Name: Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Naucz się przygotowywać rdzeń kręgowy Danio rerio do zapisów elektrofizjologicznych z neuronów czuciowych i ruchowych in situ. Ta metoda umożliwia badanie aktywności elektrycznej neuronów w trakcie rozwoju zarodkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (F32 NS059120 dla RLM oraz R01NS25217 i P30NS048154 dla ABR).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisane tu metody pozwalają na elektryczną i morfologiczną charakterystykę neuronów czuciowych i ruchowych zarodków danio pręgowanego po minimalnym rozwarstwieniu rdzenia kręgowego. Neurony pozostają zdrowe przez co najmniej 1 godzinę, czyli limit czasu nałożony na te nagrania. Neurony zostały zarejestrowane przy użyciu standardowej konfiguracji całych komórek, a także z jądrzastych plam; Ta ostatnia metoda minimalizuje problemy z zaciskami przestrzennymi, które mogą uniemożliwić szczegółowe badanie biofizyczne prądów jo...

George Streisinger był pionierem w użyciu Danio rerio, powszechnie znanego jako danio pręgowany, jako modelowego systemu do analizy genetycznej rozwoju kręgowców10. Model oferuje kilka zalet, w tym: (1) stosunkowo prostą i niedrogą hodowlę zwierząt; (2) zapłodnienie zewnętrzne, umożliwiające łatwy dostęp do zarodków od najwcześniejszych stadiów rozwojowych; oraz (3) przezroczysty zarodek, umożliwiający bezpośrednie i wielokrotne obserwacje komórek, tkanek i narządów w trakcie ich formowania.
W ciągu następnych dziesięcioleci, kilka postępów jeszcze bardziej zwiększyło moc modelu danio pręgowanego. W szczególności badania genetyczne i sekwencjonowanie całego genomu odegrały kluczową rolę w identyfikacji mutacji i genów krytycznych dla wielu procesów rozwojowych11,12,13,14,15,16. Metody klonowania bramek pozwoliły na rutynowe stosowanie podejść transgenicznych17,18. Ostatnie postępy w edycji genomu, których przykładem są nukleazy podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i zgrupowane w regularnych odstępach krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-Cas9, pozwalają na ukierunkowane wprowadzanie mutacji, a także podejścia knock-out i knock-in19,20,21,22. Połączenie tych metod sprawia, że danio pręgowany jest potężnym modelem do badania mechanizmów genetycznych leżących u podstaw określonych zachowań i kilku chorób ludzkich23,24,25,26,27.
Ta praca skupia się na regulacji rozwoju i roli aktywności elektrycznej w rozwoju neuronów. Nacisk kładziony jest na rdzeń kręgowy, dla którego model danio pręgowanego ma kilka zalet. Po pierwsze, dostęp do danio pręgowanego w stadium embrionalnym i larwalnym jest stosunkowo łatwy; W związku z tym można badać funkcję rdzenia kręgowego w stadiach rozwojowych, które mają mniej neuronów i prostsze obwody28,29. Co więcej, rdzeń kręgowy danio pręgowanego ma zróżnicowany zestaw neuronów, podobny do innych kręgowców, o czym świadczą charakterystyczne i wyróżniające wzorce czynników transkrypcyjnych30,31,32,33,34,35.
Większość badań nad danio pręgowanymi, które mają na celu odkrycie mechanizmów leżących u podstaw funkcji obwodów rdzenia kręgowego, zwłaszcza tych, które wspierają lokomocję, są, co zrozumiałe, skoncentrowane na stadiach larwalnych36,37,38,39,40,41,42,43. Jednak wiele neuronów tworzących sieci lokomotoryczne rdzenia inicjuje swoje różnicowanie we wczesnych stadiach embrionalnych, ~9-10 godzin po zapłodnieniu (hpf)44,45,46,47,48,49,50,51. W związku z tym zrozumienie, w jaki sposób powstają i zmieniają się właściwości morfologiczne i elektryczne neuronów rdzeniowych między stadiami embrionalnymi i larwalnymi, jest ważne dla ogólnego zrozumienia powstawania i funkcjonowania obwodów lokomotorycznych.
