Przegląd inżynierii genetycznej
Inżynieria genetyczna to celowa zmiana DNA organizmu. Postępy w tej dziedzinie umożliwiły naukowcom generowanie genetycznie modyfikowanych komórek i organizmów do badań biomedycznych i celów rolniczych. Jednak zastosowanie technologii genetycznych do stosowania jako terapia u ludzi, znane jako terapia genowa, jest nadal w toku.
W tym filmie omówimy kilka ważnych odkryć w historii inżynierii genetycznej, główne pytania, które są obecnie badane, ważne narzędzia do zmiany genomu organizmu oraz kilka zastosowań tych technologii.
Zacznijmy od przeglądu historii inżynierii genetycznej.
Zdolność naukowców do bezpośredniego manipulowania genami zależała od rozwiązania kwestii tożsamości materiału genetycznego. W 1928 roku Frederick Griffith zaobserwował, że wstrzyknięcie myszom mieszanki zabitych termicznie zjadliwych bakterii i żywego, ale niezjadliwego szczepu powodowało chorobę, co skłoniło go do wysunięcia hipotezy o "zasadzie transformacji", która przenosi się z martwych na żywe bakterie.
W 1944 roku Oswald Avery, Colin Macleod i Maclyn McCarty zidentyfikowali DNA bakterii jako odpowiedzialne za tę transformację. Wynik został następnie potwierdzony w 1952 roku, kiedy Alfred Hershey i Martha Chase użyli radioaktywnie znakowanego bakteriofaga, aby wykazać, że to DNA wirusa, a nie białko, zostało przekazane podczas infekcji komórek bakteryjnych.
Również w 1952 roku Joshua Lederberg wysunął hipotezę o istnieniu plazmidów – małych, okrągłych fragmentów DNA, które mogą być przenoszone między bakteriami. Mniej więcej w tym samym czasie opisał również transdukcję, w której wirusy działają jako wektory do przenoszenia DNA między komórkami.
Począwszy od około 1970 roku, badacze tacy jak Hamilton Smith zaczęli odkrywać niektóre z praktycznych "narzędzi" inżynierii genetycznej, takich jak endonukleazy restrykcyjne, które "tną" DNA w określonych sekwencjach. Korzystając z tych narzędzi, w 1972 roku Paul Berg wygenerował pierwszą "rekombinowatą" cząsteczkę DNA, łącząc DNA dwóch różnych wirusów, a równolegle Stanley Cohen i Herbert Boyer stworzyli pierwszy rekombinowany organizm, umieszczając gen oporności na antybiotyki na plazmidzie i przekształcając ten konstrukt w bakterię E. coli.
W 1973 roku Rudolf Jaenisch stworzył pierwszy transgeniczny organizm wielokomórkowy, mysz zawierającą DNA wirusa SV40, chociaż dopiero w 1981 roku kilka innych laboratoriów stworzyło pierwsze transgeniczne myszy zdolne do przekazania wstawionych genów swojemu potomstwu. W połowie lat osiemdziesiątych Mario Capecchi i Oliver Smithies po raz pierwszy ustalili, że rekombinacja homologiczna może być wykorzystana do specyficznego celowania w geny, a w 1989 roku wykorzystali tę metodę do wygenerowania pierwszej myszy z nokautem, w której gen staje się niefunkcjonalny.
Następnie przyjrzyjmy się kilku kluczowym kwestiom inżynierii genetycznej.
Jednym z integralnych obszarów badań jest określenie najlepszej metody modyfikacji genomu organizmu. Należy wziąć pod uwagę szereg czynników, w tym skuteczność procesu modyfikacji, a także to, czy modyfikacja musi być ukierunkowana na określone geny, aby zminimalizować ryzyko niezamierzonych zmian w DNA komórkowym.
Aby zmodyfikować genom komórki gospodarza, sztucznie zmontowana sekwencja DNA do tej modyfikacji, znana jako "konstrukt genetyczny", musi zostać pomyślnie dostarczona do tej komórki. Badania w tej dziedzinie mają na celu maksymalizację efektywności przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności. Na poziomie organizmu naukowcy badają, w jaki sposób modyfikować wektory, takie jak cząstki retrowirusowe lub nanocząstki, aby poprawić dostarczanie konstruktu do docelowych populacji komórek.
