Name: Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę izolacji płytek krwi i pomiaru ich agregacji za pomocą zmętnienia. Technika ta pozwala badać wpływ inhibitora Pannexin1 na aktywację płytek kolagenem w badaniach biologii krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (310030_162579/1 dla Brendy Renaty Kwak i 320030_144150 dla Pierre'a Fontany), a także przez grant od Swiss Heart Foundation.

Pięciu niepowiązanych zdrowych ochotników zostało zrekrutowanych do pobierania próbek krwi do testów izolacji płytek krwi i agregacji. Uzyskano pisemną świadomą zgodę, a protokół został zatwierdzony przez Centralną Komisję Etyki Szpitali Uniwersyteckich w Genewie. Wszyscy ochotnicy poświadczeni, że są zdrowi i nie przyjmowali żadnych leków zaburzających tworzenie płytek krwi przez co najmniej 10 dni poprzedzających eksperymenty.
1. Przygotowanie buforu do pobrania krwi ludzkiej i izolacji przemytych płytek krwi
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml wodnego roztworu kwasu cytrynianu i dekstrozy (ACD), rozpuszczając 1,4 g monohydratu kwasu cytrynowego (C, 6, H, 8O,7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g dwuwodnego cytrynianu trisodowego (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) i 2 g bezwodnej D(+)-glukozy. pH roztworu wynosi około 4,5.</li>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe dla bufora Tyrode'a w następujący sposób
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 1, rozpuszczając 80 g NaCl, 2 g KCl, 10 gNaHCO3 i 0,58 gNaH2PO4*H2Ow 500 ml destylowanegoH2O. Odpowiednie stężenia końcowe wynoszą 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM i 8,4 mM. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 2, rozpuszczając 10,15 g MgCl2*6H2O(100 mM) w 500 ml destylowanegoH2O. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 3, rozpuszczając 10,95 g (100 mM) CaCl2*6 H2O w 500 ml destylowanegoH2O. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor Tyrode'a, rozcieńczając 2,5 ml roztworu podstawowego 1 w końcowej objętości 50 ml destylowanymH2O. Odpowiada to stężeniom końcowym 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3 i 0,42 mM NaH2PO4*H2O. Dostosuj pH do 7,35 i sterylizuj przez filtrowanie filtrami 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 0,35% bufor albuminy Tyrode'a (bufor TA7) przez rozcieńczenie 5 ml roztworu podstawowego 1, 1 ml roztworu podstawowego 2, 2 ml roztworu podstawowego 3, 0,5 ml 1M HEPES, 1,8 ml albuminy surowicy ludzkiej 200 g/l i 0,1 g bezwodnej D(+)-glukozy w końcowej objętości 100 ml destylowanegoH2O.
	<ol>
		<li>Dostosuj pH do 7,35 za pomocą 1N HCl i ustaw osmolarność na 295 mOsm/L, dodając destylowanyH2O(10% całkowitej objętości). Stężenia końcowe w tym roztworze wynoszą: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH2PO4*H2O, 0,91 mM MgCl2*6 H2O, 1,82 mM CaCl2*6 H2O. Utrzymuj bufor TA w temperaturze 37 °C podczas całego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Zebrać 45-50 ml krwi żylnej z żyły łokciowej za pomocą igły 19 G i bez opaski uciskowej lub z niską opaską uciskową do 50 ml probówek zawierających antykoagulant ACD (1 objętość ACD na 6 objętości krwi). Wyrzuć pierwsze 1-2 ml krwi, aby uniknąć obecności trombiny i czynnika tkankowego.
	<ol>
		<li>Po pobraniu wymieszaj krew z ACD, delikatnie odwracając probówkę. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie ludzkich płytek krwi
<ol>
	<li>Podgrzej wirówkę do temperatury 37 °C. Wszystkie poniższe etapy wirowania są wykonywane w tej temperaturze.</li>
	<li>Pobraną krew należy przesłać do probówek o pojemności 15 ml (5 ml na probówkę) i odwirować przy 250 x g przez 13 minut, aby uzyskać PRP. 
	UWAGA: Ten etap wirowania powoduje wytworzenie trzech warstw w próbce: 1) Górna warstwa, składająca się z osocza, płytek krwi i niewielkiej frakcji białych krwinek. 2) Warstwa pośrednia, porcja bogata w białe krwinki. 3) Dolna warstwa, która zasadniczo składa się z czerwonych krwinek.</li>
	<li>Pobrać PRP, ostrożnie pipetując górną warstwę do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby maksymalnie zapobiec zanieczyszczeniu krwinkami czerwonymi i białymi, i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować PRP przy 2 200 x g przez 12 minut (dla 5 ml PRP). 
	UWAGA: Ten etap wirowania powinien być wykonywany z niskim hamulcem lub bez hamulca.</li>
	<li>Usunąć supernatant (osocze ubogie w płytki krwi) i ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml buforu TA zawierającego 2 μl/ml heparyny (5 000 U/ml) i 2,5 μL/ml 25 μM PGI2 za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl/ml z 25 μM PGI2 i wirować przez 8 minut przy 1 900 x g (z hamulcem niskim lub bez hamulca).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 5 ml buforem TA zawierającym 2,5 μL/ml 25 μM PGI2 za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W okresie inkubacji odpipetować 150 μl zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 ml i policzyć płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek (który wykrywa wielkość krwinek poprzez pomiar zmian oporu prądu stałego).</li>
