Immunoprecypitacja chromatyny

Immunoprecypitacja chromatyny lub "ChIP" to technika stosowana przez naukowców do oceny interakcji białko-DNA. Czynniki białkowe odgrywają ważną rolę w regulacji genów; nie tylko organizują DNA w chromosomach, ale także wiążą się z określonymi sekwencjami DNA - zwanymi miejscami regulatorowymi - w celu aktywacji lub stłumienia ekspresji. Podczas ChIP chromatyna - która składa się z DNA i powiązanych z nim białek - jest "immunoprecypitowana", co oznacza, że jest izolowana za pomocą przeciwciał. Dzięki tej metodzie naukowcy mogą ocenić, które białka wiążą się z którymi sekwencjami DNA.

W tym filmie przyjrzymy się modyfikacjom chromatyny i ich rolom w regulacji epigenetycznej oraz sposobowi, w jaki ChIP może testować te modyfikacje. Następnie opiszemy uogólnioną procedurę dla tej techniki, a na koniec omówimy, w jaki sposób naukowcy wykorzystują ChIP w dzisiejszych badaniach.

Zacznijmy od przeglądu, czym są modyfikacje chromatyny i jak je badać za pomocą ChIP.

U eukariontów DNA jest przechowywane w jądrach poprzez "owijanie" wokół kompleksów białkowych. Białka te są histonami, a każdy kompleks histonowy owinięty w DNA jest określany jako "nukleosom". Ekspresja genów jest regulowana przez "zajętość nukleosomów", czyli to, czy odcinek DNA jest upakowany w nukleosomach. Transkrybowane DNA ma tendencję do lokalizowania się w regionach "wolnych od nukleosomów", które umożliwiają białkom łączenie się z miejscami regulatorowymi genu i umożliwiają polimerazie RNA przeprowadzanie transkrypcji.

Obecne dowody sugerują, że zmiany w strukturze chromatyny, które regulują ekspresję genów, są pośredniczone przez modyfikacje chemiczne histonów, zwykle w ich swobodnie poruszających się "ogonach". Najczęstszymi z nich są grupy acetylowe, metylowe i fosforanowe, które są dodawane lub usuwane z określonych aminokwasów, a te różne modyfikacje histonów są obserwowane jako związane z różnymi poziomami lub sposobami ekspresji genów.

Na przykład dodanie trzech grup metylowych do 27. reszty lizyny w podjednostce histonu H3 - modyfikacji określanej jako H3K27me3 - zostało powiązane z wyciszaniem genów. Alternatywnie, modyfikacja H3K9ac, w której grupa acetylowa jest dodawana do 9. reszty lizyny na histonie H3, jest związana z aktywacją genu.

Przypuszcza się, że modyfikacje histonów odgrywają rolę w epigenetycznej regulacji ekspresji genów poprzez oznaczanie regionów chromatyny jako "aktywnych" lub "cichych". Jednym z mechanizmów, za pomocą których uważa się, że modyfikacje histonów wywierają swoje działanie, jest rekrutacja czynników transkrypcyjnych lub enzymów "przebudowujących" chromatynę, z których te ostatnie fizycznie przesuwają pozycje nukleosomów.

Dzięki ChIP specyficzne modyfikacje histonów mogą być celowane przez przeciwciała, które mogą być "ściągane w dół" wraz z otaczającym DNA. Naukowcy mogą następnie zastosować PCR, mikromacierze lub sekwencjonowanie w celu zidentyfikowania regionów DNA związanych z modyfikacjami histonów, które są przedmiotem zainteresowania. Poprzez różnicowanie przeciwciał stosowanych podczas ChIP, technika ta może również pomóc w określeniu regionów DNA związanych przez czynniki transkrypcyjne i inne białka regulatorowe.

Teraz, gdy znasz już zasady rządzące ChIP, przejdźmy przez uogólnioną procedurę dla tej techniki.

Na początek interesujące komórki są zbierane i traktowane substancjami chemicznymi, takimi jak formaldehyd, które działają jak odczynniki "sieciujące" i pomagają przyczepiać białka do sekwencji DNA, z którymi się kojażdżą, ułatwiając tworzenie wiązań kowalencyjnych między nimi. Należy uważać, aby nie "przesadzić" z formaldehydem, ponieważ może to wpłynąć na zdolność przeciwciał do rozpoznawania docelowych modyfikacji histonów w późniejszych stadiach ChIP. Aby zatrzymać proces sieciowania, glicynę dodaje się do roztworu formaldehydu, którym poddawane są działanie komórek. Komórki są następnie zbierane i poddawane lizie w celu uwolnienia chromatyny.