Opisane tutaj metody preparacji pozwalają na rejestrację zatrzasków z neuronów rdzeniowych i zostały z powodzeniem zastosowane w stadiach embrionalnych (~17-48 hpf) i larwalnych (~3-7 dni po zapłodnieniu [dpf]). Takie podejście ogranicza ilość sekcji wymaganej do zapewnienia dostępu do neuronów będących przedmiotem zainteresowania. Protokół różni się od większości innych opublikowanych metod rejestracji neuronów rdzeniowych danio pręgowanego tym, że do przymocowania zarodka lub larwy do komory rejestracyjnej używa się kleju do szwów weterynaryjnych, a nie cienkiej szpilki wolframowej. Dostępność dwóch różnych podejść (tj. kleju do szwów i trzpienia wolframowego) do montażu zarodków lub larw danio pręgowanego do analizy elektrofizjologicznej zapewnia naukowcom alternatywne opcje osiągnięcia konkretnych celów eksperymentalnych.
Po pierwsze, opisane są procedury dostępu i zapisu z populacji pierwotnych neuronów czuciowych, komórek Rohona-Bearda. Ciała komórkowe tych neuronów leżą w grzbietowym rdzeniu kręgowym. Komórki Rohona-Bearda występują u wielu gatunków kręgowców, różnicują się we wczesnym okresie rozwoju i leżą u podstaw embrionalnej reakcji na dotyk6,44,47,48.
Po drugie, procedury dostępu i rejestracji z rdzeniowych neuronów ruchowych są szczegółowe. Neurony ruchowe rdzenia danio pręgowanego powstają podczas dwóch fal neurogenezy. Wcześniej urodzone pierwotne neurony ruchowe powstają pod koniec gastrulacji (~9-16 hpf), przy czym tylko 3-4 pierwotne neurony ruchowe są obecne na półsegment45,46,49. W przeciwieństwie do tego, później narodzona populacja wtórnych neuronów ruchowych jest liczniejsza i powstaje w dłuższym okresie, zaczynając od ~14 hpf45,50. Geneza wtórnego neuronu ruchowego w środkowych segmentach tułowia jest w większości uzupełniana przez 51 hpf50. Wtórne neurony ruchowe są uważane za odpowiedniki neuronów ruchowych w amniotes46. Co ciekawe, neurony nadrdzeniowe, za pośrednictwem dopaminy, regulują lokomocję u larwy i genezę wtórnych neuronów ruchowych u zarodka i młodej larwy50,51. Pierwotne i wtórne neurony ruchowe składają się z kilku różnych podtypów. Każdy podtyp pierwotnego neuronu ruchowego projektuje akson obwodowy, który unerwia charakterystyczną grupę mięśni, co skutkuje stereotypową, identyfikującą trajektorią aksonalną. Ogólnie rzecz biorąc, wtórne neurony ruchowe podążają ścieżkami aksonalnymi wcześniej ustanowionymi przez pierwotne neurony ruchowe. Tak więc, w odniesieniu do trajektorii aksonalnych, pierwotne i wtórne neurony ruchowe są podobne, z wyjątkiem tego, że grubość aksonów i rozmiar somatów są większe dla pierwotnych neuronów ruchowych45.
Po trzecie, omówiono metody nagrywania z kilku typów interneuronów. Jednak w tych przypadkach wymagane jest ograniczone usunięcie innych komórek rdzenia kręgowego, a zatem rdzeń kręgowy jest mniej nienaruszony niż w przypadku nagrań z komórek Rohon-Beard lub neuronów ruchowych.