	<li>Po 10 minutach inkubacji dodać 2,5 μl/ml 25 μM ChOG2 do zawiesiny płytek krwi i natychmiast odwirować przy 1 900 x g przez 8 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad do stężenia 250 000 płytek krwi/μl z odpowiednią objętością buforu TA (tj. jeśli liczba komórek wynosi 500 000 na μl, zawiesić ponownie w 10 ml buforu TA) zawierającego 32 μl/ml apirazy w stężeniu 0,01 U/ml (stężenie końcowe 0,32 U/ml). 
	UWAGA: Wysokie stężenie apirazy stosuje się w celu uniknięcia odczulenia receptorów P2X1 wywołanego spontanicznym wydzielaniem ATP10,11 przy braku agonistów. Jest to ważne, ponieważ odpowiedzi wywołane kolagenem są indukowane przez szybką parakrynną/autokrynną aktywację P2X1 przez ATP uwalniane z aktywowanych płytek krwi. Jeśli szlak sygnałowy płytek krwi nie wymaga krytycznie zachowania funkcji P2X1, należy użyć 0,02 U/ml apirazy. Kilka badań (zrecenzowanych w Mahaut-Smith et al.10) wykazano, że 0,02 U/ml apyrazy pozwala uniknąć odczulania receptora ADP P2Y1 przy znikomych odpowiedziach P2X1.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórek przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C przed wykonaniem pomiarów agregometrycznych. Preparat jest stabilny przez 5 do 8 godzin.</li>
</ol>
4. Agregegometria
<ol>
	<li>Przygotować fibrynogen (56 mg/ml) w buforze Tyrode'a.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 260 μl zawiesiny płytek krwi do szklanych kuwet (ryc. 1A; lewa kuweta) zawierających 10 μl fibrynogenu (56 mg/ml) i mieszadła magnetycznego, następnie inkubować zawiesinę przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C w studzienkach inkubacyjnych znajdujących się w agresjometrze (ryc. 1B i 1C).</li>
	<li>Wstępną inkubację z inhibitorem Panx1 Brilliant Blue FCF należy dodać 10 μl roztworu podstawowego o stężeniu 2,8 mM lub 28 mM (stężenie końcowe odpowiednio 100 μM i 1 mM) przez 7 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Skalibruj agregometr do zakładanej wartości agregacji 100%, mierząc OD kuwety zawierającej 10 μl fibrynogenu (56 mg/ml), 10 μl błękitu brylantowego FCF (2,8 mM lub 28 mM) i bufor TA bez płytek krwi.
	<ol>
		<li>Umieścić kuwetę w studzience agregacyjnej pod automatycznym mieszaniem i nacisnąć odpowiedni przycisk na klawiaturze komputera połączonego z agregiometrem (tj. nacisnąć F1, jeśli używana jest studzienka agregacji 1). 
		UWAGA: Ten opisany poniżej eksperyment obejmuje Brilliant Blue FCF. Związek używany do kalibracji musi być dostosowany do warunków doświadczalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj agregometr do zakładanej wartości agregacji 0%, używając tej samej próbki płytek krwi, która zostanie użyta w eksperymencie przy automatycznym mieszaniu.
	<ol>
		<li>Umieść kuwetę w studzience agregacji i naciśnij odpowiedni przycisk na klawiaturze komputera połączonego z agregiometrem. Odczekaj około 20-30 sekund, zanim przejdziesz dalej. To opóźnienie służy zapewnieniu, że przed dodaniem agonistów nie nastąpi agregacja. 
		UWAGA: Ponieważ każda różnica w liczbie płytek krwi może mieć wpływ na mierzoną średnicę zewnętrzną, krok kalibracji 0% należy powtórzyć dla każdego indywidualnego pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20 μl pożądanego agonisty, takiego jak 15 μg/ml kolagenu (1 μg/ml końcowy) lub 1,125 mM kwasu arachidonowego (75 μM końcowy) do kuwety. Natychmiast rozpocznij nagrywanie przy ciągłym automatycznym mieszaniu, naciskając odpowiedni przycisk na klawiaturze komputera połączonego z aggregometer. 
	UWAGA: Dodanie agonisty indukuje aktywację płytek krwi. Agregaty płytek krwi można wyraźnie rozróżnić w szklanej kuwecie pod koniec eksperymentu (ryc. 1A; prawa kuweta).</li>
	<li>Nagrywanie zatrzymuje się automatycznie po 6 minutach. W tym momencie zapisz dane, klikając ikonę zapisywania na komputerze. 
	UWAGA: Obliczanie szybkości agregacji jest wykonywane przez komputer, który wyraża końcowe wyniki procesu agregacji w procentach.</li>
	<li>Przeanalizuj dane.
	<ol>
		<li>Dodatkowe obszerne informacje na temat protokołów przygotowania zawiesin przemytych płytek krwi i pomiaru mętności agregacji płytek krwi można znaleźć w innych artykułach autorstwa ekspertów w tej dziedzinie12,13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+of+platelets+from+megakaryocyte+proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets.</a> J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).</li>
<li>Andrews, R. K., Berndt, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15507277">Platelet physiology and thrombosis.</a> Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).</li>
<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
<li>Creager, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+the+CAPRIE+trial%3A+efficacy+and+safety+of+clopidogrel.+Clopidogrel+versus+aspirin+in+patients+at+risk+of+ischaemic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events.</a> Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).</li>