Wreszcie, istnieje duże zainteresowanie tym, czy inżynieria genetyczna może być z powodzeniem stosowana w zastosowaniach rolniczych lub terapeutycznych. Technologie te zostały wykorzystane do stworzenia potężnych narzędzi badawczych, takich jak myszy z usuniętymi lub "znokautowanymi genami", lub do wprowadzenia do upraw prostych, pojedynczych cech, takich jak odporność na herbicydy. Jednak złożone problemy, takie jak generowanie upraw, które rozwijają się w niesprzyjających warunkach, prawdopodobnie będą wymagały jednoczesnej modyfikacji wielu ścieżek. Ponadto opracowanie terapii genowych w leczeniu chorób genetycznych, które wymagają bezpiecznego i skutecznego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek ludzkich, pozostaje trudnym zadaniem.
Przyjrzyjmy się teraz narzędziom i technologiom inżynierii genetycznej wykorzystywanym przez badaczy.
Klasyczną metodą generowania konstruktów genetycznych jest klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych, w którym fragmenty DNA są trawione, a następnie rekombinowane w określonej kolejności przy użyciu ligaz DNA w celu utworzenia nowego plazmidu. Nowsze techniki obejmują rekombinację, która wykorzystuje rekombinację homologiczną do izolowania i wymiany fragmentów DNA bez konieczności stosowania miejsc trawienia enzymów restrykcyjnych.
DNA może być dostarczane do komórek na wiele sposobów. Transformacja lub transfekcja to proces wprowadzania nagiego DNA odpowiednio do komórek bakteryjnych lub eukariotycznych. Kationy dwuwartościowe, takie jak wapń, mogą powodować większą porowatość błon komórkowych, co zwiększa wychwyt egzogennych cząsteczek DNA. Elektroporacja wykorzystuje pole elektryczne do wykonania tego samego zadania, podczas gdy nanocząstki lipidowe otaczające DNA mogą łączyć się z błoną komórkową i uwalniać jej ładunek. Transdukcja odnosi się do przenoszenia DNA przez wektor wirusowy, taki jak lentiwirus.
Dostarczanie konstruktów genetycznych do organizmów wielokomórkowych wymaga dodatkowych rozważań. Gdy obecnych jest wiele typów komórek, docelowe wektory, takie jak wirusy lub nanocząsteczki, zwiększają specyficzność dostarczania komórek. W przypadku roślin naukowcy dokooptowali agrobacterium, patogen roślinny zdolny do przenoszenia DNA do komórek roślinnych, jako narzędzie dostarczania genów. "Biolistics" odnosi się do użycia "pistoletu genowego" do dostarczania złotych kulek pokrytych DNA do komórek.
Wreszcie, dostarczone konstrukty DNA muszą dokonać trwałych zmian w genomie gospodarza, aby osiągnąć długoterminowe efekty. Może się to zdarzyć poprzez losową integrację dostarczonego konstruktu DNA z DNA gospodarza, którą można wzmocnić poprzez znakowanie konstruktu miejscami rozpoznawania enzymów "wycinania i wklejania" DNA zwanych transpozazami. Z drugiej strony, techniki takie jak celowanie w geny poprzez rekombinację homologiczną umożliwiają integrację z określonymi miejscami genomowymi. Ostatnie postępy w technikach znanych jako edycja genomu, która wykorzystuje specjalnie zaprojektowane nukleazy do generowania pęknięć dwuniciowych w określonych loci, znacznie poprawiają skuteczność celowania genów.
Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób technologie inżynierii genetycznej są obecnie stosowane.
Funkcje komórkowe u eukariontów są podzielone na organelle, a ukierunkowanie ekspresji białka transgenicznego na poszczególne przedziały może pozwolić na bardziej specyficzne efekty biologiczne. W tym eksperymencie naukowcy wygenerowali konstrukt reporterowy oznaczony GFP przy użyciu techniki składania Gibsona, w której homologiczne regiony nakładania się wielu produktów PCR pozwalają na wygenerowanie kompletnego konstruktu bez użycia enzymów restrykcyjnych. Do dostarczenia tych konstruktów do komórek roślinnych wykorzystano transfekcję biolistyczną, a naukowcy byli w stanie wykazać ekspresję GFP ukierunkowaną na chloroplast.
