rozkładając je na odrębne zespoły w oparciu o ich profile korelacji, nie wymagając przy tym więcej pracy niż konwencjonalny geLC-MS 20.

<table><tbody><tr><td>Białko G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG przeciwciało M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, klasa białkowa, 10% roztwór</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>dimetylopimelimidan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Bufor trietanoloaminy, pH 8,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x peptyd FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Technologie dodawania katodowego</td><td></td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x Bufor ładowania próbki NativePAGE</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>Dodatek do próbki NativePAGE 5% G-250&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc stożkowa płyta 96-dołkowa z dnem, polipropylen</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS 96-dołkowy system filtracji</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-well cap naturalny</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, klasa sekwencjonowania</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (oprogramowanie)</td> <td>nie dotyczy</td><td>Nie</td> dotyczy<td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (oprogramowanie)</td><td>N.A.</td><td>Nie</td> dotyczy<td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą blue native page i profilowania korelacji białek

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Większość białek działa w połączeniu z innymi; dlatego kluczowe jest scharakteryzowanie tych jednostek funkcjonalnych, aby w pełni zrozumieć procesy biologiczne. Oczyszczanie powinowactwa sprzężone ze spektrometrią mas (AP-MS) stało się metodą z wyboru do identyfikacji interakcji białko-białko. Jednak konwencjonalne badania AP-MS dostarczają informacji na temat interakcji białek, ale informacje organizacyjne są tracone. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy strategię odkrywania odrębnych zespołów funkcjonalnych, w które może być zaangażowane białko, poprzez rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa przed ich scharakteryzowaniem za pomocą spektrometrii mas. Kompleksy białkowe wyizolowane przez oczyszczanie powinowactwa białka przynęty za pomocą znacznika epitopowego i elucji konkurencyjnej są rozdzielane za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy. Porównanie profili migracji białek poprzez profilowanie korelacji przy użyciu ilościowej spektrometrii mas pozwala na przypisanie oddziałujących białek do odrębnych jednostek molekularnych. Metoda ta jest w stanie rozwiązać kompleksy białkowe o bliskiej masie cząsteczkowej, które mogą nie zostać rozwiązane za pomocą tradycyjnych technik chromatograficznych, takich jak filtracja żelowa. Mając niewiele więcej pracy niż konwencjonalny AP-geLC-MS/MS, wykazaliśmy, że strategia ta może w wielu przypadkach być wystarczająca do uzyskania informacji topologicznych kompleksu białkowego jednocześnie do identyfikacji interakcji białkowych.

Przebieg strategii powinowactwa do oczyszczania białek w natywnych warunkach z wykorzystaniem barwnika Blue i profilowania korelacyjnego białek metodą spektrometrii mas (ABC-MS) przedstawiono na Ryc. 7. Natywne kompleksy białkowe wokół białka docelowego są izolowane poprzez oczyszczanie powinowactwa z użyciem przeciwciał przeciwko znacznikowi epitopowemu (w tym przypadku FLAG) oraz elucji konkurencyjnej. Kompleksy są rozdzielane za pomocą BN-PAGE, a cała ścieżka żelu jest wycinana na 48 sekcji i przygotowywana do analizy shotgun LC-MS/MS. Ilościowe dane MS są wykorzystywane do wygenerowania profilu migracji dla każdego zidentyfikowanego białka w trakcie rozdzielania w natywnych warunkach z użyciem barwnika Blue. Białka oddziałujące ze sobą w celu utworzenia wyraźnego kompleksu wykazują podobne profile migracji z nakładającymi się piktami. Gdy białko docelowe uczestniczy w więcej niż jednym zgrupowaniu, w jego profilu migracji obserwuje się wiele piktów, pod warunkiem że subkompleksy mieszczą się w granicach rozdzielczości żelu BN-PAGE. Systematyczne porównanie profili migracji można przeprowadzić za pomocą profilowania korelacyjnego białek z wykorzystaniem grupowania hierarchicznego. Dendrogram oraz intensywności piktów dla wszystkich frakcji są wizualizowane na mapie ciepła, co ułatwia identyfikację oddziałujących białek należących do odrębnych kompleksów białkowych (Ryc. 8).