<li>Born, G. V., Cross, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14056485">The Aggregation of Blood Platelets.</a> J Physiol. 168, 178-195 (1963).</li>
<li>Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BPlatelet+aggregation%3A+a+tool+for+clinical+investigation+and+pharmacological+study+Methodology%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biol+Clin+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">[Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology].</a> Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).</li>
<li>Molica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+a+polymorphism+in+the+Pannexin1+gene+in+collagen-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).</li>
<li>Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+human+platelet+activation+by+surface+pannexin-1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels.</a> J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).</li>
<li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+food+dye+FD%26C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).</li>
<li>Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2X1+receptor+and+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">The P2X1 receptor and platelet function.</a> Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).</li>
<li>Hechler, B., et al. <a target="_blank" href="http://jpet.aspetjournals.org/content/314/1/232">Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt].</a> J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jarvis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation%3A+turbidimetric+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation: turbidimetric measurements.</a> Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).</li>
<li>Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+volume+changes+associated+with+light+transmittance+changes+in+the+platelet+aggregometer%3A+dependence+upon+aggregating+agent+and+effectiveness+of+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus.</a> Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).</li>
<li>Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+turbidity+to+the+stages+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation.</a> Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).</li>
<li>Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+platelet+aggregation+in+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood.</a> Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).</li>
<li>Hayward, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+methods+for+determining+reference+intervals+for+light+transmission+platelet+aggregation+tests+on+samples+with+normal+or+reduced+platelet+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts.</a> Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).</li>
<li>Frelinger, A. L. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+tests%2C+independent+of+platelet+count%2C+are+associated+with+bleeding+severity+in%5BTitle%5D)+AND+%22ITP.+Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in.</a> ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).</li>
<li>Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+spontaneous+aggregation+in+platelet-rich+plasma+is+increased+in+habitual+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers.</a> Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).</li>
<li>Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+and+exercise+conditioning+on+blood+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).</li>
<li>Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregometry+detects+platelet+hyperreactivity+in+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals.</a> Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2013).</li>
<li>Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel+and+pannexin+channel+electrophysiology%3A+how+do+they+differ%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?</a> FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).</li>
<li>European Food Safety Authority. <a target="_blank" href="https://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/1853">Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive.</a> EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).</li>
<li>Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gel-filtered+human+platelets%3A+isolation+and+characterization+in+a+medium+containing+no+added+Ca2%2B%2C+Mg2%2B%2C+or+K%2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+.</a> J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje duże zainteresowanie znalezieniem nowych leków zdolnych do modulowania funkcji płytek krwi w celu zapobiegania zakrzepicy bez zwiększania ryzyka krwawienia. W tym celu absolutnie konieczne są badania laboratoryjne in vitro , które mogą niezawodnie i powtarzalnie monitorować reakcje agregacji w ludzkich płytkach krwi. Agresymetria turbidymetryczna jest łatwą do wykonania techniką. Należy jednak pamiętać o pewnych środkach ostrożności. Pomiary muszą być wykonywane przy ciągłym mieszaniu, ponieważ proces a...