Aby rozpuścić chromatynę i precyzyjnie zdefiniować regiony DNA, które wiążą się ze zmodyfikowanymi histonami, chromatyna jest mechanicznie "ścinana" na mniejsze kawałki za pomocą fal dźwiękowych - proces ten nazywa się sonikacją. Zazwyczaj naukowcy dążą do stworzenia fragmentów chromatyny o długości od 200 do 1000 par zasad. Po wygenerowaniu fragmentów chromatyny o pożądanej wielkości, do roztworu dodaje się przeciwciało, a mieszaninę inkubuje się, aby dać przeciwciału czas na rozpoznanie docelowej modyfikacji histonu.

Kulki magnetyczne, z którymi mogą wiązać się przeciwciała, są następnie wprowadzane do mieszaniny, unieruchamiając kompleksy chromatyny związane z przeciwciałami. Koraliki są zbierane za pomocą stojaków magnetycznych i kilkakrotnie myte w celu spłukania niezwiązanej chromatyny lub przeciwciał.

Aby uwolnić z nich chromatynę, kulki umieszcza się w roztworze zawierającym detergent SDS, a po zebraniu kulek za pomocą magnesu utrzymuje się supernatant. Enzym proteinaza K jest następnie dodawany do tego roztworu w celu degradacji wszystkich białek, w tym histonów, tak aby można było wyizolować składnik DNA chromatyny. Powstałe DNA jest następnie oczyszczane i analizowane.

Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób naukowcy używają obecnie ChIP w swoich laboratoriach.

Wielu badaczy używa ChIP do oceny zmian w modyfikacjach histonów wywołanych przez sygnały zewnątrzkomórkowe. W tym przypadku hodowane komórki ludzkie potraktowano specyficzną cytokiną lub cząsteczką sygnałową i oceniono zmiany w metylacji histonów. Oznaczając DNA ChIP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, naukowcy ustalili, że - w odpowiedzi na leczenie - gen kodujący czynnik transkrypcyjny IRF1 zyskał aktywujący znacznik histonowy, H3K36me3. Modyfikacja ta umożliwiła zarówno białku regulatorowemu, jak i polimerazie RNA II powiązanie się z IRF1, co spowodowało jego transkrypcję.

ChIP może być również wykorzystany do uzyskania wglądu w zmiany w ekspresji genów, które zachodzą podczas uszkodzenia i regeneracji tkanek. W tym eksperymencie naukowcy uszkodzili składnik obwodowego układu nerwowego u myszy - nerw kulszowy - a następnie wykorzystali ChIP do poszukiwania nowych interakcji DNA-białko w innych strukturach obwodowego układu nerwowego, takich jak zwoje nerwowe flankujące rdzeń kręgowy. Naukowcy doszli do wniosku, że po uszkodzeniu nerwów białko p53, które jest regulatorem naprawy DNA, zostało powiązane z genem zaangażowanym w regenerację tkanek, GAP43.

Wreszcie, niektórzy naukowcy pracują nad usprawnieniem procedur ChIP, aby zwiększyć przepustowość i wydajność eksperymentów. W tym przypadku badacze byli w stanie "zautomatyzować" ChIP, zmuszając maszynę do wykonywania wielu kroków w protokole. Pozwoliło to naukowcom na jednoczesną ocenę DNA związanego z kilkoma różnymi modyfikacjami histonów, przy użyciu stosunkowo niewielkiej liczby komórek – 10 000 – dając wyniki podobne do tych obserwowanych przy większej liczbie komórek lub przy standardowych, "ręcznych" technikach ChIP.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat immunoprecypitacji chromatyny. W tym filmie omówiliśmy, w jaki sposób DNA i białka razem tworzą chromatynę, a także etapy protokołu zwanego ChIP, który można wykorzystać do identyfikacji sekwencji DNA związanych z określonymi stanami chromatyny lub białkami. Zbadaliśmy również, w jaki sposób naukowcy wykorzystują i modyfikują ChIP, aby lepiej zrozumieć rolę interakcji DNA-białko podczas regulacji genów. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!