Strategię tę zastosowaliśmy do analizy partnerów oddziałujących z Mta2, główną podjednostką kompleksu przebudowy chromatyny NuRD 20. Jak pokazano na Rysunku 9, profil migracji Mta2 wykazał dwa piki o różnej intensywności w zakresie od 700 kDa do 1,2 MDa, przy czym pik o niższej masie charakteryzował się większą obfitością. Inne główne podjednostki NuRD, w tym Mta1/3, Hdac1/2 i Mbd3, wykazały identyczny wzór rozdzielenia, choć piki dla niektórych podjednostek, a mianowicie Chd4, Gatad2a/b i Rbbp4/7, miały odwrotny rozkład obfitości (Rysunek 9A, B). W przeciwieństwie do nich, profil Cdk2ap1, czynnika regulacyjnego rekrutującego kompleks NuRD do promotorów genów Wnt 23, wykazał jedynie pik o wyższej masie (Rysunek 9C), podobnie jak Sall4, represor transkrypcyjny, o którym wykazano, że również wiąże się z NuRD 20,24,25. Zatem frakcjonowanie białek związanych z Mta2, oczyszczonych metodą powinowactwa, za pomocą BN-PAGE pozwoliło na rozdzielenie dwóch różnych form kompleksu NuRD.
Metoda ABC-MS pozwala również na identyfikację nowych interaktorów przy jednoczesnym przypisaniu ich do konkretnych jednostek białkowych. Poprzez analizę klastrów białek i intensywności frakcji przedstawionych na mapie ciepła wykryliśmy silną korelację między podjednostkami NuRD a Wdr5, podjednostką regulacyjną kompleksu metylotransferazy MLL 26, przy czym Wdr5 wykazywał dwa piki migracji pokrywające się z dwoma pikami NuRD (Rysunek 8), co sugeruje nową interakcję między Wdr5 a NuRD. Potwierdziliśmy tę interakcję za pomocą koimmunoprecypitacji oraz ko-migracji w chromatografii wykluczania cząsteczkowego 20.
Wybór metody obliczania miary odległości w klastrowaniu hierarchicznym wpłynie na kształt klastrów, a tym samym na korelacje. Zalecamy eksperymentowanie z różnymi miarami w celu uzyskania najlepszego dopasowania do istniejącej wiedzy o oddziaływaniach badanego białka lub kompleksu. Zazwyczaj najlepsze wyniki uzyskiwaliśmy przy zastosowaniu miary odległości Manhattan (L1) 20. W publikacjach dotyczących identyfikacji kompleksów w oparciu o alternatywne techniki frakcjonowania zgłaszano również wykorzystanie korelacji Pearsona lub miary odległości euklidesowej 10,11,12.
Ilościowe dane MS uzyskane z frakcji nieodnaturalniających (blue native) mogą być również wykorzystane do określenia stechiometrii kompleksów białkowych. Wartość iBAQ (ilościowe określanie zawartości na podstawie intensywności) zapewnia miarę względnej obfitości zidentyfikowanych białek 27,28. Wartości iBAQ dla członków kompleksu białkowego we wszystkich frakcjach w obrębie piku profilu migracji są normalizowane do wartości białka przynęci (bait protein) w celu uzyskania ilości względnych. Znormalizowane wartości iBAQ w obrębie piku profilu dla danego członka kompleksu białkowego powinny wykazywać trend poziomy, a wartości tego trendu odzwierciedlają stechiometrię oddziałujących białek w stosunku do białka przynęci. Bardziej szczególną reprezentację obliczeń stechiometrii przedstawiono w 20.
<img alt="Schemat procesu BN-PAGE i LC-MS/MS; analiza separacji i identyfikacji białek." src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Schematyczny przebieg postępowania podsumowujący strategię ABC-MS. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie 20. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapa ciepła oddziaływań białkowych przedstawiająca gradient intensywności; znaczniki kDa; analiza danych frakcji BN." src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Grupowanie hierarchiczne profili migracji w BN-PAGE interaktorów Mta2. Białka powiązane z Mta2 zostały zgrupowane na podstawie podobieństwa ich profili migracji. Przedstawiono jedynie podzbiór mapy ciepła zawierający kompleks NuRD (obramowany niebieską ramką). Żółta ramka wyróżnia silną korelację Wdr5 z kompleksem NuRD. Adnotowane masy cząsteczkowe oszacowano na podstawie dystansów migracji standardów białkowych przeprowadzonych w tym samym żelu. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for Biochemistry and Molecular Biology. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy intensywności białek pokazujące oddziaływania Mta2 w frakcjach BN; schematy A, B, C porównują dane." src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Profil migracji BN-PAGE podjednostek NuRD i białek powiązanych. A) Mta2 i podjednostki NuRD wykazują podobny wzór intensywności. B) Mta2 i podjednostki NuRD o odwrotnym wzorcu intensywności. C) Mta2 i Cdk2ap1, który występuje tylko w kompleksie NuRD o wyższej masie cząsteczkowej. Adnotowane masy cząsteczkowe zostały oszacowane na podstawie profilu migracji standardów białkowych. Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for Biochemistry and Molecular Biology. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dopasowanie sekwencji białek, tabelaryczna analiza danych, porównanie bioinformatyczne, konserwacja sekwencji." src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Plik uzupełniający"> 