Komórki nowotworowe często wykazują nadmierną ekspresję receptorów powierzchniowych, które naukowcy mogą celować za pomocą terapii genowej. Tutaj naukowcy stworzyli model ludzkiego raka pęcherza moczowego u myszy. Następnie następuje miejscowe dostarczanie wektora adenowirusowego do komórek raka pęcherza moczowego. Obserwacja ekspresji lucyferazy w komórkach nowotworowych wskazywała na pomyślne dostarczenie genu reporterowego.
Wreszcie, poczyniono postępy w inżynierii kompletnych szlaków biologicznych w organizmie docelowym. W tym przypadku każdy gen szlaku biosyntezy antybiotyku erytromycyny został wyizolowany z bakterii gospodarza, Saccharopolyspora erythraea, za pomocą PCR i połączony w konstrukty podobne do operonów, w których szereg genów jest kontrolowany przez te same elementy regulatorowe, aby umożliwić optymalną ekspresję. Konstrukty te zostały następnie przekształcone w E. coli w celu odtworzenia szlaku syntezy, a heterologicznie wytworzony produkt mógł być następnie oczyszczony i przetestowany pod kątem funkcjonalności.
Właśnie obejrzałeś przegląd inżynierii genetycznej JoVE. W tym filmie omówiliśmy historię inżynierii genetycznej, przeanalizowaliśmy główne pytania, narzędzia w tej dziedzinie i przedstawiliśmy kilka przykładów zastosowań inżynierii genetycznej. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Inżynieria genetyczna – proces celowej zmiany DNA organizmu – została wykorzystana do stworzenia potężnych narzędzi badawczych i organizmów modelowych…
Inżynieria genetyczna to celowa zmiana DNA organizmu. Postępy w tej dziedzinie umożliwiły naukowcom generowanie genetycznie modyfikowanych komórek i organizmów do badań biomedycznych i celów rolniczych. Jednak zastosowanie technologii genetycznych do stosowania jako terapia u ludzi, znane jako terapia genowa, jest nadal w toku.
W tym filmie omówimy kilka ważnych odkryć w historii inżynierii genetycznej, główne pytania, które są obecnie badane, ważne narzędzia do zmiany genomu organizmu oraz kilka zastosowań tych technologii.
Zacznijmy od przeglądu historii inżynierii genetycznej.
Zdolność naukowców do bezpośredniego manipulowania genami zależała od rozwiązania kwestii tożsamości materiału genetycznego. W 1928 roku Frederick Griffith zaobserwował, że wstrzyknięcie myszom mieszanki zabitych termicznie zjadliwych bakterii i żywego, ale niezjadliwego szczepu powodowało chorobę, co skłoniło go do wysunięcia hipotezy o "zasadzie transformacji", która przenosi się z martwych na żywe bakterie.
W 1944 roku Oswald Avery, Colin Macleod i Maclyn McCarty zidentyfikowali DNA bakterii jako odpowiedzialne za tę transformację. Wynik został następnie potwierdzony w 1952 roku, kiedy Alfred Hershey i Martha Chase użyli radioaktywnie znakowanego bakteriofaga, aby wykazać, że to DNA wirusa, a nie białko, zostało przekazane podczas infekcji komórek bakteryjnych.
Również w 1952 roku Joshua Lederberg wysunął hipotezę o istnieniu plazmidów – małych, okrągłych fragmentów DNA, które mogą być przenoszone między bakteriami. Mniej więcej w tym samym czasie opisał również transdukcję, w której wirusy działają jako wektory do przenoszenia DNA między komórkami.
