Name: Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę indukcji przejścia mezenchymalno-nabłonkowego w komórkach mięsaka przy użyciu mikroRNA-200 i GRHL2. Technika ta pozwala badać plastyczność fenotypową i sieci regulacji genowej w celu opracowania nowych strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JAS dziękuje za wsparcie ze strony Duke Cancer Institute, The Duke University Genitourinary Oncology Laboratory oraz Duke University Department of Orthopaedics. HL był wspierany przez Centrum Teoretycznej Fizyki Biologicznej Narodowej Fundacji Nauki (NSF) (NSF PHY-1427654) i NSF DMS-1361411, a także jako stypendysta CPRIT (Cancer Prevention and Research Institute of Texas) w dziedzinie badań nad rakiem stanu Teksas na Uniwersytecie Rice. KEW był wspierany przez NIH F32 CA192630 MKJ i HL skorzystał z użytecznych dyskusji z Mary C. Farach-Carson, J. N. Onuchic, Samirem M. Hanashem, Kennethem J. Pientą i Donaldem S. Coffeyem.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj DMEM do hodowli komórkowej, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (5 000 U / ml) do 500 ml DMEM. Pożywka ta może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.</li>
	<li>Zawiesić liofilizowane startery w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 10 μM. Ponownie zawieszone startery przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (150 mM NaCl, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Przed użyciem uzupełnij koktajlem inhibitorów proteazy i utrzymuj bufor na lodzie podczas użytkowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 10 mg/ml polibrenu (bromku heksadimetryny) w wodzie i filtrze strzykawkowym do sterylizacji za pomocą filtra polieterosulfonowego 0,45 μm. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy błękitnego chlorku tetrazolowego o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 10 mg w 10 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Transdukcja lotiwirusowa GRHL2
Dzień 1
<ol>
	<li>Płytka 3 x 105 HEK293T komórek na studzienkę płytki 6-dołkowej w 2 ml uzupełnionego DMEM. Określ ilościowo komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Komórki powinny zlewać się w 40 - 60% po całonocnej hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="2">
	<li>Rozcieńczyć 2 μg pustego wektora (pCMV-UBC-EGFP) lub 2 μg pCMV-GRHL2-UBC-EGFP24,25 w 200 μl pożywki bez surowicy wraz z 1,8 μg pΔ8,9 i 0,2 μg plazmidów pomocniczych pCMV-VSV-G. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 4 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w 200 μl pożywki wolnej od surowicy na transfekcję (8 μl na 400 μl dla dwóch próbek). Dodać 200 μl mieszaniny odczynników do transfekcji do każdego roztworu plazmidu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji przemyć HEK293T komórki, usuwając pożywkę przez aspirację próżniową i przepłukując komórki 1 ml PBS. Zastąp PBS 800 μl pożywki bez surowicy. Po 20 minutach dodać kroplami 200 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji i plazmidu z etapu 2.2 do każdej studzienki i inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę transfekcyjną przez aspirację próżniową i zastąpić 2 ml uzupełnionego DMEM. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze w celu przeprowadzenia hodowli przez noc. 
	UWAGA: HEK293T komórki są luźno przylegające. Wymianę pożywki należy przeprowadzać ostrożnie, aby ograniczyć usuwanie komórek z dna naczynia lub kolby.</li>
</ol>
Dzień 3
<ol start="5">
	<li>Odświeżyć pożywkę na transfekowanych komórkach HEK293T i płytce 3 x 10 komórek5 RD na dołek płytki 6-dołkowej w 2 ml uzupełnionego DMEM. Hodowla komórek przez noc. Komórki RD to dostępna na rynku ludzka linia komórkowa mięsaka prążkowanokomórkowego.</li>
</ol>
Dzień 4
<ol start="6">
	<li>Zbierz pożywkę wirusową z komórek HEK293T. Odpipetować pożywkę DMEM z komórek HEK293T i umieścić w nowej stożkowej pożywce o pojemności 15 ml. Ostrożnie wymień na nową pożywkę DMEM i umieść HEK293T komórki z powrotem w inkubatorze na następny dzień.</li>
	<li>Dodać 2 μl 10 mg/ml polibrenu na ml pożywki wirusowej do dwóch nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml (jednej do transfekcji pustego wektora, a drugiej do transfekcji GRHL2). Strzykawkę przefiltruj pożywkę wirusową, wyjmując tłok ze strzykawki o pojemności 3 ml i przymocuj filtr polieterosulfonowy 0,45 μm do końcówki.
	<ol>
		<li>Dodaj pożywkę wirusową zebraną w kroku 2.6 do cylindra strzykawki i zanurz pożywkę w nowych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających polibren. Usuń pożywkę z komórek RD przez aspirację próżniową i dodaj przefiltrowane pożywki wirusowe do komórek RD.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 5
<ol start="8">
	<li>Powtórz dzień 4. HEK293T komórki można wyrzucić po pobraniu pożywki wirusowej.</li>
</ol>
Dzień 7
<ol start="9">
	<li>Umyj komórki RD 1 ml PBS i dodaj 200 μl 0,05% trypsyny do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, dodać 2 ml uzupełnionej pożywki i przenieść zawiesinę komórkową do nowej pożywki stożkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zassać pożywkę. Zawiesić w 1 ml DMEM (uzupełnionym 5% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny). 
