Name: Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Poznaj metody oceny aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów szczurzych. Protokół umożliwia badanie tolerancji immunologicznej in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została zrealizowana w kontekście projektu Labex IGO (n°ANR-11-LABX-0016-01), który jest częścią programu rządu francuskiego "Investissements d'Avenir" zarządzanego przez ANR (ANR-11-LABX-0016-01) oraz projektu IHU-Cesti finansowanego również przez program rządu francuskiego "Investissements d'Avenir", zarządzany przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projekt IHU-Cesti jest również wspierany przez Nantes Métropole i Région Pays de la Loire.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Adoptywny transfer całkowitych splenocytów do nowo przeszczepionego biorcy jest skutecznym sposobem wykrywania obecności komórek regulatorowych indukowanych lub wzmacnianych przez leczenie. Przemijająca limfopenia wywołana promieniowaniem gospodarza sprzyja przeżyciu komórek po przeniesieniu i ustaleniu tolerancji. Co więcej, subletalne napromieniowanie pozostawia komórkom o właściwościach tolerogennych czas na przekształcenie się w nowe komórki regulatorowe podczas rekonstytucji immunologicznej, zjawisko zwane tolerancj...

Przeszczep serca u szczura jest wiarygodnym modelem przeszczepu narządów do oceny leczenia indukcji tolerancji, do rozszyfrowania mechanizmów indukcji i utrzymania tolerancji, a także ma potencjał do indukowania funkcjonalnie kompetentnych i dominujących komórek regulatorowych. Poniższe protokoły opisują w pełni niezgodny heterotopowy przeszczep serca od szczura dawcy Lewisa 1W (LEW.1W, RT1u) do szczura biorcy Lewisa 1A (LEW.1A, RT1a). W tej kombinacji przeszczepów ostre odrzucenie następuje szybko (w ciągu około 7 dni) i można je łatwo ocenić za pomocą pomiaru bicia przeszczepu poprzez badanie palpacyjne jamy brzusznej. Tutaj proponujemy trzy protokoły indukujące tolerancję na alloprzeszczep serca u szczurów. W tych modelach tolerancja jest indukowana i/lub utrzymywana przez różne typy komórek regulatorowych. Po pierwsze, blokowanie interakcji CD40-CD40L z adenowirusem kodującym CD40Ig (AdCD40Ig) indukowało wytwarzanie limfocytów Treg CD8 + zdolnych do indukowania tolerancji po adoptywnym przeniesieniu do wtórnie przeszczepionych biorców1. Co więcej, wyczerpanie komórek CD8 + (z przeciwciałami anty-CD8α) u biorców leczonych AdCD40Ig generowało Bregs i RegMCs2. Dogłębna analiza właściwości limfocytów Treg CD8+ podkreśliła kluczową rolę kilku cząsteczek immunoregulacyjnych zdefiniowanych jako interleukina-34 (IL-34) i fibroleukina-2 (FGL-2)3,4,5,6. Podczas gdy nadekspresja IL-34 (z wektorem AAV) indukowała Treg poprzez wytwarzanie RegMCs, nadekspresja FGL-2 indukowała Bregs, leżące u podstaw złożonej sieci komórek regulatorowych.
Ponieważ przewlekłe odrzucenie rozwija się powoli i jest długotrwałe, konieczna jest dogłębna analiza, aby odróżnić tolerancję od chronicznego odrzucenia. Przeszczep jest zwykle oceniany pod kątem naciekania komórek, zwłóknienia, pogrubienia ściany naczyniowej i odkładania się C4d dopełniacza za pomocą immunohistologii7. Podczas gdy metody histologiczne wymagają uśmiercenia zwierzęcia lub biopsji przeszczepu, tutaj opisujemy prostą metodę oceny różnych cech tolerowanego przeszczepu allogenicznego: pojawienia się i funkcji komórek regulatorowych oraz odpowiedzi przeciwciał swoistych dla dawcy z próbki krwi za pomocą cytometrii przepływowej (tutaj zastosowaliśmy sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)).