Począwszy od około 1970 roku, badacze tacy jak Hamilton Smith zaczęli odkrywać niektóre z praktycznych "narzędzi" inżynierii genetycznej, takich jak endonukleazy restrykcyjne, które "tną" DNA w określonych sekwencjach. Korzystając z tych narzędzi, w 1972 roku Paul Berg wygenerował pierwszą "rekombinowatą" cząsteczkę DNA, łącząc DNA dwóch różnych wirusów, a równolegle Stanley Cohen i Herbert Boyer stworzyli pierwszy rekombinowany organizm, umieszczając gen oporności na antybiotyki na plazmidzie i przekształcając ten konstrukt w bakterię E. coli.
W 1973 roku Rudolf Jaenisch stworzył pierwszy transgeniczny organizm wielokomórkowy, mysz zawierającą DNA wirusa SV40, chociaż dopiero w 1981 roku kilka innych laboratoriów stworzyło pierwsze transgeniczne myszy zdolne do przekazania wstawionych genów swojemu potomstwu. W połowie lat osiemdziesiątych Mario Capecchi i Oliver Smithies po raz pierwszy ustalili, że rekombinacja homologiczna może być wykorzystana do specyficznego celowania w geny, a w 1989 roku wykorzystali tę metodę do wygenerowania pierwszej myszy z nokautem, w której gen staje się niefunkcjonalny.
Następnie przyjrzyjmy się kilku kluczowym kwestiom inżynierii genetycznej.
Jednym z integralnych obszarów badań jest określenie najlepszej metody modyfikacji genomu organizmu. Należy wziąć pod uwagę szereg czynników, w tym skuteczność procesu modyfikacji, a także to, czy modyfikacja musi być ukierunkowana na określone geny, aby zminimalizować ryzyko niezamierzonych zmian w DNA komórkowym.
Aby zmodyfikować genom komórki gospodarza, sztucznie zmontowana sekwencja DNA do tej modyfikacji, znana jako "konstrukt genetyczny", musi zostać pomyślnie dostarczona do tej komórki. Badania w tej dziedzinie mają na celu maksymalizację efektywności przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności. Na poziomie organizmu naukowcy badają, w jaki sposób modyfikować wektory, takie jak cząstki retrowirusowe lub nanocząstki, aby poprawić dostarczanie konstruktu do docelowych populacji komórek.
Wreszcie, istnieje duże zainteresowanie tym, czy inżynieria genetyczna może być z powodzeniem stosowana w zastosowaniach rolniczych lub terapeutycznych. Technologie te zostały wykorzystane do stworzenia potężnych narzędzi badawczych, takich jak myszy z usuniętymi lub "znokautowanymi genami", lub do wprowadzenia do upraw prostych, pojedynczych cech, takich jak odporność na herbicydy. Jednak złożone problemy, takie jak generowanie upraw, które rozwijają się w niesprzyjających warunkach, prawdopodobnie będą wymagały jednoczesnej modyfikacji wielu ścieżek. Ponadto opracowanie terapii genowych w leczeniu chorób genetycznych, które wymagają bezpiecznego i skutecznego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek ludzkich, pozostaje trudnym zadaniem.
Przyjrzyjmy się teraz narzędziom i technologiom inżynierii genetycznej wykorzystywanym przez badaczy.
Klasyczną metodą generowania konstruktów genetycznych jest klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych, w którym fragmenty DNA są trawione, a następnie rekombinowane w określonej kolejności przy użyciu ligaz DNA w celu utworzenia nowego plazmidu. Nowsze techniki obejmują rekombinację, która wykorzystuje rekombinację homologiczną do izolowania i wymiany fragmentów DNA bez konieczności stosowania miejsc trawienia enzymów restrykcyjnych.
DNA może być dostarczane do komórek na wiele sposobów. Transformacja lub transfekcja to proces wprowadzania nagiego DNA odpowiednio do komórek bakteryjnych lub eukariotycznych. Kationy dwuwartościowe, takie jak wapń, mogą powodować większą porowatość błon komórkowych, co zwiększa wychwyt egzogennych cząsteczek DNA. Elektroporacja wykorzystuje pole elektryczne do wykonania tego samego zadania, podczas gdy nanocząstki lipidowe otaczające DNA mogą łączyć się z błoną komórkową i uwalniać jej ładunek. Transdukcja odnosi się do przenoszenia DNA przez wektor wirusowy, taki jak lentiwirus.