Płytki krwi są kluczowymi składnikami krwi, a ich główną funkcją - wraz z czynnikami krzepnięcia - jest tamowanie krwawienia po uszkodzeniu naczyń krwionośnych. Płytki krwi to małe (2-3 μm) fragmenty jądrowe pochodzące z megakariocytów szpiku kostnego1. Płytki krwi krążą w stanie nieaktywowanym, podczas którego pojawiają się jako struktury w kształcie soczewki. Po przerwaniu śródbłonka płytki krwi gromadzą się w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego, aby zatkać otwór, proces zwany hemostazą pierwotną. Początkowo płytki krwi przyłączają się do cząsteczek subśródbłonkowych, takich jak kolagen i czynnik von Willebranda, które są odsłonięte w wyniku etapuadhezji urazu. Następnie zmieniają kształt i wydzielają etap aktywacji przekaźników chemicznych. Wreszcie łączą się ze sobą, łącząc etap agregacji receptorów. Po hemostazie pierwotnej następuje proces wtórny polegający na aktywacji kaskady krzepnięcia z odkładaniem fibryny, która stabilizuje początkową skrzeplinę2.
Ostre zdarzenia niedokrwienne, takie jak zawał mięśnia sercowego3 często wynikają z zakrzepów, które powstają z powodu fizycznego zakłócenia (pęknięcia) blaszki miażdżycowej. Obecne leki przeciwpłytkowe są podstawą leczenia tej szeroko rozpowszechnionej choroby, ale ich korzyści kliniczne są ograniczone przez zwiększone ryzyko krwawienia. Najczęściej przepisywane leki u pacjentów sercowo-naczyniowych, aspiryna i związki anty-P2Y12, są ukierunkowane odpowiednio na tromboksan A2 i szlaki ADP4, które są głównymi szlakami prowadzącymi do aktywacji płytek krwi. Nadal jednak potrzebne są innowacyjne badania nad nowymi celami, które optymalnie zrównoważyłyby działanie przeciwzakrzepowe i ryzyko hemorragiczne.
Od lat 60. XX wieku5 do dzisiaj, agregegometria turbidymetryczna odegrała kluczową rolę w badaniach, poszerzając naszą wiedzę na temat reaktywności płytek krwi i monitorując siłę działania odczynników przeciwzakrzepowych u ludzi. Turbidymetria została początkowo zastosowana do PRP wyekstrahowanego z próbek krwi. Rzeczywiście, pobieranie krwi w probówkach zawierających cytrynian pozwala na szybką i dużą produkcję PRP bez żadnego wpływu na integralność i funkcję płytek krwi. Jednak krótkotrwała stabilność (około 3 godzin) PRP i pozostałych enzymów plazmatycznych, takich jak trombina, oraz niskie stężenie wapnia związane z potencjalnie artefaktowymi profilami agregacji stanowią poważne niedogodności dla stosowania PRP. Ważnym krokiem naprzód było opracowanie metody izolacji płytek krwi z dodatkowymi etapami wirowania i mycia6. Krótko mówiąc, PRP izoluje się z krwi pełnej pobranej na kwasowo-cytrynianowo-dekstrozie (ACD), a płytki krwi są izolowane po seryjnych etapach wirowania przed ponownym zawieszeniem w izoosmotycznym buforze fosforanowym (bufor Tyrode'a) zawierającym glukozę, ludzką albuminę surowicy i kationy dwuwartościowe (Ca2+ i Mg2+). Aby uniknąć zmian w reaktywności płytek krwi, pH buforu Tyrode'a jest starannie utrzymywane na poziomie 7,35-7,4. Ponadto niepożądanej aktywacji płytek krwi zapobiega się poprzez dodanie prostacykliny (PGI2) przed niektórymi etapami wirowania. Wreszcie, dodatek apirazy zapobiega uodparnianiu się umytych płytek krwi na działanie ATP/ADP. Powstała zawiesina płytek krwi pozbawiona jest czynników krzepnięcia, a stabilność płytek krwi jest zwiększona co najmniej dwukrotnie w porównaniu z roztworami PRP. Ponadto fakt, że płytki krwi są nieaktywne, ale nienaruszone, gwarantuje powtarzalność pomiarów mętnościowych i zapewnia możliwość badania działania agonistów lub antagonistów agregacji płytek krwi w optymalny sposób.
Korzystając z tej metody, wykazaliśmy w niedawnym badaniu, że hamowanie tworzenia kanałów Panx1 za pomocą podejścia genetycznego (myszy knock-out) lub zmniejszanie aktywności kanału Panx1 za pomocą metod farmakologicznych zmniejszało agregację płytek krwi indukowaną kolagenem7. Panx1 tworzy kanały uwalniania ATP, które są powszechnie wyrażane w wielu typach komórek, w tym w ludzkich płytkach krwi7,8. W rzeczywistości wykazaliśmy za pomocą turbidymetrii na ludzkich umytych płytkach krwi, że 7-minutowa preinkubacja z panelem mniej lub bardziej specyficznych blokerów chemicznych (probenecyd, meflochina i 10peptydów Panx1) przed dodaniem różnych agonistów hamowała specyficznie indukowaną kolagenem agregację płytek krwi, podczas gdy odpowiedzi płytek krwi na AA i ADP nie były zaburzone. Wykazaliśmy, że uwalnianie ATP przez kanały Panx1 specyficznie zakłóca szlak sygnałowy GPVI, prowadząc do agregacji indukowanej kolagenem. Co ciekawe, wiele zatwierdzonych przez FDA związków mających zastosowanie w innych chorobach (probenecyd, meflochina) wpływa na aktywność kanałów Panx1 w płytkach krwi. Z jednej strony otwiera to nowe perspektywy terapeutyczne w zakresie selektywnej modyfikacji reaktywności płytek krwi. Z drugiej strony należy wziąć pod uwagę potencjalne skutki uboczne tych związków. W tym kontekście, bezpieczny barwnik spożywczy Brilliant Blue FCF stosowany w wielu słodyczach i napojach energetycznych został opisany jako selektywny inhibitor Panx19. Opisano tutaj protokół izolacji przemytych przez człowieka płytek krwi oraz pomiary turbidymetryczne agregacji płytek krwi przystosowane do badania wpływu barwnika Brilliant Blue FCF jako antagonisty agregacji płytek krwi.