Dane uzupełniające: Przykładowy zestaw danych. Plik proteingroups.txt wygenerowany przez program MaxQuant, zawierający identyfikacje białek i wartości ilościowe z eksperymentu ABC-MS. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w Molecular and Cellular Proteomics 20 American Society for Biochemistry and Molecular Biology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Ogólnym celem tej strategii eksperymentalnej jest rozdzielenie odrębnych kompleksów funkcjonalnych, w których może uczestniczyć białko, poprzez frakcjonowanie kompleksów białkowych oczyszczonych metodą powinowactwa za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) oraz profilowanie korelacyjne z wykorzystaniem spektrometrii mas. Metoda ta może pomóc w uzupełnieniu list białek generowanych w eksperymentach oczyszczania powinowactwem połączonego ze spektrometrią mas o informacje organizacyjne. Głównymi zaletami tej procedury są prostota wykonania, dobra rozdzielczość oraz fakt, że wymaga ona niewielkiego nakładu pracy w porównaniu do konwencjonalnego badania żelu metodą CMSMS.Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów białkowych z 200 do 500 milionów komórek wykazujących endogenny poziom ekspresji białka z tagiem FLAG. Po rozmrożeniu osadu komórkowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy dodać do zawiesiny komórkowej pięć mililitrów schłodzonego w lodzie buforu do lizy zawierającego DTT i inhibitory proteaz, a następnie wymieszać poprzez delikatne kręcenie naczyniem. Zawiesinę należy inkubować w lodzie przez 10 minut.Przenieś zawiesinę komórkową do schłodzonego homogenizatora typu down. Poddaj komórki lizie, wykonując od 20 do 30 pociągnięć ciasno dopasowanym tłuczkiem, aż do ustąpienia zauważalnej lepkości, a następnie przenieś homogenizat do schłodzonych probówek do mikrocentryfugi. Po odwirowaniu zawartości probówek, przenieś oczyszczony lizat do czystej, schłodzonej probówki, pozostawiając około 50 µL lizatu.Odbierz 35 µL lizatu do oznaczenia stężenia białka i monitorowania procesu oczyszczania. Następnie usuń bufor z wcześniej przygotowanych kulek. Resuspenduj kulki w 1 mL lizatu, a następnie zmieszaj z pozostałą częścią lizatu.Inkubować mieszaninę na rotatorze w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch godzin. Zebrać kuleczki na ściance probówki za pomocą magnesu. Pobrać 30 µL nadsączu, a resztę odrzucić.Resuspenduj kulki w 0,5 ml buforu IPP150, pipetując roztwór od czterech do sześciu razy. Następnie przenieś zawiesinę do schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. W kolejnym kroku wypłucz kulki trzykrotnie, używając 0,5 ml natywnego buforu do elucji FLAG.Po ostatnim przemyciu przenieść kuleczki do nowej schłodzonej probówki. Dokładnie usunąć bufor. Resuspendować kuleczki w 100 µL peptydy 3X5 w stężeniu 200 µg/mL w natywnym buforze elucyjnym.Następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy łagodnym obracaniu. Zebrać kuleczki za pomocą magnesu, a nadsącz przenieść do nowej schłodzonej probówki. Powtórzyć ten krok dwukrotnie przed zebraniem wszystkich eluatów.Skoncentruj eluat do objętości 25 µL w jednostce filtra wirowego poprzez wirowanie z prędkością 10 000 ×g w temperaturze 4 °C. Przygotuj próbkę, dodając 4X natywny bufor do ładowania próbek oraz 0,5% dodatek do próbek G-250 do 25 µL skoncentrowanego eluatu. Nałóż próbkę oraz natywne markery masy cząsteczkowej, pozostawiając między nimi pusty dołek.Następnie w wszystkie puste dołki nanieś od 10 do 20 µL 1X natywnego buforu do ładowania próbek. Komorę katody ostrożnie napełnij 200 mL 1X natywnego ciemnoniebieskiego buforu katodowego do PAGE, aby nie zakłócić próbek. Komorę anody napełnij 550 mL 1X natywnego buforu anodowego do PAGE.Prowadź elektroforezę w żelu przy napięciu 150 V przez 30 minut. Po zatrzymaniu procesu usuń ciemnoniebieski bufor katodowy za pomocą pipety serologicznej i zastąp go buforem katodowym 1X o jasnoniebieskim kolorze. Po kontynuowaniu elektroforezy przez kolejne 60 minut otwórz kasetę żelową i usuń jedną z płytek kasety.