Name: CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę CAPRRESI do szybkiego i taniego tworzenia genów chimerowych poprzez wstawianie miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych w synonimiczne sekwencje DNA. Technika ta ułatwia fuzję genów kodujących białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (grant numer 154833) i Universidad Nacional Autónoma de México. Autorzy pragną podziękować Víctorowi Gonzálezowi, Rosie I. Santamaríi, Patricii Bustos i Soledad Juárez za ich porady administracyjne i techniczne.

1. Protokół CAPRRESI
UWAGA: Rysunek 1 przedstawia ogólny protokół CAPRRESI. Technika ta opiera się na projektowaniu in silico i późniejszej budowie pożądanych chimer.
<ol>
	<li>Wybór plazmidu klonującego, pUC18 lub pUC19.
	<ol>
		<li>Wybierz wektor pUC, który najlepiej odpowiada wymaganiom technicznym. 
		UWAGA: Oba wektory mają tę samą sekwencję, z wyjątkiem orientacji miejsca klonowania wielokrotnego. Jest to ważne dla projektowania oligonukleotydów i rozerwania plazmidu PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza in silico genów typu dzikiego i sekwencji pUC18/19.
	<ol>
		<li>Uzyskaj sekwencje DNA genów typu dzikiego i zapisz je w pliku w formacie FASTA (np. genes.fas). 
		UWAGA: Sekwencje wektorów pUC18/19 są zawarte w pliku pUC.fas (Rysunek 1, krok 1).</li>
		<li>Określ, które enzymy restrykcyjne nie przecinają genów typu dzikiego i sekwencji pUC18/19, uruchamiając skrypt REsearch.pl. Alternatywnie, przeprowadź wyszukiwanie w witrynie enzymów restrykcyjnych za pomocą narzędzia online (Rysunek 1, krok 2).
		<ol>
			<li>Wpisz w terminalu następujące polecenie: 
			perl REsearch.pl genes.fas 
			perl REsearch.pl pUC.fas 
			UWAGA: Te polecenia utworzą następujące pliki wyjściowe: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas i pUC_re.fas.</li>
			<li>Wybierz odpowiednie enzymy restrykcyjne do klonowania genów typu dzikiego do miejsca wielokrotnego klonowania wybranego wektora pUC18/19, porównując pliki genes_re.fas i pUC.fas. Należy wybrać orientację wkładki względem genu oporności na ampicylinę (ampR) wektora pUC18/19.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaprojektuj oligonukleotydy do przodu i do tyłu, aby amplifikować region kodujący genów typu dzikiego (oligonukleotydy zewnętrzne). Uwzględnij odpowiednie miejsce enzymu restrykcyjnego na każdym końcu oligonukleotydów o długości 5 stóp; Spowoduje to zdefiniowanie orientacji wstawiania.
		<ol>
			<li>Uwzględnij funkcjonalne miejsce wiązania rybosomów w przodujących oligonukleotydach.</li>
			<li>Wstaw oba geny typu dzikiego w tej samej orientacji wewnątrz wektora.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór obszarów łamania do składania chimer i rozerwania plazmidu.
	<ol>
		<li>Uzyskaj sekwencję aminokwasów genów typu dzikiego i ampR, uruchamiając skrypt translate.pl (Rysunek 1, krok 3).
		<ol>
			<li>Wpisz w terminalu następujące polecenie: 
			perl translate.pl genes.fas 
			perl translate.pl ampR.fas 
			UWAGA: Ten skrypt utworzy następujące pliki wyjściowe: genes_aa.fas i ampR_aa.fas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Globalnie wyrównaj dwie sekwencje aminokwasów typu dzikiego za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. MUSCLE)9.</li>
		<li>Wybierz żądane obszary przerwania (3-6 aminokwasów) do złożenia chimery na podstawie wyrównania sekwencji. Zapisz je do pliku w formacie FASTA (np. regions.fas).</li>
		<li>Zlokalizuj sekwencje DNA, które kodują wybrany aminokwas, rozciągają się na obu genach typu dzikiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie in silico sekwencji synonimów DNA zawierających miejsca enzymów restrykcyjnych.
	<ol>
		<li>Uzyskaj wszystkie sekwencje synonimów DNA, które kodują każdy odcinek sekwencji aminokwasów wybrany jako regiony łamania (Rysunek 1, krok 4); sekwencje te były przechowywane w pliku regions.fas.
		<ol>
			<li>Wpisz w terminalu następujące polecenie: 
			perl synonym.pl regions.fas 
			UWAGA: Ten skrypt utworzy plik wyjściowy regions_syn.fas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Szukaj miejsc enzymów restrykcyjnych znalezionych w sekwencjach synonimów DNA.