	UWAGA: Użycie wyższego procentu FBS może spowodować zatkanie podczas cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Komórki filtracyjne do cytometrii przepływowej. Za pomocą pipety nanieść zawiesinę komórek RD o pojemności 1 ml przez filtr 30 μm do probówek do cytometrii przepływowej i umieścić probówki na lodzie.</li>
		<li>Posortuj komórki EGFP+26 do 1,5 ml probówek mikrowirówkowych zawierających 0,5 ml DMEM uzupełnionych 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i umieść na lodzie. Płytki posortowane komórkami EGFP+ w sumie 1 ml uzupełnionego DMEM do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce i umieścić w inkubatorze w celu hodowli. 
		UWAGA: Wydajność komórek EGFP+ z cytometrii przepływowej po tej transdukcji jest zwykle niska (50 000-100 000 komórek). Komórki mogą wymagać hodowli przez 10-14 dni przed przejściem do kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Odwrotna transfekcja miR-200s
<ol>
	<li>Przygotować 50 μM zapasów miR-200 naśladowców przy użyciu wolnych od nukleaz zapasów H2O. Podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
	<li>Dodaj 3 μl każdego 50 μM miR-200 mimika (miR-200a, miR-200b i miR-200c) do 300 μl pożywki bez surowicy lub 9 μl 50 μM miRNA kontroli ujemnej do 300 μl pożywki bez surowicy.</li>
	<li>Dodać 6 μl odczynnika do transfekcji swoistego dla siRNA do 600 μl pożywki bez surowicy i podzielić 300 μl tej mieszaniny na dwie probówki, po jednej dla każdej z dwóch mieszanin miR z kroku 3.2. Połączyć 300 μl każdej mieszaniny miR z kroku 3.2 z mieszaniną 300 μl odczynnika do transfekcji. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj zawiesinę komórkową 600 000 komórek EGFP+ RD eksprymujących EV lub GRHL2 utworzonych w sekcji 2 w 2,4 ml (250 komórek/μl) pożywki bez surowicy na zabieg.</li>
	<li>Na płytce 24-dołkowej dodać 100 μl na studzienkę mieszaniny miR-200 lub mieszaniny kontroli ujemnej z kroku 3.3 do sześciu dołków, a następnie dodać 400 μl każdej zawiesiny komórkowej do trzech dołków każdej mieszaniny miR.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc i następnego dnia zmienić pożywkę na w pełni uzupełnioną DMEM. Zebrać komórki 2 dni później do analizy przy użyciu odpowiedniego buforu (patrz poniżej). Obrazowanie poklatkowe komórek mięsaka RD poddawanych MET jest dostępne jako materiał uzupełniający. Obrazuj każdą studzienkę co 2 godziny za pomocą obiektywu 10X za pomocą automatycznego imagera live-cell27.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA, odwrotna transkrypcja i qPCR
<ol>
	<li>Ekstrahuj RNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji RNA24. Wyekstrahowany RNA może być przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie RNA. Rozmrozić i pracować z RNA na lodzie. Aby określić ilościowo stężenia RNA, należy zmierzyć absorbancję UV przy 260 nm za pomocą spektrofotometru z czytnikiem płytek zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć wszystkie próbki do najniższego stężenia wodą wolną od nukleaz.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję całkowitego RNA do komplementarnego DNA (cDNA). Połącz nie mniej niż 100 ng całkowitego RNA z buforem PCR, mieszanką dNTP (100 mM), losowymi starterami heksameru, odwrotną transkryptazą i wodą wolną od nukleaz w objętości reakcyjnej 20 μl24. Uruchom cykle RT zgodnie z protokołem producenta. cDNA może być przechowywane przez długi czas w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć 20 μl reakcji do 100 μl 80 μl H2O, wolnego od nukleaz.</li>
	<li>Zmieszać 5 μl barwnika interkalacyjnego na bazie fluorescencji 2x qPCR master mix, 0,06 μl każdego 10 μM startera i 2 μl rozcieńczonej reakcji RT na próbkę.</li>
	<li>Uruchom qPCR zgodnie z protokołem producenta dla mieszanki głównej opartej na fluorescencji.</li>
	<li>Określ ilościowo względne ilości mRNA metodą delta CT i znormalizuj do GAPDH. Wykreślić średnią ekspresję mRNA kontrprób biologicznych ± odchyleniem standardowym dla każdej grupy poddanej działaniu substancji. 