<table><tbody><tr><td>Filtr próżniowy/Butelka do przechowywania, pory 0,22 mm</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa;-bugarotoksyna</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 sól hydrazyny</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-10438</td><td>barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Filtr probówkowy wirówki Spin-X</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Sylgard zestaw elastomerów</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>elastomer silikonowy</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0038</td><td>średnice wewnętrzne i zewnętrzne 0,78 i 1,0 mm (cienkościenne kapilary szklane)</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>średnice wewnętrzne i zewnętrzne 1,13 i 1,55 mm (grubościenne kapilary szklane)</td></tr><tr><td>Miniaturowa armatura z kolczastego tworzywa polipropylenowego&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Klej do tkanek Vetbond&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; Wzór P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Stopień główny</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator z napędem&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tygon</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 CALA, OD 1/8 CALA i ŚCIANKA 1/32 CALA (elastyczne rurki laboratoryjne)</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Trójdrogowe zawory odcinające&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Obiektyw Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0,80 W Achroplan</td><td>Oprogramowanie do</td> akwizycji i analizy danych Zeiss<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex i Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td colspan="4">Roztwory do sekcji i nagrywania (w mM)</td></tr><tr><td>Wszystkie roztwory, z wyjątkiem wewnątrzkomórkowych, są stabilne przez ~2-3 miesiące po przefiltrowaniu (kubki filtracyjne 0,22 mm) i przechowywaniu w temperaturze pokojowej (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wewnątrzkomórkowy jest filtrowany (filtry strzykawkowe 0,2 mm) i przechowywany w stanie zamrożonym (-20 &deg; C) w małych porcjach, które są indywidualnie rozmrażane w dniu użycia.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekcja zwłok/Dzwonek' s roztwór</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (z NaOH)</td></tr><tr><td>Pipeta (wewnątrzkomórkowa) roztwór</td><td></td><td></td> zapisujący <td>135 KCl, 10 kwasów EGTA, 10 HEPES; pH 7,4 (z KOH).</td></tr><tr><td>Kąpielowy (zewnątrzkomórkowy) roztwór rejestrujący/cęgi</td><td></td><td></td> napięciowe i prądowe <td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2,2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (z NaOH).</td></tr><tr><td>Alexa-594 roztwór podstawowy soli hydrazyny.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Przygotuj zapas 13,2 mM w ddH2O, podwielokrotność (~100 &mikro; l) i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy 132-krotnie roztworem pipety do końcowego stężenia 100 mM. Po rozcieńczeniu przefiltrować roztwór pipety Alexa-594 zawierający&nbsp; z filtrem probówkowym wirówkowym.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td><silne>Środki unieruchamiające</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4% sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)</td><td></td><td></td><td>Przygotować 0,4% roztwór podstawowy w 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Trikaina/100 ml 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Dostosuj pH do 7 za pomocą NaOH i przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td colspan="4">Do użycia, rozcieńczyć roztwór podstawowy ~25 razy w pożywce dla zarodków</td></tr><tr><td>250 mM &alfa-bungarotoksyna</td><td></td><td></td><td>Przygotuj 250 mM zapasu w ddH2O (1 mg/500 mL), przygotuj 100 &mikro; L podwielokrotności i sotre przy -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Do użycia, rozcieńczyć 2,500-krotnie roztworem zewnątrzkomórkowym do końcowego stężenia 100 nM.</td></tr><tr><td>1 mM tetrodotoksyny</td><td></td><td></td><td>Przygotować 1 mM zapas w ddH2O (1 mg/3 ml), przygotować 100 &mikro; L podwielokrotności i sotre przy -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Do użycia, rozcieńczyć 2000-krotnie roztworem zewnątrzkomórkowym do końcowego stężenia 500 nM.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Danio pręgowany, po raz pierwszy wprowadzony jako model rozwojowy, zyskał popularność w wielu innych dziedzinach. Łatwość hodowli dużej liczby szybko rozwijających się organizmów, w połączeniu z embrionalną przejrzystością optyczną, posłużyła jako początkowe przekonujące atrybuty tego modelu. W ciągu ostatnich dwóch dekad sukces tego modelu był dodatkowo napędzany przez jego zdolność do badań przesiewowych mutagenezy na dużą skalę oraz łatwość transgenezy. Ostatnio metody edycji genów rozszerzyły możliwości tego modelu.