Dostarczanie konstruktów genetycznych do organizmów wielokomórkowych wymaga dodatkowych rozważań. Gdy obecnych jest wiele typów komórek, docelowe wektory, takie jak wirusy lub nanocząsteczki, zwiększają specyficzność dostarczania komórek. W przypadku roślin naukowcy dokooptowali agrobacterium, patogen roślinny zdolny do przenoszenia DNA do komórek roślinnych, jako narzędzie dostarczania genów. "Biolistics" odnosi się do użycia "pistoletu genowego" do dostarczania złotych kulek pokrytych DNA do komórek.
Wreszcie, dostarczone konstrukty DNA muszą dokonać trwałych zmian w genomie gospodarza, aby osiągnąć długoterminowe efekty. Może się to zdarzyć poprzez losową integrację dostarczonego konstruktu DNA z DNA gospodarza, którą można wzmocnić poprzez znakowanie konstruktu miejscami rozpoznawania enzymów "wycinania i wklejania" DNA zwanych transpozazami. Z drugiej strony, techniki takie jak celowanie w geny poprzez rekombinację homologiczną umożliwiają integrację z określonymi miejscami genomowymi. Ostatnie postępy w technikach znanych jako edycja genomu, która wykorzystuje specjalnie zaprojektowane nukleazy do generowania pęknięć dwuniciowych w określonych loci, znacznie poprawiają skuteczność celowania genów.
Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób technologie inżynierii genetycznej są obecnie stosowane.
Funkcje komórkowe u eukariontów są podzielone na organelle, a ukierunkowanie ekspresji białka transgenicznego na poszczególne przedziały może pozwolić na bardziej specyficzne efekty biologiczne. W tym eksperymencie naukowcy wygenerowali konstrukt reporterowy oznaczony GFP przy użyciu techniki składania Gibsona, w której homologiczne regiony nakładania się wielu produktów PCR pozwalają na wygenerowanie kompletnego konstruktu bez użycia enzymów restrykcyjnych. Do dostarczenia tych konstruktów do komórek roślinnych wykorzystano transfekcję biolistyczną, a naukowcy byli w stanie wykazać ekspresję GFP ukierunkowaną na chloroplast.
Komórki nowotworowe często wykazują nadmierną ekspresję receptorów powierzchniowych, które naukowcy mogą celować za pomocą terapii genowej. Tutaj naukowcy stworzyli model ludzkiego raka pęcherza moczowego u myszy. Następnie następuje miejscowe dostarczanie wektora adenowirusowego do komórek raka pęcherza moczowego. Obserwacja ekspresji lucyferazy w komórkach nowotworowych wskazywała na pomyślne dostarczenie genu reporterowego.
Wreszcie, poczyniono postępy w inżynierii kompletnych szlaków biologicznych w organizmie docelowym. W tym przypadku każdy gen szlaku biosyntezy antybiotyku erytromycyny został wyizolowany z bakterii gospodarza, Saccharopolyspora erythraea, za pomocą PCR i połączony w konstrukty podobne do operonów, w których szereg genów jest kontrolowany przez te same elementy regulatorowe, aby umożliwić optymalną ekspresję. Konstrukty te zostały następnie przekształcone w E. coli w celu odtworzenia szlaku syntezy, a heterologicznie wytworzony produkt mógł być następnie oczyszczony i przetestowany pod kątem funkcjonalności.
Właśnie obejrzałeś przegląd inżynierii genetycznej JoVE. W tym filmie omówiliśmy historię inżynierii genetycznej, przeanalizowaliśmy główne pytania, narzędzia w tej dziedzinie i przedstawiliśmy kilka przykładów zastosowań inżynierii genetycznej. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Inżynieria genetyczna to celowa zmiana DNA organizmu. Postępy w tej dziedzinie umożliwiły naukowcom generowanie genetycznie modyfikowanych komórek i organizmów do badań biomedycznych i celów rolniczych. Jednak zastosowanie technologii genetycznych do stosowania jako terapia u ludzi, znane jako terapia genowa, jest nadal w toku.