	UWAGA: Podczas pracy z RNA należy podjąć specjalne środki ostrożności, aby uniknąć kontaktu z RNazami, np. przy użyciu tworzyw sztucznych i odczynników wolnych od RNaz. Sprzęt jednorazowego użytku należy poddać zabiegowi przed użyciem w celu usunięcia RNaz.</li>
</ol>
5. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem 3.6, odessać pożywkę przez aspirację próżniową z komórek RD w formacie 24-dołkowym.</li>
	<li>Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) na studzienkę i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po utrwaleniu umieścić komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i w razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek przez dodanie 500 μl PBS+0,2% Triton-X100 i inkubacja przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przez aspirację próżniową usunąć bufor permeabilacyjny i przemyć trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Umieścić 500 μl 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przygotować pierwotne rozcieńczenie przeciwciała. Odpipetować 200 μl 5% BSA/PBS na studzienkę do stożkowego 15 ml (12 dołków = 2,4 ml) i dodać 1 μl przeciwciała pierwszorzędowego na ml 5% BSA/PBS potrzeba. Usunąć bufor blokujący przez aspirację próżniową i dozować 200 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdego dołka.
	<ol>
		<li>Inkubować komórki w rozcieńczonych w stosunku 1:1 000 rozcieńczonych przeciwciałach pierwszorzędowych w 5% BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji umyj komórki dwa razy PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować drugorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w tej samej objętości 5% BSA/PBS, jak powyżej. Dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem dalekiej czerwieni w rozcieńczeniu 1:2 000. Dodatkowo dodać do mieszanki 1 μg/ml barwnika Hoechst. Usuń PBS i dodaj 200 μl mieszanki do każdego dołka.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Umyj 3 razy PBS, pozostaw komórki w PBS i chroń komórki przed światłem za pomocą folii. W razie potrzeby komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki obrazowe przy 400-krotnym powiększeniu całkowitym na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym o długości fali wzbudzenia 594 - 650 nm.</li>
</ol>
6. Western Blotting
<ol>
	<li>Przemyć komórki z 3,6 dwukrotnie lodowatym PBS. Na lodzie lizuj komórki z 50 μL 1x buforu RIPA uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Lizaty skalne w temperaturze 4 °C przez 15 minut, lizaty zebrać do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować z dużą prędkością (20 000 x g) przez 5 minut w celu sklarowania próbek. W razie potrzeby lizaty komórkowe mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określić ilościowo białko całkowite za pomocą testu Bradforda i podzielić równą ilość białka na nowe probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Doprowadzić próbki do równej objętości za pomocą buforu RIPA i 3x buforu ładującego Laemmli uzupełnionego 2-merkaptoetanolem.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w 1x buforze ładującym próbki Laemmli przez 5 minut w temperaturze 95 °C i uruchomić SDS-PAGE przy użyciu 4-12% żelu Tris-glicyny przy napięciu 200 V przez 45 minut. Ilość załadowanego białka waha się w zależności od linii komórkowej. W niektórych przypadkach do wykrycia E-kadheryny w mezenchymalnych liniach komórkowych potrzeba 50-100 μg białka całkowitego.</li>
	<li>Przenieś białka na membranę nitrocelulozową przez 2 godziny przy 50 V w 1x buforze transferowym tris-glicyny.</li>
	<li>Blokować membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym opartym na BSA.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stężeniu 1:1 000 w 5 ml buforu blokującego, dodać rozcieńczenie do błony i inkubować z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć membranę 3 razy w PBS z 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Inkubować błony przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją w podczerwieni w rozcieńczeniu 1:20 000 w buforze blokującym, jak powyżej.</li>
	<li>Umyj membranę dwa razy w PBS z 0,05% Tween-20, a następnie jeden raz w PBS.</li>
	<li>Membrana obrazu wykorzystująca standardową detekcję fluorescencji w podczerwieni.</li>
</ol>
7. Testy wzrostu niezależne od zakotwiczenia
UWAGA: Szczegółowy protokół testu miękkiego agaru znajduje się w 28.
<ol>
	<li>Ciepłe sterylne 2x DMEM do 42 °C w gorącej kąpieli wodnej. W tym czasie podgrzej wstępnie autoklawowaną 1% agarozę w kuchence mikrofalowej przez 3 minuty. W razie potrzeby podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez dodatkowe 30 sekund lub do całkowitego stopienia. Przenieść agarozę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml w zlewce z wodą o temperaturze 42 °C w sterylnym kapturze i wymieszać 1% agarozy i 2x pożywkę DMEM w stosunku 1:1, co odpowiada 1,5 ml mieszaniny na studzienkę na płytce 6-dołkowej. Zawsze należy przygotować dodatkową ilość DMEM/agarozy, aby uwzględnić błąd pipetowania i uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę na boki studzienki, upewniając się, że nie tworzą się bąbelki i odstaw na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas gdy dolna warstwa krzepnie, przygotuj każdą grupę komórek RD transfekowanych w kroku 3, zasysając pożywkę i przemłukując raz 1 ml PBS. Odessać PBS i dodać 0,2 ml 0,05% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę w 0,8 ml pożywki i rozdziel komórki, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki i oblicz objętość zawiesiny komórek wymaganą dla 10 000 komórek na studzienkę.</li>
	<li>Podgrzej 0,6% agarozy w kuchence mikrofalowej przez 3 minuty, a następnie 30 s na raz, aż całkowicie się rozpuści. Przenieść agarozę do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml w zlewce z wodą o temperaturze 42 °C i sterylnym kapturze. Wymieszaj 0,6% agarozy i rozcieńczoną zawiesinę komórek w stosunku 1:1, aby przygotować 1,5 ml mieszaniny na dołek na płytce 6-dołkowej. Zawsze należy przygotować dodatkową zawiesinę komórkową i mieszankę agarozy, aby uwzględnić błąd pipetowania i uniknąć pęcherzyków. 