Dla badań neurorozwojowych, zarodek i larwa danio pręgowanego stanowią model, do którego można zastosować wiele metod. Tutaj skupiamy się na metodach, które pozwalają na badanie podstawowej właściwości neuronów, pobudliwości elektrycznej. Nasze przygotowanie do badania elektrofizjologicznego neuronów rdzeniowych danio pręgowanego polega na zastosowaniu kleju do szwów weterynaryjnych w celu przymocowania preparatu do komory rejestracyjnej. Alternatywne metody rejestracji z zarodków i larw danio pręgowanego polegają na przymocowaniu preparatu do komory za pomocą cienkiego wolframowego pinu1,2,3,4,5. Trzpień wolframowy jest najczęściej używany do mocowania preparatu w orientacji bocznej, chociaż był używany do mocowania larw grzbietowo do góry4. Klej do szwów został użyty do montażu zarodków i larw w obu orientacjach. Za pomocą kleju można przeprowadzić minimalną sekcję, umożliwiając dostęp do neuronów rdzeniowych bez stosowania leczenia enzymatycznego, unikając w ten sposób powstałych uszkodzeń. Jednak w przypadku larw konieczne jest zastosowanie krótkiej terapii enzymatycznej w celu usunięcia tkanki mięśniowej otaczającej rdzeń kręgowy. Opisane tutaj metody zostały wykorzystane do zbadania wewnętrznych właściwości elektrycznych neuronów ruchowych, interneuronów i neuronów czuciowych na kilku etapach rozwoju6,7,8,9.

Pomyślnie zarejestrowaliśmy aktywność neuronów Rohona-Bearda w embrionach w 17 hpf oraz w larwach w 7 dpf (Ryc. 5A i 5B). Podczas rejestracji z komórek Rohona-Bearda preparat montowano stroną grzbietową do góry. Taki sposób montażu pozwala na jednoznaczną identyfikację komórek Rohona-Bearda na podstawie ich powierzchownego położenia grzbietowego oraz dużych rozmiarów somy. Identyfikację dodatkowo potwierdza stereotypowy hiperpolaryzowany spoczynkowy poten...

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Ogólnym celem tego przygotowania jest umożliwienie badań elektrofizjologicznych neuronów rdzeniowych danio pręgowanego in situ w stadiach embrionalnym i larwalnym. Analizy elektrofizjologiczne uzupełniają zaawansowane podejścia genetyczne i obrazowe, które są również możliwe do zastosowania w modelu danio pręgowanego. Chociaż metoda ta została pierwotnie opracowana do badania neuronów Rohona-Bearda, z czasem z łatwością zaadaptowaliśmy to podejście i obecnie możemy badać różne typy neuronów rdzeniowych.Procedurę zademonstruje dr Rosa Moreno, adiunkt, z którą mam przyjemność współpracować od wielu lat. Aby rozpocząć procedurę, należy zdjąć czarną gruszkę z jednego otworu szklanego i zastąpić ją białym gumowym adapterem z innego otworu szklanego. Następnie należy odciąć kawałek elastycznego przewodu o długości około 38 centymetrów.Następnie przymocuj elastyczną rurkę za pomocą małej, prostej złączki polipropylenowej. Aby przygotować elastomer silikonowy, dodaj bazę i czynnik sieciujący do plastikowej probówki stożkowej w stosunku cztery do jednego. Następnie dokładnie wymieszaj bazę elastomeru z czynnikiem sieciującym.Wlej mieszaninę do dwóch szalek Petriego o średnicy 100 mm, tak aby w jednej głębokość wynosiła około 1 mm, a w drugiej około 2,5 mm. Pozostaw elastomer silikonowy do utwardzenia poprzez ekspozycję na powietrze przez cztery do pięciu dni. Jeśli utwardzony elastomer jest potrzebny szybciej, inkubuj go w temperaturze 60 °C.Następnie z utwardzonego