W tym filmie omówimy kilka ważnych odkryć w historii inżynierii genetycznej, główne pytania, które są obecnie badane, ważne narzędzia do zmiany genomu organizmu oraz kilka zastosowań tych technologii.
Zacznijmy od przeglądu historii inżynierii genetycznej.
Zdolność naukowców do bezpośredniego manipulowania genami zależała od rozwiązania kwestii tożsamości materiału genetycznego. W 1928 roku Frederick Griffith zaobserwował, że wstrzyknięcie myszom mieszanki zabitych termicznie zjadliwych bakterii i żywego, ale niezjadliwego szczepu powodowało chorobę, co skłoniło go do wysunięcia hipotezy o "zasadzie transformacji", która przenosi się z martwych na żywe bakterie.
W 1944 roku Oswald Avery, Colin Macleod i Maclyn McCarty zidentyfikowali DNA bakterii jako odpowiedzialne za tę transformację. Wynik został następnie potwierdzony w 1952 roku, kiedy Alfred Hershey i Martha Chase użyli radioaktywnie znakowanego bakteriofaga, aby wykazać, że to DNA wirusa, a nie białko, zostało przekazane podczas infekcji komórek bakteryjnych.
Również w 1952 roku Joshua Lederberg wysunął hipotezę o istnieniu plazmidów – małych, okrągłych fragmentów DNA, które mogą być przenoszone między bakteriami. Mniej więcej w tym samym czasie opisał również transdukcję, w której wirusy działają jako wektory do przenoszenia DNA między komórkami.
Począwszy od około 1970 roku, badacze tacy jak Hamilton Smith zaczęli odkrywać niektóre z praktycznych "narzędzi" inżynierii genetycznej, takich jak endonukleazy restrykcyjne, które "tną" DNA w określonych sekwencjach. Korzystając z tych narzędzi, w 1972 roku Paul Berg wygenerował pierwszą "rekombinowatą" cząsteczkę DNA, łącząc DNA dwóch różnych wirusów, a równolegle Stanley Cohen i Herbert Boyer stworzyli pierwszy rekombinowany organizm, umieszczając gen oporności na antybiotyki na plazmidzie i przekształcając ten konstrukt w bakterię E. coli.
W 1973 roku Rudolf Jaenisch stworzył pierwszy transgeniczny organizm wielokomórkowy, mysz zawierającą DNA wirusa SV40, chociaż dopiero w 1981 roku kilka innych laboratoriów stworzyło pierwsze transgeniczne myszy zdolne do przekazania wstawionych genów swojemu potomstwu. W połowie lat osiemdziesiątych Mario Capecchi i Oliver Smithies po raz pierwszy ustalili, że rekombinacja homologiczna może być wykorzystana do specyficznego celowania w geny, a w 1989 roku wykorzystali tę metodę do wygenerowania pierwszej myszy z nokautem, w której gen staje się niefunkcjonalny.
Następnie przyjrzyjmy się kilku kluczowym kwestiom inżynierii genetycznej.
Jednym z integralnych obszarów badań jest określenie najlepszej metody modyfikacji genomu organizmu. Należy wziąć pod uwagę szereg czynników, w tym skuteczność procesu modyfikacji, a także to, czy modyfikacja musi być ukierunkowana na określone geny, aby zminimalizować ryzyko niezamierzonych zmian w DNA komórkowym.
Aby zmodyfikować genom komórki gospodarza, sztucznie zmontowana sekwencja DNA do tej modyfikacji, znana jako "konstrukt genetyczny", musi zostać pomyślnie dostarczona do tej komórki. Badania w tej dziedzinie mają na celu maksymalizację efektywności przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności. Na poziomie organizmu naukowcy badają, w jaki sposób modyfikować wektory, takie jak cząstki retrowirusowe lub nanocząstki, aby poprawić dostarczanie konstruktu do docelowych populacji komórek.