	UWAGA: Ważne jest, aby pracować w tym miejscu w temperaturze 42 °C. Jeśli temperatura jest zbyt niska, mieszanina zestala się przed posiewem, a temperatury powyżej 42 °C wpłyną na żywotność komórek.</li>
	<li>Dobrze wymieszać, kilkakrotnie rozcierając komórki i dodać mieszaninę komórek do studzienek, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki, i pozostawić do zestalenia się na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml uzupełnionej pożywki do każdej studzienki i przenieść płytki do inkubatora.
	<ol>
		<li>Zmieniaj pożywkę raz w tygodniu przez 3-4 tygodnie lub do momentu powstania wielokomórkowych kolonii. Należy uważać, aby nie dotykać agaru podczas wyjmowania podłoża przez zasysanie próżniowe. Alternatywnie użyj P1000, aby usunąć górną warstwę płynnego podłoża.</li>
		<li>Wybarwić miękkie płytki agarowe, dodając 200 μl roztworu chlorku tetrazolowego Nitro Blue (1 mg/ml w PBS) i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia zastąpić pożywkę PBS do obrazowania.</li>
		<li>Obraz uzyskuje się przy 40-krotnym powiększeniu całkowitym pod mikroskopem odwróconym.</li>
		<li>Wykonaj analizę na ImageJ pod kątem powierzchni i liczby kolonii. Wykreślić średnią liczbę powtórzeń biologicznych kolonii ± odchyleniu standardowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%2C+TGF-beta%2C+and+osteopontin+in+wound+healing+and+tissue+remodeling+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury.</a> J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT-MET+in+renal+disease%3A+should+we+curb+our+enthusiasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm.</a> Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).</li>
<li>Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+EMT+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The role of EMT in renal fibrosis.</a> Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).</li>
<li>Willis, B. C., Borok, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+EMT%3A+mechanisms+and+implications+for+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).</li>
<li>Ye, X., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Plasticity%3A+A+Central+Regulator+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).</li>
<li>Li, L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+human+cancer%3A+comprehensive+reprogramming+of+metabolism%2C+epigenetics%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation.</a> Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).</li>
<li>Tsai, J. H., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+plasticity+in+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis.</a> Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).</li>
<li>Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+epithelial+plasticity+in+prostate+cancer+dissemination+and+treatment+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Migration+and+Invasion+Uncoupled%3A+Increased+Migration+Is+Not+an+Inexorable+Consequence+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).</li>
<li>Mathow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeb1+affects+epithelial+cell+adhesion+by+diverting+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism.</a> EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).</li>
<li>Ware, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+resistance+to+gefitinib+mediated+by+cellular+reprogramming+and+the+acquisition+of+an+FGF2-FGFR1+autocrine+growth+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop.</a> Oncogenesis. 2, e39(2013).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+versus+mesenchymal+phenotype+determines+in+vitro+sensitivity+and+predicts+clinical+activity+of+erlotinib+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).</li>
<li>Jolly, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+elucidating+the+connection+between+epithelial-mesenchymal+transitions+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness.</a> J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+is+regulated+via+microRNA-200%2FZEB1+axis+control+of+tumour+cell+PD-L1+expression+and+intratumoral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression.</a> Nat Commun. 5, 5241(2014).</li>
<li>Nicolazzo, C., Gradilone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+circulating+tumor+cells+in+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/early/2016/07/08/MCB.00373-16.abstract">Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Transition+Phenotype+Is+Associated+with+Clinicopathological+Factors+That+Indicate+Aggressive+Biological+Behavior+and+Poor+Clinical+Outcomes+in+Invasive+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer.</a> J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).</li>
<li>Humphries, B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family%3A+small+molecules+with+novel+roles+in+cancer+development%2C+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy.</a> Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+primary+high-grade+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas.</a> Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).</li>
<li>Petrof, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GRHL2+result+in+an+autosomal-recessive+ectodermal+Dysplasia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome.</a> Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).</li>
<li>Werner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+the+transcription+factor+grainyhead-like+2+%28GRHL2%29+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer.</a> J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).</li>
<li>Werth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+grainyhead-like+2+regulates+the+molecular+composition+of+the+epithelial+apical+junctional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex.</a> Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-Epithelial+Transition+in+Sarcomas+Is+Controlled+by+the+Combinatorial+Expression+of+MicroRNA+200s+and+GRHL2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).</li>
<li>Varma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Grainyhead-like+2+and+NK2-homeobox+1+form+a+regulatory+loop+that+coordinates+lung+epithelial+cell+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation.</a> J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).</li>
<li>Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fluorescent+protein+expressing+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+morphological+screen+identifies+novel+microRNAs+that+regulate+neuroblastoma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation.</a> Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> J Vis Exp. (92), e51998(2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+and+genomics+analysis+reveals+a+novel+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transition+in+leiomyosarcoma+through+regulation+of+slug%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).</li>
<li>Alba-Castellon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail1+expression+is+required+for+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Snail1 expression is required for sarcomagenesis.</a> Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).</li>
<li>Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+to+Epithelial+Transition+Induced+by+Reprogramming+Factors+Attenuates+the+Malignancy+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mięsaki są rzadkimi, ale bardzo agresywnymi nowotworami o linii mezenchymalnej. Pomimo ich mezenchymalnej linii, podzbiór mięsaków wydaje się przechodzić fenotypowe przejście do stanu bardziej przypominającego nabłonek. Ten przełącznik podobny do MET ma znaczenie prognostyczne ponieważ pacjenci z guzami podobnymi do nabłonka są mniej agresywni24. Pomimo ich znaczenia klinicznego, istnieje niewiele badań dotyczących mechanizmów molekularnych napędzających te przejścia fenotypowe w mięsakach.