Utrzymanie tolerancji na przeszczep allogeniczny po zatrzymaniu leczenia jest zazwyczaj związane z indukcją komórek regulatorowych8. W ostatnich dziesięcioleciach badania skoncentrowane na limfocytach Treg CD4+ jednogłośnie scharakteryzowały je za pomocą kluczowych markerów Foxp3+, CD25high i CD127-9,10,11. Podobnie, kilka markerów przypisano limfokomórkom Treg CD8+, takich jak CD122+, CD28-, CD45RClow, PD1+ i Helios+1,12,13,14,15,16,17. Z biegiem lat ekspresja GITR, CTLA4 i cytokin (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) była dodatkowo związana z profilem Treg3,4,6,13,18,19,20,21. Jednak pojawiające się populacje komórek regulatorowych, takie jak Bregs, RegMC lub NKTregs, nie mają odpowiednich specyficznych markerów. Rzeczywiście, Bregs są najczęściej zgłaszane jako niedojrzałe komórki CD24 +, z niejednoznaczną ekspresją CD27 i czasami produkcją IL-10, TGFβ lub granzyme B22,23,24. Złożoność linii komórek szpikowych wymaga kombinacji kilku markerów w celu zdefiniowania ich profilu regulacyjnego lub prozapalnego, takich jak CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a lub CD16325,26. Wreszcie, niektóre markery zostały zgłoszone w celu identyfikacji NKTregs, takich jak CD11b+, CD27+, TGFβ+, ale potrzebne są dalsze badania, aby dokładniej opisać je fenotypowo27,28,29,30,31,32. W związku z tym dowody na aktywność supresyjną są niezbędne do legitymizacji dalszego opisu fenotypowego w celu identyfikacji nowych biomarkerów, nowych mediatorów immunoregulacyjnych i rozszerzenia zakresu na nowe terapie komórkowe.
Proponujemy dwie uzupełniające się metody oceny aktywności tłumiącej komórek. Po pierwsze, metoda in vitro polega na hodowli komórek supresyjnych za pomocą znakowanych efektorowych limfocytów T stymulowanych przez allogeniczne komórki prezentujące antygen dawcy (APC) w różnych proporcjach przez 6 dni oraz analizie proliferacji efektorowych limfocytów T, która odzwierciedla supresję immunologiczną kierowaną przez dawcę. Komórki szczurów leczonych mogą być bezpośrednio porównane z komórkami szczurów nieleczonych i szczurów szczepionych nieleczonych pod kątem aktywności supresyjnej (lub z dowolną inną populacją komórek regulatorowych), w zakresie proporcji supresor:efektor. Co więcej, metoda ta nie wymaga przeszczepu, a wyniki uzyskuje się w ciągu 6 dni. Po drugie, metoda in vivo polega na przeniesieniu zamierzonych komórek regulatorowych z leczonego szczura do nowo napromienionego, przeszczepionego biorcy. Podczas gdy limfocyty B, komórki szpikowe lub limfocyty T od nieleczonych wcześniej szczurów zwykle nie są w stanie zahamować ostrego odrzucenia przeszczepu i przedłużyć przeżycia przeszczepu po transferze adoptywnym, komórki o wzmocnionej aktywności supresyjnej od leczonych biorców mają następujące atrybuty1,2,3,4,33. Limfopenia wywołana napromienianiem biorcy jest zalecana, aby umożliwić komórkom przenoszonym adoptywnie zachowanie obojętności homeostazy krwi i łatwiejsze opanowanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko dawcy. W przypadku obu metod, wykorzystanie in vitro allogenicznych APC stron trzecich lub adoptywny transfer komórek supresyjnych in vivo do biorców przeszczepionych sercem strony trzeciej umożliwia analizę swoistości anty-dawcy. Podczas gdy metoda in vivo wymaga znacznej liczby komórek, słabo reprezentowane subpopulacje komórek mogą być łatwiej ocenione pod kątem aktywności supresyjnej in vitro33.