Wreszcie, istnieje duże zainteresowanie tym, czy inżynieria genetyczna może być z powodzeniem stosowana w zastosowaniach rolniczych lub terapeutycznych. Technologie te zostały wykorzystane do stworzenia potężnych narzędzi badawczych, takich jak myszy z usuniętymi lub "znokautowanymi genami", lub do wprowadzenia do upraw prostych, pojedynczych cech, takich jak odporność na herbicydy. Jednak złożone problemy, takie jak generowanie upraw, które rozwijają się w niesprzyjających warunkach, prawdopodobnie będą wymagały jednoczesnej modyfikacji wielu ścieżek. Ponadto opracowanie terapii genowych w leczeniu chorób genetycznych, które wymagają bezpiecznego i skutecznego dostarczania konstruktów genetycznych do komórek ludzkich, pozostaje trudnym zadaniem.
Przyjrzyjmy się teraz narzędziom i technologiom inżynierii genetycznej wykorzystywanym przez badaczy.
Klasyczną metodą generowania konstruktów genetycznych jest klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych, w którym fragmenty DNA są trawione, a następnie rekombinowane w określonej kolejności przy użyciu ligaz DNA w celu utworzenia nowego plazmidu. Nowsze techniki obejmują rekombinację, która wykorzystuje rekombinację homologiczną do izolowania i wymiany fragmentów DNA bez konieczności stosowania miejsc trawienia enzymów restrykcyjnych.
DNA może być dostarczane do komórek na wiele sposobów. Transformacja lub transfekcja to proces wprowadzania nagiego DNA odpowiednio do komórek bakteryjnych lub eukariotycznych. Kationy dwuwartościowe, takie jak wapń, mogą powodować większą porowatość błon komórkowych, co zwiększa wychwyt egzogennych cząsteczek DNA. Elektroporacja wykorzystuje pole elektryczne do wykonania tego samego zadania, podczas gdy nanocząstki lipidowe otaczające DNA mogą łączyć się z błoną komórkową i uwalniać jej ładunek. Transdukcja odnosi się do przenoszenia DNA przez wektor wirusowy, taki jak lentiwirus.
Dostarczanie konstruktów genetycznych do organizmów wielokomórkowych wymaga dodatkowych rozważań. Gdy obecnych jest wiele typów komórek, docelowe wektory, takie jak wirusy lub nanocząsteczki, zwiększają specyficzność dostarczania komórek. W przypadku roślin naukowcy dokooptowali agrobacterium, patogen roślinny zdolny do przenoszenia DNA do komórek roślinnych, jako narzędzie dostarczania genów. "Biolistics" odnosi się do użycia "pistoletu genowego" do dostarczania złotych kulek pokrytych DNA do komórek.
Wreszcie, dostarczone konstrukty DNA muszą dokonać trwałych zmian w genomie gospodarza, aby osiągnąć długoterminowe efekty. Może się to zdarzyć poprzez losową integrację dostarczonego konstruktu DNA z DNA gospodarza, którą można wzmocnić poprzez znakowanie konstruktu miejscami rozpoznawania enzymów "wycinania i wklejania" DNA zwanych transpozazami. Z drugiej strony, techniki takie jak celowanie w geny poprzez rekombinację homologiczną umożliwiają integrację z określonymi miejscami genomowymi. Ostatnie postępy w technikach znanych jako edycja genomu, która wykorzystuje specjalnie zaprojektowane nukleazy do generowania pęknięć dwuniciowych w określonych loci, znacznie poprawiają skuteczność celowania genów.
Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób technologie inżynierii genetycznej są obecnie stosowane.
Funkcje komórkowe u eukariontów są podzielone na organelle, a ukierunkowanie ekspresji białka transgenicznego na poszczególne przedziały może pozwolić na bardziej specyficzne efekty biologiczne. W tym eksperymencie naukowcy wygenerowali konstrukt reporterowy oznaczony GFP przy użyciu techniki składania Gibsona, w której homologiczne regiony nakładania się wielu produktów PCR pozwalają na wygenerowanie kompletnego konstruktu bez użycia enzymów restrykcyjnych. Do dostarczenia tych konstruktów do komórek roślinnych wykorzystano transfekcję biolistyczną, a naukowcy byli w stanie wykazać ekspresję GFP ukierunkowaną na chloroplast.