<p...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.

Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Plastyczność fenotypowa odnosi się do odwracalnego przejścia między fenotypami komórkowymi i jest powszechnie dzielona na dwa typy, przejścia z nabłonka do mezenchymalnego (EMT) i przejścia mezenchymalne do nabłonka (MET). Ta plastyczność fenotypowa odgrywa ważną rolę w prawidłowych procesach organizmów wielokomórkowych, takich jak rozwój i gojenie się ran1; Jednak te same szlaki i programy ekspresji genów mogą również prowadzić do chorób, takich jak zwłóknienie (recenzja w2,3,4) i przerzuty raka (recenzowane w References5,6,7,8). Na przykład podczas przerzutów EMT zaburza polaryzację komórek, interakcje komórka-komórka i sprzyja inwazji9,10. Razem EMT przyczynia się do stanu fenotypowego, który ułatwia rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych. Ponadto EMT prowadzi również do wielu innych zmian fenotypowych, które napędzają agresywny fenotyp, w tym deregulacji metabolizmu komórek rakowych6, rozwój oporności na leki11,12, zwiększona zdolność do inicjacji nowotworu13,14 i unikanie odporności gospodarza15.
Plastyczność fenotypowa została dobrze zbadana w progresji raka; jednak mięsaki wykazują również plastyczność fenotypową. Co ciekawe, wydaje się, że niektóre z tych samych czynników wpływających na plastyczność fenotypową w rakach przyczyniają się również do plastyczności i agresywności mięsaka. Na przykład wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) od pacjentów z mięsakiem wykazują ekspresję EpCAM, białka powierzchniowego komórki, które zwykle znajduje się na komórkach nabłonka16. Dodatkowo 250 próbek mięsaka tkanek miękkich sklasyfikowano jako nabłonkowe lub mezenchymalne na podstawie ekspresji genów. Pacjenci z sygnaturą biomarkera podobnego do nabłonka mieli lepsze rokowanie niż pacjenci z sygnaturą biomarkera podobnego do mezenchymalnego17. Jest to zgodne z wieloma nowotworami, w których pacjenci z rakami podobnymi do nabłonka mają lepsze wyniki w porównaniu z pacjentami z większą liczbą guzów mezenchymalnych18.
Podczas gdy niektóre mięsaki wykazują biomarkery i szlaki ekspresji genów zgodne z MET, molekularne podstawy tej plastyczności fenotypowej pozostają słabo poznane. Aby zbadać mechanizmy i czynniki powodujące MET w mięsaku, opracowaliśmy model indukcji MET przy użyciu dwóch czynników specyficznych dla nabłonka, rodziny mikroRNA (miR)-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). miR-200 to rodzina małych niekodujących RNA, które regulują ekspresję genów poprzez wiązanie się z 3' UTR informacyjnego RNA i zapobieganie translacji do białka. Rodzina miR-200 składa się z dwóch podgrup - jednej zawierającej miR-141 i miR-200a, a drugiej zawierającej miR-200b, miR-200c i miR-429. Członkowie rodziny miR-200 są wzbogaceni w tkanki nabłonkowe, a utrata miR-200 wiąże się z przerzutami w rakach19. Rodzina miR-200 jest również obniżona w mięsakach tkanek miękkich w porównaniu z normalnymi tkankami20. Podobnie jak miR-200s, GRHL2 jest kluczowym regulatorem, który jest ważny dla rozwoju nabłonka21. Czynnik transkrypcyjny GRHL2 działa na dwa sposoby, aby zwiększyć poziom genów nabłonkowych, takich jak E-kadheryna: 1) W komórkach nabłonkowych GRHL2 bezpośrednio tłumi główny regulator EMT, ZEB122; oraz 2) GRHL2 bezpośrednio aktywuje transkrypcję genów nabłonkowych23. Nasze poprzednie badania wykazały, że połączona ekspresja miR-200 i GRHL2 w komórkach mięsaka indukuje fenotyp podobny do MET24. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół tworzenia modelu in vitro indukcji MET w komórkach mięsaka przy użyciu ektopowej ekspresji miR-200 i GRHL2.