<table><tbody><tr><td>kwas cytrynowy jednowodny (C6H8O7*H2O)</td><td>Roth</td><td>5949-29-1</td><td>niebezpieczeństwo uszkodzenia/podrażnienia oczu</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy dwuwodny (Na3C6H5O7*2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-D</td><td></td></tr><tr><td>(+)-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-Chlorek</td><td></td></tr> <tr><td>sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-Chlorek</td><td></td></tr> <tr><td>potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-Wodorowęglan</td><td></td></tr> <tr><td>sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>-</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4*H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-Sześciowodny</td><td></td></tr> <tr><td>chlorek magnezu (MgCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-Sześciowodny</td><td></td></tr> <tr><td>chlorek wapnia (CaCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442909</td><td>niebezpieczeństwo uszkodzenia/podrażnienia oczu</td></tr><tr><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (Hepes)</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>15630-albumina</td><td></td></tr> <tr><td>surowicy ludzkiej</td><td>CSL Behring</td><td>00257/374-kwas</td><td></td></tr> <tr><td>solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Działa żrąco i drażniąco na układ oddechowy. Może powodować poważne uszkodzenia skóry i oczu.</td></tr><tr><td>Eppendorf 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>heparyna</td><td>Drosspharm AG/SA</td><td>20810</td><td></td></tr><tr><td>prostacyklina I2 (PGI2)</td><td>Kajman</td><td>18220-apyraza</td><td></td></tr> <tr><td>z ziemniaków</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535-fibrynogen</td><td></td></tr> <tr><td>(Haemocomplettan)</td><td>CSL Behring</td><td>HS</td><td></td></tr> <tr><td>73466011-agragometr trombo-trombo-agragometr SD-Medical</td><td>SD-Innovation</td><td>TA8V-Błękit</td><td></td></tr> <tr><td>brylantowy FCF (sól disodowa erioglaucyny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80717</td><td>Działa szkodliwie na organizmy wodne o długotrwałych skutkach (Unikać uwolnienia do środowiska)</td></tr><tr><td>kolagen</td><td>Horm, Kwas Nycomed-arachidonowy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Bio/Data corporation</td><td>C/N</td><td></td></tr> <tr><td>Licznik 101297 komórek Sysmex KX-21N</td><td>Sysmex Digitana&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056-szklane</td><td></td></tr> <tr><td>kuwety</td><td>SD-Innovation</td> <td>THCV1000-mieszadła</td><td></td></tr> <tr><td>magnetyczne</td><td>SD-Innovation</td><td>THA100</td><td>-</td></tr></tbody></table>

zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 brilliant blue fcf na agregację indukowaną kolagenem

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidymetria to technika laboratoryjna, która jest stosowana do pomiaru agregacji płytek krwi zawieszonych w osoczu (osocze bogatopłytkowe, PRP) lub w buforze (przemyte płytki krwi), za pomocą jednego lub kombinacji agonistów. Zastosowanie przepłukanych płytek krwi oddzielonych od środowiska ich osocza i przy braku antykoagulantów pozwala na badanie wewnętrznych właściwości płytek krwi. Spośród dużego panelu agonistów najczęściej stosuje się kwas arachidonowy (AA), difosforan adenozyny (ADP), trombinę i kolagen. Odpowiedź agregacji określa się ilościowo, mierząc względną gęstość optyczną (OD) zawiesiny płytek krwi w czasie przy ciągłym mieszaniu. Płytki krwi w jednorodnej zawiesinie ograniczają przepływ światła po dodaniu agonisty, następuje zmiana kształtu płytek krwi, powodując niewielki przejściowy wzrost OD. Po tym początkowym etapie aktywacji stopniowo tworzą się skrzepy płytek krwi, które umożliwiają przejście światła przez zawiesinę w wyniku zmniejszonego OD. Proces agregacji jest ostatecznie wyrażony w procentach w porównaniu z OD osocza lub buforu ubogiego w płytki krwi. Rygorystyczna kalibracja jest zatem niezbędna na początku każdego eksperymentu. Ogólna zasada: kalibrację do 0% ustala się poprzez pomiar OD niestymulowanej zawiesiny płytek krwi, podczas gdy pomiar OD pożywki zawiesinowej niezawierającej płytek krwi reprezentuje wartość 100%. Agregacja płytek krwi jest zwykle wizualizowana jako krzywa agregacji w czasie rzeczywistym. Zmętnienie jest jedną z najczęściej stosowanych technik laboratoryjnych do badania funkcji płytek krwi i jest uważana za historyczny złoty standard i jest wykorzystywana do opracowywania nowych środków farmaceutycznych mających na celu hamowanie agregacji płytek krwi. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły 1) przygotowania ludzkich płukanych płytek krwi i 2) analizy turbidymetrycznej indukowanej kolagenem agregacji ludzkich umytych płytek krwi wstępnie potraktowanych barwnikiem spożywczym Brilliant Blue FCF, który został niedawno zidentyfikowany jako inhibitor kanałów Pannexin1 (Panx1).