		<ol>
			<li>Wpisz do terminala następujące polecenie: perl REsynonym.pl regions_syn.fas 
			UWAGA: Ten skrypt utworzy plik wyjściowy regions_syn-re.fas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz jeden enzym restrykcyjny, który jest wspólny dla sekwencji synonimów obu genów typu dzikiego; to miejsce zostanie wykorzystane do składania chimer poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym. Sprawdź, czy wybrany enzym restrykcyjny nie przeciął ani genów typu dzikiego, ani sekwencji wektorów pUC18/19.
		<ol>
			<li>Porównaj enzymy restrykcyjne znajdujące się w plikach genes_re.fas, pUC_re.fas i regions_syn-re.fas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>In silico zastąpić oryginały ich synonimicznymi sekwencjami DNA w odpowiednich loci na obu genach typu dzikiego. Dołącz synonimiczne sekwencje DNA do pliku sekwencji typu dzikiego (genes.fas).</li>
		<li>Pobierz sekwencję aminokwasów genów zawartych w pliku genes.fas (perl translate.pl genes.fas).</li>
		<li>Dopasuj sekwencje aminokwasów przetłumaczone z sekwencji DNA typu dzikiego i synonimów. Sprawdź, czy obie sekwencje są takie same.</li>
		<li>Powtórz wszystkie kroki tej sekcji z genem ampR obecnym na wektorze pUC18/19. 
		UWAGA: Celem jest rozbicie genu ampR (file ampR.fas) na dwie uzupełniające się części. Enzym restrykcyjny wybrany do zakłócenia genu ampR powinien być inny niż ten używany do składania chimer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Niezależne klonowanie dwóch genów typu dzikiego do wybranego wektora pUC18/19 (Figura 1, krok 3).
	<ol>
		<li>Oczyść wybrane plazmidowe DNA pUC18/19 za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA.
		<ol>
			<li>Na przykład przekształć E. coli DH5α za pomocą plazmidu pUC18 i hoduj transformanty przez noc w temperaturze 37 °C na stałej ampicylinie LB-0,3 mg / ml (Amp). Wybierz kolonię transformacyjną, zaszczep nową płytkę LB-0,3 mg/ml Amp i hoduj ją przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Weź część poprzedniej kultury i hoduj ją w płynie LB-0,3 mg/mL Amp przez 6-8 godzin w temperaturze 37 °C. Ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PCR amplifikuje geny typu dzikiego z całkowitego genomowego DNA przy użyciu odpowiednich zewnętrznych oligonukleotydów. Jeśli to możliwe, użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności. Wybierz polimerazę DNA, która maksymalizuje wydajność. Wykonaj PCR zgodnie z wytycznymi producenta i temperaturą topnienia oligonukleotydów.
		<ol>
			<li>Uruchom cykle PCR, w zależności od użytej polimerazy DNA, wielkości amplikonu, matrycy i oligonukleotydów. Na przykład, aby amplifikować DNA rpoD, przygotuj reakcję 50 μL: 5 μL 10x buforu, 2 μL 50 mM MgSO4, 1 μL 10 mM mieszaniny dNTP, 2 μL każdego oligonukleotydu 10 μM (Tabela 2), 2 μL matrycowego DNA (E. coli DH5α całkowite DNA), 35,8 μl ultraczystej wody i 0,2 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności. Uruchom następujące cykle PCR: 1 min w temperaturze 94 °C dla początkowej denaturacji, a następnie 30 cykli amplifikacji (30 s w temperaturze 94 °C w celu denaturacji, 30 s w temperaturze 60 °C w celu wyżarzania oligonukleotydów i 2 min w temperaturze 68 °C w celu przedłużenia).</li>
			<li>Rozpuść 1,2 g agarozy w 100 ml podwójnie destylowanej wody, podgrzewając je w kuchence mikrofalowej. Zamontuj tackę na żel i grzebień i włóż je do poziomego kółka żelowego. Napełnij tackę na żel stopionym roztworem agarozy i pozwól mu zastygnąć. Wyjmij grzebień.</li>
			<li>Umieść żel w komorze do elektroforezy. Napełnij komorę 1x buforem Tris-acetate-EDTA. Załaduj 50 μl produktów PCR do studzienek żelowych. Próbki należy poddać elektroforezie (np. pod napięciem 110 V przez 1 godzinę).</li>
			<li>Po elektroforezie wybarwić żel w 100 ml podwójnie destylowanej wody zawierającej 100 μl roztworu bromku etydyny o stężeniu 1 mg/ml przez 10 minut, powoli wstrząsając. Umyj żel w podwójnie destylowanej wodzie przez kolejne 10 minut, powoli wstrząsając; Użyj wytrząsarki poziomej. 