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik Countess</td><td>Technologie życia</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler SimpliAmp</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR mikropłytka</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Szybki uniwersalny zestaw qPCR</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący blok startowy (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>Bufor blokujący na bazie BSA</td></tr><tr><td>Agaroza Ogólnego Przeznaczenia LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Bufor biegowy</td></tr><tr><td>10x Bufor Tris/Glycine</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Bufor transferowy</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu; m nitroceluloza</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Quick-RNA MiniPrep Genesee</td><td>Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Bufor do próbek (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td> Mini komórka trans-blot Bio-Rad Laboratories Inc 1703930 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Technologie życia</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Technologie życia</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Technologie życia</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Technologie życiowe</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRNA miRNA naśladuje kontrolę negatywną #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 miRNA mirVana naśladuje</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 miRNA mirVana naśladuje</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 miRNA mirVana naśladuje</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>pożywka bez surowicy</td></tr><tr>przeciwciało<td>anty-Ecadherin</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anty-beta aktyna</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anty-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anty-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>przeciw myszom AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>przeciw królikom AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy i fosforanów Halt</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; m filtr przepływu</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGACTGC powiedział:</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro niebieski tetrazolium&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>bromek heksadimetryny</td><td>Sigma</td><td>H9268</td> strzykawka <td>z polibrenu</td></tr><tr><td>3 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml polipropylenowa rurka okrągłodenna</td><td>352063</td><td></td><td>probówkach do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>zestaw do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>4% paraformaldyhyd</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Plastyczność fenotypowa odnosi się do zjawiska, w którym komórki przejściowo nabywają cechy innej linii. Podczas progresji raka plastyczność fenotypowa napędza inwazję, rozsiew i przerzuty. Rzeczywiście, podczas gdy większość badań plastyczności fenotypowej dotyczyła raków pochodzenia nabłonkowego, okazuje się, że mięsaki, które są pochodzenia mezenchymalnego, wykazują również plastyczność fenotypową, a podzbiór mięsaków ulega zjawisku przypominającemu przejście mezenchymalno-nabłonkowe (MET). W tym miejscu opracowaliśmy metodę obejmującą rodzinę miR-200 i ziarnistą głowę 2 (GRHL2), aby naśladować to podobne do MET zjawisko obserwowane w próbkach pacjentów z mięsakami. Sekwencyjnie wyrażamy GRHL2 i rodzinę miR-200 za pomocą odpowiednio transdukcji i transfekcji komórek, aby lepiej zrozumieć molekularne podstawy tych fenotypowych przejść w komórkach mięsaka. Komórki mięsaka wykazujące ekspresję miR-200 i GRHL2 wykazały wzmocnione cechy nabłonka w morfologii komórek i zmianie biomarkerów nabłonkowych i mezenchymalnych. Przyszłe badania z wykorzystaniem tych metod mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia fenotypowych konsekwencji procesów podobnych do MET dla komórek mięsaka, takich jak migracja, inwazja, skłonność do przerzutów i oporność na terapię.

Schemat indukcji MET w komórkach mięsaka
Ogólny harmonogram indukcji zmian typu MET w komórkach mięsaka przedstawiono na Rysunku 1. Protokół rozpoczyna się od transdukcji GRHL2 (Rysunek 1A), a następnie od transfekcji rodziny miR-200 (Rysunek 1B). GRHL2 ani członkowie rodziny miR-200 nie były w stanie wpłynąć na wygląd komórek RD podczas samodzielnej ekspresji, jednak ektopowa eksp...

Prezentujemy tutaj metodę hodowli komórkowej do indukowania przemian mezenchymalno-nabłonkowych (MET) w komórkach mięsaka opartą na połączonej ektopowej ekspresji członków rodziny mikroRNA-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). Metoda ta jest odpowiednia do lepszego zrozumienia biologicznego wpływu plastyczności fenotypowej na agresywność raka i leczenie.