Odpowiedzi humoralne mogą być również mierzone w celu oceny stanu tolerancji i kontroli ukierunkowanych odpowiedzi przeciwciał na antygeny dawcy. Rzeczywiście, tolerancja może charakteryzować się brakiem odpowiedzi humoralnej wobec dawcy, ale zachowaniem zdolności biorców do rozwinięcia odpowiedzi humoralnej na nowe antygeny i zachowaniem odpowiedzi pamięciowych. Po pierwsze, zasada wykrywania alloprzeciwciał opiera się na rozpoznawaniu komórek dawcy przez przeciwciała biorcy po inkubacji typu komórki dawcy z surowicą od przeszczepionego biorcy. Po drugie, odpowiedzi humoralne skierowane na antygeny egzogenne można ocenić po stymulacji długotrwale tolerancyjnych biorców hemocyjaniną przez dziurkę od klucza (KLH) emulgowaną pełnym adiuwantem Freunda. Obecność swoistych przeciwciał IgM i IgG przeciwko antygenom można wykryć odpowiednio 4 i 13 dni po immunizacji za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)34. Po trzecie, zachowanie odpowiedzi pamięci immunologicznej można ocenić poprzez wstrzyknięcie ksenogenicznych krwinek czerwonych (RBC) w dniach -7 i +3 przeszczepu oraz barwienie krwinek czerwonych surowicą biorcy pobraną w dniach +8 i +17 po przeszczepie. Wszystkie te metody pozwalają na identyfikację podtypów immunoglobulin przy użyciu specyficznych przeciwciał drugorzędowych i szybkie uzyskanie wyników w czasie krótszym niż 1,5 godziny przez barwienie FACS lub kilka godzin przez ELISA.
Na koniec, te protokoły są przeznaczone do charakterystyki modeli transplantacyjnych i mogą być do pewnego stopnia stosowane do modeli chorób autoimmunologicznych. Zasady metody można przenieść na wszystkie gatunki.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1W i LEW.1A szczury</td><td>Janvier Labs, Francja</td><td></td><td>8 tygodni,&nbsp;</td></tr><tr><td>BN szczury dawcy zewnętrznego</td><td>Janvier Labs, Francja</td><td></td><td>8 tygodni,&nbsp;</td></tr><tr><td>nazwa</td><td>company</td><td>numer katalogowy</td><td>comments</td></tr><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francja</td><td></td><td>domowe plazmidy</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>Wirus Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francja</td><td></td><td>domowe plazmidy</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francja</td><td></td><td>domowe plazmidy</td></tr><tr><td>anty-TCRab</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon R7/3</td><td>Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD25</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon</td> <td>OX39Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD8</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon OX8</td><td>Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD45RA</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon OX33</td><td>Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD161</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>3.2.3 klon</td><td>Domowej roboty hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD11b/c</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon OX42</td><td>Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-TCRgd</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania Klon</td><td></td> <td>V65Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD45RC</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon OX22</td><td>Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD4</td><td>Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>Klon OX35</td><td>Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów</td></tr><tr><td>anty-CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554881, His24 klon</td><td></td></tr><tr><td>anty-szczurzy IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#</td><td>112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>antyszczurzy IgG1</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>antyszczurzy IgG2a</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>przeciwszczurzy IgG2b</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>antyszczurzy IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#</td><td>115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>streptawidyna HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis,</td> <td>USA#9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td></td><td>Fosforanowy roztwór buforowy bez wapnia i magnezu,&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA#</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do substratów TMB</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek CellTraceTM Thermo</td><td>Fisher&nbsp; Scientific Inc, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>#C34554</tr><tr><td>RPMI 1640 średni 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#31870-025</td><td></td></tr><tr><td>penicylina streptomycyna</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Hepes</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#15630-056</td><td></td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 beta merkaptoetanol</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#M3148 <tr><td>Barwnik proliferacji komórek eFluor&reg; 450 Cell</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, Stany Zjednoczone</td><td>#65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma, Saint-Louis, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr>#G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td></td><td></td></tr>#D1306 <tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics, Niemcy#</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#E5134 <tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne koraliki dynabeads</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Kozia anty-mysia IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, San Diego, USA</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Izofluran</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Naplbufina</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Terramycyna</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Zapoznaj się z instytucjonalnymi Wytyczne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Kompletny adiuwant</td><td></td><td></td><td></td>Freunda</tr><tr><td>Rompun</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Mleczan pierścienia Zapoznaj</td><td>się z wytycznymi</td><td></td><td></td>instytucjonalnymi</tr><tr><td>Ketamina</td><td>Zapoznaj się z wytycznymi</td><td></td> <td>instytucjonalnymi</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>do lizy krwinek czerwonych</td><td>Rozcieńczyć 8,29 g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1 g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) i 37,2 mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) w 800 ml H2O. Dostosuj pH do 7,2-7,4 i uzupełnij do 1 l H2O.</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 1 g kolagenazy w 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%)Dodaj</td><td></td><td></td> <td>5 ml EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) i 20 ml FCS do 1 ml PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 50&mikro; g (= 1 fiolka) CFDA SE (składnik A) w 90&mu; l Roztwór DMSO (składnik B) w celu uzyskania roztworu podstawowego 10 mM. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1/20 000 w PBS 1X, aby uzyskać 0,5&mu; </td></tr><tr><td>Kompletna pożywka roztworu M do kokultury</td><td></td><td></td><td>500 ml kompletna pożywka RPMI-1640 z 5 ml penicyliny (80 jednostek/ml) -steptomycyny (80 mg / ml), 5 ml L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych (100X), 5 ml pirogronianu sodu (100 mM), 5 ml buforu HEPES (1 M), 2,5 ml b merkaptoetanolu (7 ml bulionu 2-bmerkaptoetylu rozcieńczonego w 10 ml RPMI), 10% FCS</td></tr><<tr><td>strong>name<</td><td>strong>company</td><td>numer katalogowy</td><td>comments</strong</td></tr><tr><td>>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>falcon 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>sito</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning plastikowe naczynia hodowlane</td><td>VWR, Pessac</td><td>#391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&mikro; m oraz 60&mikro; m filtry tkankowe</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Szwajcaria#</td><td>03-100/44 i #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków U płyty denne do kokultury</td><td>&nbsp; Płytka do hodowli tkankowej Falcon U-bottom, sterylna, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków V dolne płytki do barwienia FACS</td><td>ThermoScientifique, Dania</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków płaskie płytki ELISA</td><td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringue do zmiażdżenia śledziony</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik ELISA</td><td>SPARK 10M, Tecan, Szwajcaria</td><td>SPARK 10M, Tecan, Szwajcaria</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bain marie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Promiennik promieni