Komórki nowotworowe często wykazują nadmierną ekspresję receptorów powierzchniowych, które naukowcy mogą celować za pomocą terapii genowej. Tutaj naukowcy stworzyli model ludzkiego raka pęcherza moczowego u myszy. Następnie następuje miejscowe dostarczanie wektora adenowirusowego do komórek raka pęcherza moczowego. Obserwacja ekspresji lucyferazy w komórkach nowotworowych wskazywała na pomyślne dostarczenie genu reporterowego.
Wreszcie, poczyniono postępy w inżynierii kompletnych szlaków biologicznych w organizmie docelowym. W tym przypadku każdy gen szlaku biosyntezy antybiotyku erytromycyny został wyizolowany z bakterii gospodarza, Saccharopolyspora erythraea, za pomocą PCR i połączony w konstrukty podobne do operonów, w których szereg genów jest kontrolowany przez te same elementy regulatorowe, aby umożliwić optymalną ekspresję. Konstrukty te zostały następnie przekształcone w E. coli w celu odtworzenia szlaku syntezy, a heterologicznie wytworzony produkt mógł być następnie oczyszczony i przetestowany pod kątem funkcjonalności.
Właśnie obejrzałeś przegląd inżynierii genetycznej JoVE. W tym filmie omówiliśmy historię inżynierii genetycznej, przeanalizowaliśmy główne pytania, narzędzia w tej dziedzinie i przedstawiliśmy kilka przykładów zastosowań inżynierii genetycznej. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What key discoveries established DNA as the genetic material?
Frederick Griffith's 1928 experiments with bacteria suggested a transforming principle. Oswald Avery, Colin Macleod, and Maclyn McCarty identified DNA as responsible for transformation in 1944. Alfred Hershey and Martha Chase confirmed in 1952 that viral DNA, not protein, transmits genetic information during bacterial infection using radioactively labeled bacteriophage.
Q2: How do restriction enzymes and DNA ligases work together in genetic engineering?
Restriction enzymes cut DNA at specific sequences, breaking it into fragments. DNA ligases then join these fragments in desired orders to create new plasmids. This restriction enzyme-based cloning method was foundational for generating genetic constructs before newer techniques like recombineering and gene targeting emerged.
Q3: What are the main methods for delivering DNA into cells?
Transformation and transfection use divalent cations like calcium to increase cell membrane permeability for naked DNA uptake. Electroporation applies electric fields for the same purpose. Lipid nanoparticles surround DNA and fuse with membranes, while transduction uses viral vectors like lentiviruses to transfer genetic material into cells.
Q4: How do homologous recombination and genome editing differ in targeting genes?
Homologous recombination allows integration into specific genomic sites by matching DNA sequences, enabling precise gene targeting. Genome editing uses custom-designed nucleases to generate double-strand breaks at specific loci, greatly improving targeting efficiency. Both techniques minimize off-target effects compared to random DNA integration.
Q5: What is the difference between knockout mice and transgenic mice?
Transgenic mice contain inserted foreign genes, like SV40 viral DNA, and can pass these genes to offspring. Knockout mice have specific genes rendered nonfunctional through homologous recombination. Rudolf Jaenisch created the first transgenic mouse in 1973, while Mario Capecchi and Oliver Smithies generated the first knockout mouse in 1989.
Q6: How is genetic engineering applied to treat cancer using gene therapy?
Researchers target cancer cells that over-express surface receptors using adenoviral vectors. In bladder cancer models, topical delivery of the vector to cancer cells enables successful gene transfer. Luciferase reporter genes confirm successful delivery, demonstrating how gene therapy can target specific cancer cell populations for therapeutic intervention.
Q7: What challenges remain in applying genetic engineering to complex agricultural problems?
Simple traits like herbicide resistance are achievable, but complex problems such as stress tolerance require modifying multiple pathways simultaneously. Safe and efficient delivery of genetic constructs to target cells remains challenging. Additionally, minimizing off-target effects and ensuring long-term stability of modifications are critical considerations for successful agricultural applications.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:49
Historical Highlights
3:41
Key Questions
5:25
Prominent Methods
8:09
Applications
10:11
Summary