Oprogramowanie agregometru automatycznie generuje krzywe agregacji i podaje wartości maksymalnej agregacji w procentach. Wartości te można skopiować do programu do analizy danych w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i wizualizacji maksymalnych wartości agregacji w formie wykresów słupkowych. Opcjonalnie każdy pojedynczy punkt krzywych agregacji może być sukcesywnie eksportowany do arkusza kalkulacyjnego, a następnie do programu statystycznego (np. GraphPad) w celu wizuali...

Opisujemy prostą metodę izolacji umytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie pomiary agregacji płytek krwi wywołanej przez agonistę za pomocą mętności. Jako przykład stosujemy tę metodę do badania odpowiedzi agregacyjnej ludzkich płytek krwi na kolagen po wstępnej inkubacji z inhibitorem kanału Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis prostego sposobu izolacji przemytych płytek krwi z ludzkiej krwi, a następnie pomiaru agregacji płytek indukowanej agonistami za pomocą turbidymetrii. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii ludzkich płytek krwi, takie jak wpływ inhibicji panneksyny-1 na indukowaną agonistami agregację płytek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona szybka i łatwa w wykonaniu, a jednocześnie pozwala na wiarygodne i powtarzalne monitorowanie odpowiedzi agregacyjnych.Agregometria transmisyjna światła jest wykorzystywana nie tylko w celach badawczych, ale również do badania funkcji płytek krwi u pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia. W celu rozpoczęcia, rozpuść 1,4 g monohydratu kwasu cytrynowego, 2,5 g dwuwodnianego cytrynianu trisodu oraz 2 g bezwodnej D-glukozy w wodzie destylowanej, aby przygotować 100 ml roztworu ACD o pH około 4,5. Następnie przygotuj bufor Tyroda, rozcieńczając 2,5 ml roztworu zapasowego jeden do końcowej objętości 15 ml wody destylowanej.Dostosuj pH do 7,35, dodając jeden normalny kwas solny, a następnie wysterylizuj roztwór poprzez filtrację przy użyciu filtra o rozmiarze porów 0,22 mikrona.

turbidimetry-on-human-washed-platelets-effect-pannexin1-inhibitor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Ten film pokazuje metodę oceny wpływu naprężeń ścinających na płytki krwi. Leczenie przeciwciałami indukuje dysocjację i zmiany konformacyjne w kompleksach mechanoreceptorowych, aktywując płytki krwi i wyrażając markery na powierzchni. Markery te obserwuje się za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Wpływ naprężenia ścinającego na płytki krwi leczone przeciwciałami przeciwko receptorom mechanosensorycznym

Ten film pokazuje analizę mętnościową w celu oceny indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi w wstępnie potraktowanych, umytych ludzkich płytkach krwi. Studzienki kontrolne wykazują agregację indukowaną kolagenem, podczas gdy wysokie stężenie inhibitorów blokuje kanały Pannexin-1, hamując w ten sposób agregację płytek krwi indukowaną kolagenem, widoczną niezmienionym zmętnieniem.

Analiza turbidymetryczna w celu monitorowania indukowanej kolagenem agregacji wstępnie leczonych ludzkich płytek krwi

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi.

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Poznaj metodę izolacji płytek krwi i pomiaru ich agregacji za pomocą zmętnienia. Technika ta pozwala badać wpływ inhibitora Pannexin1 na aktywację płytek kolagenem w badaniach biologii krwi.

Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem

Przeglądaj więcej filmów