elastomeru o grubości 1 mm wytnij prostokąt o wymiarach 3,8 cm na 6,3 cm, który posłuży jako dno komory. Z utwardzonego silikonu o grubości 2,5 mm wytnij prostokąt o wymiarach 3,8 cm na 6,3 cm. Następnie z niego wytnij wewnętrzny prostokąt o wymiarach 2,5 cm na 5 cm, aby utworzyć ramkę na górną część komory.Aby przygotować komorę do rejestracji sekcji, należy położyć cienki prostokąt z silikonu bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym, upewniając się, że między silikonem a szkłem nie pozostały pęcherzyki powietrza. Następnie na cienkiej dolnej warstwie silikonu należy umieścić ramkę prostokątną z silikonu. W tej procedurze embrion umieszcza się w komorze sekcyjnej zawierającej od dwóch do trzech mililitrów roztworu Ringera.Unieruchom embrion, dodając do komory 100 µL 0,4% roztworu trikainy. Następnie, przy użyciu wyciągarki do mikrokapilar, wyciągnij z rurek szklanych o cienkich ściankach mikrokapilary do iniekcji z długimi, cienkimi końcówkami. Przymocuj wyciągniętą szklaną mikrokapilarę do szklanego dna dozownika kleju.Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pęsety należy przełamać końcówkę szklanej mikro pipety, tak aby uzyskać otwór o średnicy około 75 micrometers. Następnie, za pomocą ustnika, należy nabrać do szklanej mikro pipety od trzech do pięciu microliters kleju. Przenieść końcówkę wypełnioną klejem do komory sekcyjnej.Następnie zbliż końcówkę mikropipety nabranej klejem do głowy zarodka, utrzymując za pomocą rurki ustnej lekkie nadciśnienie w mikropipiecie. Gdy końcówka znajdzie się w pobliżu głowy zarodka, zastosuj odpowiednie nadciśnienie, aby wypuścić małą kroplę kleju na dno komory. Za pomocą igły sekcyjnej przesuń zarodek w stronę kropli kleju, tak aby głowa miała z nim kontakt.Ustaw embrion stroną grzbietową do góry i naciśnij głowę, aby zapewnić dobry kontakt z klejem. W miarę jak klej powoli twardnieje, użyj szpilki sekcyjnej, aby zmienić położenie embrionu tak, aby spoczywał stroną brzuszną do dołu, a grzbietową do góry. Zanurz szpilkę sekcyjną w kropli kleju i przeciągnij kilka nici kleju nad głową embrionu, aby dodatkowo zabezpieczyć jego pozycję.Po bezpiecznym przymocowaniu głowy do silikonu i zastygnięciu kleju należy poświęcić embrion, wykonując przekrój na poziomie tylnego mózgu za pomocą kolejnej szklanej mikropipety. Używając nowej szklanej mikropipety, należy kilkukrotnie wykonać powierzchowne nacięcia skóry w pozycji gudałnej względem tylnego mózgu. Przebij skórę powierzchownie, poruszając pipetą prostopadle do osi rostro-kaudalnej po obu stronach tułowia w przypadku okazów zamontowanych grzbietowo, lub po odsłoniętej stronie tułowia w przypadku okazów zamontowanych bocznie.Aby utworzyć płat skóry, który będzie można uchwycić pęsetą, należy kilkakrotnie zeskrobać skórę za pomocą mikropipety, na poziomie i prostopadle do początkowego nacięcia. Używając pęsety, stopniowo unieś płat skóry i pociągnij skórę w kierunku ogonowym. Następnie nanieś małą kroplę kleju w pobliżu ogona embrionu.Użyj tego kleju, aby przymocować ogon do dna komory sekcyjnej. W miarę twardnienia kleju koryguj pozycję tułowia za pomocą szpilki sekcyjnej, aby upewnić się, że tułów pozostaje zorientowany grzbietowo i jest mocno przytwierdzony do komory. Po wstępnej sekcji obficie przepłucz preparat roztworem Ringera, aby usunąć trikainę oraz zanieczyszczenia, a