Żel pozostaje przytwierdzony do drugiej płyty kasety. Umieść żel w kuwecie zawierającej wystarczającą ilość roztworu utrwalającego, aby go przykryć, i inkubuj przez 30 minut przy delikatnym wstrząsaniu. Następnie usuń roztwór utrwalający i zastąp go wodą przed przeskanowaniem żelu.Aby przygotować próbki do spektrometrii mas, najpierw należy umieścić płytkę 96-dołkową z dnem stożkowym na drugiej płytce 96-dołkowej w celu zbierania odpadów. Przebić dno dołków płytki stożkowej igłą o rozmiarze 21 G. Następnie do dołków przebitej płytki dodać 200 µL 50% acetonitrylu z 0,25% kwasem mrówkowym.Inkubuj stos płytek w wytrząsarce przez 10 minut. Następnie wiruj płytkę z prędkością 500 ×g przez jedną minutę, aby ciecz przepłynęła przez otwory do płytki zbiorczej na odpady. Po dwukrotnym powtórzeniu etapów płukania, napełnij dołki perforowanej płytki 96-dołkowej 150 µL 50 mM wodorowęglanu amonu.Następnie umieść żel na czystej powierzchni. Podziel ścieżkę zawierającą próbkę na 48 identycznych plastrów. Każdy plaster potnij na dwa lub trzy mniejsze fragmenty, z wyjątkiem pięciu ostatnich plastrów u góry żelu.Umieść kolejno każdy plasterek w jednym dołku przepastowanej i przemytej płytki 96-dołkowej. Do każdego dołka dodaj 50 µL acetonitrylu i inkubuj płytkę z wytrząsaniem przez 30 do 60 minut. Po usunięciu cieczy poprzez wirowanie, dodaj do każdego dołka 200 µL 2 mM TSEB oraz 50 mM wodorowęglanu amonu.Inkubować płytkę z wytrząsaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć ciecz poprzez wirowanie, analogicznie jak wcześniej. Odwodnić fragmenty żelu, dodając 200 µL czystego acetonitrylu, i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aż fragmenty żelu staną się białe i nieprzezroczyste. Po usunięciu acetonitrylu, dodać do każdego dołka 150 µL trypsyny w zimnym wodorowęglanie amonu.Inkubować płytkę wstrząsając w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie umieścić czystą płytkę z dnem stożkowym pod płytką zawierającą żel, dbając o prawidłową orientację płytek. Następnie zebrać ciecz zawierającą peptydy poprzez wirowanie przy 200 ×g przez jedną minutę.Umieść płytkę zawierającą peptydy w ewaporatorze odwirującym i odparuj ciecz, wykonując jednocześnie kolejny krok. Dodaj 150 µL 50% acetonitrylu i 0,25% kwasu mrówkowego do fragmentów żelu. Inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Zbierz ciecz na częściowo wysuszoną płytkę poprzez wirowanie z prędkością 200 ×g przez jedną minutę. Kontynuuj odparowywanie z płytki zawierającej peptydy podczas wykonywania kolejnego kroku. Przenieś roztwory peptydów na wypłukaną płytkę do filtracji odśrodkowej.Pod spodem należy umieścić czystą płytkę z dnem stożkowym w celu zebrania peptydów, a następnie odwirować stos płytek w taki sam sposób jak wcześniej. Odparować ciecz z płytki z dnem stożkowym, aż do całkowitego wyschnięcia dołków. Po wyschnięciu płytkę można przykryć silikonową pokrywką i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia spektrometrii mas i analizy danych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przedstawione tutaj wyniki hierarchicznej analizy skupień profilów migracji Mta2 i białek współoczyszczanych w metodzie blue native PAGE ukazano w formie dendrogramu oraz mapy ciepła reprezentującej intensywność białek. Profil migracji Mta2 wykazuje dwa piki wskazujące na dwa odrębne kompleksy. Niektóre podjednostki NuRD wykazują podobny wzorzec z największą obfitością w kompleksie o niższej masie cząsteczkowej.W przeciwieństwie do nich, inne podjednostki NuRD występują w większej ilości w kompleksie NuRD o wyższej masie cząsteczkowej. Z kolei białko Cdk2ap1, oddziałujące z Mta2, jest obecne wyłącznie w kompleksie NuRD o wyższej masie cząsteczkowej. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w dwa i pół dnia.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymywaniu wszystkich próbek i odczynników w lodzie, aby uniknąć dysocjacji kompleksów białkowych. Procedurę tę można zastosować do dowolnego białka docelowego, pod warunkiem że można je wyizolować z nośnika powinowactwa poprzez elucję konkurencyjną w warunkach natywnych. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak odwrócona lub sekwencyjna koimmunoprecypitacja, w celu walidacji zidentyfikowanych subkompleksów.

resolving-affinity-purified-protein-complexes-blue-native-page

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę oczyszczania kompleksów białkowych z powinowactwa z użyciem Blue Native PAGE i profilowania korelacji masowej spektrometrii. Protokół umożliwia rozdzielenie interaktomów na odrębne kompleksy białkowe z dobrą rozdzielczością.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przeglądaj więcej filmów