rentgenowskich</td><td>Lincolshire, Anglia</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>mieszadło</td><td></td><td></td><td></td>słoneczne</tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnes</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, Stany Zjednoczone</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek t, b i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Głównym problemem w transplantacji jest osiągnięcie specyficznej tolerancji poprzez indukcję komórek regulatorowych. Zrozumienie mechanizmów tolerancji wymaga wiarygodnych modeli. W tym miejscu opisano modele tolerancji na alloprzeszczep serca u szczurów, indukowany przez blokadę sygnałów kostymulacji lub przez regulację w górę cząsteczek immunoregulacyjnych poprzez transfer genów. Każdy z tych modeli pozwolił na generowanie in vivo komórek regulatorowych, takich jak limfocyty T regulatorowe (Treg), limfocyty B regulatorowe (Bregs) lub komórki szpiku regulatorowego (RegMCs). W tym manuskrypcie opisujemy dwa uzupełniające się protokoły, które zostały wykorzystane do identyfikacji i zdefiniowania aktywności komórek regulatorowych in vitro i in vivo w celu określenia ich odpowiedzialności za indukcję i utrzymanie tolerancji. Po pierwsze, test supresyjny in vitro umożliwił szybką identyfikację komórek o zdolności supresyjnej w efektorowej odpowiedzi immunologicznej w sposób zależny od dawki i może być wykorzystany do dalszych analiz, takich jak pomiar cytokin lub cytotoksyczności. Po drugie, adoptywny transfer komórek od tolerancyjnie leczonego biorcy do nowo napromieniowanego biorcy przeszczepionego podkreślił tolerogenne właściwości tych komórek w kontrolowaniu odpowiedzi immunologicznej kierowanej przeszczepem i / lub przekształcaniu nowych komórek regulatorowych (określanych jako tolerancja zakaźna). Metody te nie są ograniczone do komórek ze znanymi markerami fenotypowymi i mogą być rozszerzone na dowolną populację komórek. Ponadto allospecyficzność komórek regulatorowych kierowana przez dawcę (ważny cel w tej dziedzinie) może być oceniana przy użyciu komórek dawcy od osób trzecich lub przeszczepu in vitro lub in vivo. Wreszcie, aby określić specyficzną zdolność tolerogenną tych komórek regulatorowych, udostępniamy protokoły oceny humoralnej odpowiedzi przeciwciał anty-dawcy oraz zdolności biorcy do rozwinięcia odpowiedzi humoralnej przeciwko nowym lub dawniej znanym antygenom. Opisane modele tolerancji mogą być wykorzystane do dalszej charakterystyki komórek regulatorowych, identyfikacji nowych biomarkerów i cząsteczek immunoregulacyjnych, a także można je dostosować do innych modeli przeszczepów lub chorób autoimmunologicznych u gryzoni lub ludzi.

Ocena aktywności supresyjnej po sortowaniu komórek APC (Rycina 1), komórki efektorowe oraz limfocyty Treg jednocześnie (Rycina 2), lub pojedynczo (Rycina 4), oraz wszelkie inne domniemane komórki regulacyjne (Rycina 3), można przeprowadzić in vivo poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie komórek regulacyjnych i in vitro poprzez pomiar jasności barwnika CFSE (...

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Indukcja tolerancji w transplantacji jest często powiązana z pojawieniem się populacji komórek regulacyjnych. Charakteryzuje się ona brakiem odpowiedzi immunologicznej na dawcę, przy jednoczesnym zachowaniu odporności przeciwko antygenom egzogenicznym. Opracowaliśmy różne protokoły do oceny in vitro oraz in vivo zdolności supresyjnych dowolnego podzbioru komórek regulacyjnych, a także stanu odpowiedzi humoralnej gospodarza.Zanurz szczura dawcy szczepu Lewis 1W w narkozie, stosując inhalację izofluranem w O2 z dodatkiem 1% N2O po upływie pięciu minut. Umieść zwierzę w pozycji na plecach i zdezynfekuj brzuch betadyną w celu przeprowadzenia torakotomii. Zaciśnij żylną tętnicę główną dolną i górną, załóż podwiązki, a następnie je przetnij.Następnie przetnij tętnicę płucną oraz aortę i zachowaj przeszczep w zimnym roztworze NaCl 0.9%. Zpodaj znieczulenie szczurowi biorcy rasy Lewis 1A o masie 150 g i wieku od 8 do 12 tygodni, stosując inhalację izofluranu w O2 z dodatkiem N2O 1%. Umieść zwierzę w pozycji grzbietnej i odkaź brzuch betadyną w celu wykonania laparotomii od głowy do spojenia łonowego. Wyprowadź jelita na zewnątrz i zaklemuj naczynia krwionośne jamy brzusznej. Wykonaj końcow

in-vitro-vivo-assessment-t-b-myeloid-cells-suppressive-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Poznaj metody oceny aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów szczurzych. Protokół umożliwia badanie tolerancji immunologicznej in vitro i in vivo.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Przeglądaj więcej filmów