następnie pozostaw preparat do odpoczynku na pięć minut.Następnie należy zastąpić roztwór do sekcji roztworem do rejestracji zewnątrzkomórkowej. W razie potrzeby do preparatu należy dodać środek immobilizujący. Następnie komorę sekcyjną z zamontowanym embrionem przenosi się na stolik odwróconego mikroskopu złożonego, wyposażonego w obiektyw immersyjny wodny 40 X z długą odległością roboczą.Następnie zamocuj pustą kapilarę szklaną o grubych ściankach z krzemianu w uchwycie elektrody głowicy. Jeden koniec rurki podłącz do wylotu powietrza w uchwycie elektrody, a drugi koniec do trójdrożnego kurka. Następnie na jednym końcu kolejnego odcinka rurki umieść ustnik, a drugi koniec podłącz do trójdrożnego kurka.Następnie zbliż końcówkę mikropipety do najbardziej grzbietowej części rdzenia kręgowego i delikatnie przebij oponu mózgowo-rdzeniowe. Następnie wykonaj szybkie, krótkie ruchy boczne, aby poluzować opony. Po przejściu końcówki mikropipety przez opony, przesuń i unieś mikropipetę, aby oddzielić opony od rdzenia kręgowego.Następnie przesuń mikropipetę w kierunku rostralnym, przesuwając ją o jeden lub dwa hemisegmenty, aby odsłonić komórki Rohon-Bearda. W naszym doświadczeniu neurony Rohona-Bearda są bardziej delikatne niż inne neurony rdzenia kręgowego. Aby zachować ich żywotność, odsłaniamy jednorazowo jeden lub dwa neurony Rohona-Bearda.Rejestracje prądów wychodzących i wchodzących metodą voltage clamp uzyskano z neuronów rohon-beard w embrionach i larwach w pierwszym, drugim i siódmym dniu po zapłodnieniu. Potencjał podtrzymujący wynosił -80 mV, a prądy wywoływano poprzez skok depolaryzacyjny do +20 mV. W trybie current clamp, wstrzyknięcie prądu 0,35 nA przez jedną milisekundę wywołuje pojedynczy potencjał czynnościowy w neuronach rohon-beard zarówno w embrionach, jak i w larwach.W przypadku braku stymulacji elektrycznej neurony rohon-beard nie wykazują spontanicznych potencjałów czynnościowych. Potencjał spoczynkowy neuronów rohon-beard staje się coraz bardziej ujemny w miarę postępu rozwoju. Po opanowaniu tej metody embriony mogą zostać zamocowane i poddane sekcji w celu odsłonięcia neuronów rohon-beard w czasie krótszym niż 10 minut.Jak wspomniano w protokole, ważne jest zrozumienie czynników determinujących szybkość twardnienia kleju. Niniejszy film przedstawia kluczowe etapy rejestracji sygnałów z neuronów rdzenia kręgowego u danio pręgowanego.

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Ten film demonstruje nieinwazyjny test do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego. Po zmierzeniu zwijania ogona w zarodkach w wyniku spontanicznej depolaryzacji neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, stosuje się bloker kanału sodowego w celu zmniejszenia częstotliwości zwijania. Następnie zarodki są unieruchamiane w agarozie i umieszczane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Genetycznie zmodyfikowane neurony ruchowe wyrażają bioczujnik wykrywający napięcie z...

Nieinwazyjne podejście do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Naucz się przygotowywać rdzeń kręgowy Danio rerio do zapisów elektrofizjologicznych z neuronów czuciowych i ruchowych in situ. Ta metoda umożliwia badanie aktywności elektrycznej neuronów w trakcie rozwoju zarodkowego.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Przeglądaj więcej filmów