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie konsekwencji fenotypowych przejść mezenchymalno-epithelialnych w mięsakach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, dlaczego mięsaki o charakterze nabłonkowym wykazują lepsze rokowania w porównaniu do mięsaków o charakterze bardziej mezenchymalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona łatwy i powtarzalny sposób badania downstreamowych sieci regulacji genów oraz fenotypów związanych z przejściami mezenchymalno-epithelialnymi w mięsakach.Dzięki lepszemu zrozumieniu plastyczności fenotypowej w mięsakach mamy nadzieję zidentyfikować interwencje terapeutyczne, które pozwolą nam przesunąć mięsaki w stronę bardziej łagodnego stanu przypominającego nabłonek. Procedurę zaprezentują dwaj studenci naszego laboratorium, Jackson Xu i Shivee Gilja. Pierwszego dnia transdukcji wysiej 3 × 10⁵ komórek HEK293T do każdej z dwóch studni płytki 6-dołkowej w 2 mL uzupełnionego DMEM.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Po nocnej hodowli obejrzyj komórki pod mikroskopem. Powinny one osiągnąć stopień konfluencji od 40 do 60%.Następnie, w oddzielnych probówkach zawierających 200 µL medium beztłuszczowego z 1,8 µg plazmidu p delta 8.9 i 0,2 µg plazmidu pomocniczego pCMV-VSV-G, rozcieńczyć 2 µg pustego wektora oraz 2 µg wektora zawierającego GRHL2. W innej probówce rozcieńczyć 4 µL odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w 200 µL medium beztłuszczowego na jedną transfekcję. Dla dwóch próbek będzie to 8 µL i 400 µL.Do każdego roztworu plazmidu dodaj 200 µL mieszaniny odczynnika do transfekcji, a następnie inkubuj próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie za pomocą aspiratora próżniowego usuń pożywkę z komórek HEK293T. Przepłucz komórki raz 1 mL PBS, a następnie zastąp PBS 800 µL pożywki bezzsrytkowej.Po upływie 20 minut dodać kroplami 400 µL mieszaniny odczynnika do transfekcji i plazmidu do każdego dołka z wysianymi komórkami. Inkubować naczynie przez dwie godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Po inkubacji ostrożnie usunąć medium do transfekcji za pomocą aspiratora próżniowego.Komórki HEK293T słabo przylegają, dlatego podczas odsysania pożywki należy uważać, aby nie usunąć komórek z dna szalki lub kolby. Zastąp odessaną pożywkę dwiema mililitrami uzupełnionego DMEM. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora do hodowli przez noc.Następnego dnia należy odświeżyć pożywkę w transfektowanych komórkach HEK293T, a następnie wysiać 3 × 10⁵ komórek rabdomyosarcoma człowieka RD do każdego dołka płytki 6-dołkowej zawierającej 2 mL uzupełnionej pożywki DMEM na dołek. Obie płytki należy inkubować przez noc. Czwartego dnia za pomocą pipety należy zebrać pożywkę z wirusem z komórek HEK293T i przenieść ją do dwóch nowych probówek stożkowych o pojemności 15 mL – jednej dla lentiwirusa zawierającego pusty wektor, a drugiej dla lentiwirusa zawierającego plazmid GRHL2.Ostrożnie wymień medium na nowe DMEM i umieść komórki HEK293T z powrotem w inkubatorze na noc. Następnie dodaj 2 µL polybrene w stężeniu 10 mg/mL na każdy 1 mL medium wirusowego do dwóch nowych probówek stożkowych o pojemności 50 mL, jednej dla transfekcji pustego wektora i drugiej dla transfekcji GRHL2. Wyjmij tłok z strzykawki 3 mL i przymocuj do jej końcówki filtr z polietersulfonu o rozmiarze porów 0,45 µm.Przenieść wcześniej zebrane medium wirusowe do cylindra strzykawki i wstrzyknąć je do jednej z nowych probówek stożkowych o pojemności 50 ml zawierających polybrene. Powtórzyć ten krok z drugą próbką. Następnie usunąć medium z komórek RD za pomocą aspiracji próżniowej i dodać po 2 ml każdej z przefiltrowanych próbek medium wirusowego do oddzielnych dołków płytki z komórkami RD.Inkubuj komórki RD w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaczem. Następnego dnia powtórz etap zbierania medium wirusowego i dodaj medium do infekcji do tych samych studni zawierających wcześniej zainfekowane komórki RD. Komórki HEK293T można usunąć po zebraniu medium wirusowego.Inkubować komórki przez kolejne dwa dni. Siódmego dnia przemyć komórki RD 1 ml PBS, a następnie dodać 200 µL 0,05% trypsyny do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut.Dodaj dwa mililitry uzupełnionej pożywki, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Wirować komórki z prędkością 250 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessać pożywkę i resuspendować komórki w jednym mililitrze DMEM uzupełnionego o 5% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny.Aby przefiltrować komórki w ramach przygotowania do cytometrii przepływowej, należy za pomocą pipety przenieść jeden mililitr zawiesiny komórek RD przez sterylny filtr nakładkowy na probówkę o rozmiarze 30 µm do probówek do cytometrii przepływowej. Probówki należy umieścić na lodzie. Przy użyciu cytometru przepływowego należy wyizolować komórki dodatnie dla EGFP do probówek mikrocentryfugowych o pojemności 1,5 ml zawierających 0,5 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny.Posortowane komórki należy ponownie umieścić na lodzie. Komórki wykazujące ekspresję EGFP, pochodzące zarówno z transdukcji pustym wektorem, jak i wektorem GRHL2, należy wysiać w łącznej objętości 1 ml uzupełnionego DMEM w oddzielnych studzienkach płytki 12-dołkowej. Następnie komórki należy umieścić w inkubatorze w celu hodowli.Wydajność komórek pozytywnych pod kątem EGFP po cytometrii przepływowej jest zazwyczaj dość niska, w zakresie od 50 000 do 100 000 komórek. Z tego powodu komórki mogą wymagać dodatkowej hodowli przez 10 do 14 dni przed przejściem do następnego etapu. Do probówki do mikrocentryfugi dodaj trzy µL każdego mimiku miR-200 o stężeniu 50 µM do 300 µL pożywki bezsurowiczej.W oddzielnej probówce dodaj 9 µL negatywnej kontroli mikroRNA o stężeniu 50 µM do 300 µL medium bez surowicy. Następnie, w kolejnej probówce do mikrocentryfugi, dodaj 6 µL odczynnika do transfekcji specyficznego dla siRNA do 600 µL medium bez surowicy. Odmierz 300 µL tej mieszaniny do dwóch probówek, po jednej dla każdej z dwóch mieszanin miR.Połącz 300 µL każdej mieszaniny miR z 300 µL odczynnika do transfekcji. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przygotuj zawiesinę 600 000 komórek RD dodatnich pod kątem EGFP, wykazujących ekspresję wektora MD lub GRHL2, w 2,4 mL bezsurowiczego medium, przy stężeniu 250 komórek na µL na każdą próbę.Na płytkę 24-dołkową nanieś 100 µL mieszaniny miR-200 lub kontroli negatywnej do sześciu dołków. Następnie dodaj 400 µL każdej zawiesiny komórkowej do trzech dołków dla każdej mieszaniny miR. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc.Następnego dnia należy wymienić pożywkę na DMEM z pełnym dodatkiem suplementów. Po dwóch dniach zebrać komórki do analizy, używając odpowiedniego buforu. Wykonywać obrazowanie każdego dołka co dwie godziny przy użyciu obiektywu 10X w automatycznym systemie obrazowania żywych komórek.Te obrazy z odstupami czasowymi przedstawiają przejście mezenchymalno-nabłonkowe, czyli MET, w komórkach RD wykazujących ekspresję GRHL2, EGFP oraz miRNA miR-200. Komórki zmieniają swój wygląd z wrzecionowatego na brukowany, wykazując zwiększone adhezje międzykomórkowe oraz bardziej zaokrągloną morfologię. MET nie obserwuje się w innych warunkach traktowania.Zamiast tego komórki wykazują wydłużoną, wrzecionowatą morfologię z nielicznymi połączeniami międzykomórkowymi. Podczas indukcji MET zmiana morfologiczna w komórkach RD po nadekspresji GRHL2 i miR-200 była powiązana z upregulacją markera nabłonkowego, E-cadherin, co zmierzono za pomocą qPCR i western blottingu. Dodanie miR-200s spowodowało upregulację samej E-cadherin, natomiast połączona nadekspresja miR-200s i GRHL2 synergistycznie zwiększyła ekspresję E-cadherin.Jak wykazano w badaniu z użyciem mikroskopii immunofluorescencyjnej, w połączeniach międzykomórkowych nastąpił wzrost poziomu cząsteczek adhezji nabłonkowej, EpCAM i TJP-1, co wskazano białymi strzałkami. Up-regulacja białek nabłonkowych była powiązana z down-regulacją genów mezenchymalnych ZEB1 i Notch1, co potwierdzono metodą QRT-PCR. Indukcja MET ograniczyła wzrost niezależny od podłoża komórek RD, co zmierzono za pomocą testów wzrostu w miękkim agarze.Hamowanie wzrostu w miękkim agarze było wywołane przez same miR-200, ponieważ nadekspresja GRHL2 prowadziła do zwiększenia wzrostu niezależnego od podłoża. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wykazującymi, że ekspresja GRHL2 indukuje wzrost niezależny od podłoża. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, w tym testy służące do pomiaru zmian w migracji, inwazji, przerzutowaniu i odpowiedzi komórek na terapię, aby wyjaśnić skutki fenotypowe MET w mięsakach.

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek.  Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Natywna matryca pochodząca z fibroblastów pochodząca z inżynierii tkankowej jest nowym narzędziem do generowania substratu zrębu, który wspiera proliferację i różnicowanie komórek nabłonkowych. W artykule przedstawiono protokół stosujący tę metodologię do oceny wpływu różnych typów komórek zrębu na biologię komórek nowotworowych.

Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Bezpośrednie wstrzykiwanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia rakowego (EV) prowadzi do przeprogramowania szpiku kostnego, co wspomaga postęp nowotworu; jednak nie jest jasne, które komórki pośredniczą w tym efekcie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół badania interakcji nowotworowo-mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pośrednictwem EV in vivo, ujawniając kluczową rolę MSC edukowanych przez EV w przerzutach.

Przedkliniczny mysi model kostniakomięsaka w celu zdefiniowania komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Opisujemy systematyczny proces badania sygnalizacji TGF-β i EMT indukowanego przez TGF-β, badając ekspresję białek i genów zaangażowanych w ten szlak sygnałowy. Metody obejmują Western blotting, test reporterowy lucyferazy, qPCR i barwienie immunofluorescencyjne.

Badanie sygnalizacji TGF-β i indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego w raku piersi i prawidłowych komórkach

Obecny protokół opisuje tworzenie 3D 'na wierzchu' hodowli nieprzekształconej linii komórek nabłonka piersi, MCF10A, która została zmodyfikowana do badania transformacji indukowanej przez czynnik aktywujący płytki krwi (PAF). Do oceny przemiany wykorzystano immunofluorescencję, która została szczegółowo omówiona.

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Poznaj metodę indukcji przejścia mezenchymalno-nabłonkowego w komórkach mięsaka przy użyciu mikroRNA-200 i GRHL2. Technika ta pozwala badać plastyczność fenotypową i sieci regulacji genowej w celu opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Przeglądaj więcej filmów