			Uwaga: Bromek etydyny jest związkiem toksycznym; Nosić rękawice ochronne i bawełniany fartuch laboratoryjny.</li>
			<li>Oczyść DNA genu typu dzikiego z odpowiednich prążków żelu za pomocą zestawu. Uwidocznij pasma, umieszczając zabarwiony żel w komorze UV (zalecana długość fali: 300 nm). Ogranicz ekspozycję żelu do minimum. Użyj zestawu do oczyszczania DNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. 
			Uwaga: promieniowanie UV jest niebezpieczne; Noś tarczę ochronną, okulary i bawełniany fartuch laboratoryjny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Trawić oczyszczone geny typu dzikiego i plazmidowe DNA pUC18/19 za pomocą enzymów restrykcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli to możliwe, używaj enzymów szybkiego trawienia. Na przykład strawić 6 μl DNA pUC18 (300 ng/μl) w 10 μl ultraczystej wody, 2 μl buforu 10X, 1 μl enzymu restrykcyjnego KpnI i 1 μl enzymu restrykcyjnego XbaI. Pozostawić reakcję w temperaturze 37 °C na 30 minut.
		<ol>
			<li>Dezaktywuj enzymy restrykcyjne zgodnie z wytycznymi producenta. Na przykład dezaktywować reakcję podwójnego wytrawiania Kpn I-XbaI w temperaturze 80 °C przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wymieszaj wkładkę: wektor DNA w stosunku objętościowym 3:1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi reakcji podwiązania. Jeśli to możliwe, należy stosować szybkie enzymy ligacyjne (pozostawić reakcję w temperaturze 25 °C na 10 minut). 
		UWAGA: Zazwyczaj stężenie DNA po oczyszczeniu przy użyciu zestawów jest wystarczająco dobre do reakcji trawienia i ligacji. Na przykład dodaj 6 μL DNA rpoD (Kpn I-XbaI, 150 ng/μL), 3 μL DNA pUC18 (Kpn I-XbaI, 150 ng/μL), 10 μL buforu 2x, 1 μL ultraczystej wody i 1 μL ligazy DNA T4. Pozostawić reakcję podwiązania w temperaturze 25 °C na 10 minut.</li>
		<li>Przekształć E. coli DH5α w 2-4 μl reakcji ligacji, jak opisano w materiałach uzupełniających. Umieść przekształcone komórki na stałych płytkach LB / Amp / X-gal / IPTG. Pozostaw płytki na noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wybierz białe kolonie transformacyjne E. coli i umieść je na nowej płytce LB/Amp. Pozostaw płytki na noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR kolonii, aby wybrać kandydatów do sekwencjonowania reakcji, zgodnie z opisem w materiałach uzupełniających. Wyodrębnij plazmidowe DNA od kandydatów. Alternatywnie, trawić kandydujące plazmidowe DNA za pomocą tych samych enzymów restrykcyjnych, które są używane do klonowania wstawień.</li>
		<li>Sekwencjonowanie konstrukcji kandydujących za pomocą dostawcy usług sekwencjonowania10. Złóż sekwencję in silico za pomocą asemblera DNA11(Rysunek 1, krok 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakłócenie plazmidu przez PCR, a następnie trawienie enzymem restrykcyjnym.
	<ol>
		<li>Projektowanie in silico oligonukleotydów do przodu i do tyłu w regionach przerwania odpowiednio dla genów typu dzikiego i ampR. Zastąp in silico fragment typu dzikiego odpowiadającą mu sekwencję synonimu DNA (otrzymaną w kroku 1.4). 
		UWAGA: Ta synonimiczna sekwencja DNA zawiera miejsce enzymu restrykcyjnego. Oligonukleotydy do przodu i do tyłu nakładają się na siebie w miejscu enzymu restrykcyjnego. Oligonukleotydy powinny mieć od 21 do 27 nukleotydów, kończyć się cytozyną lub guaniną i zawierać miejsce enzymu restrykcyjnego. Oligonukleotyd forward ma taką samą sekwencję jak jego region docelowy na matrycy DNA. Odwrócony oligonukleotyd to odwrotna komplementarna sekwencja regionu docelowego na matrycy DNA.</li>
		<li>Użyj dwóch konstrukcji genów typu dzikiego jako matrycy DNA dla reakcji PCR (np. pUC18rpoD i pUC18sigA). Uzyskaj dwie komplementarne części każdej konstrukcji (pUC18rpoDσ1-σ2, pUC18rpoDσ3-σ4, pUC18sigAσ1-σ2 i pUC18sigAσ3-σ4) (Rysunek 1, krok 6).</li>
		<li>Załaduj próbki DNA do żelu agarozowego 1-1,2% [w/v]. Oddzielić produkty PCR od matrycy DNA za pomocą elektroforezy (np. 110 V przez 1 godzinę). Alternatywnie, trawić reakcje PCR z DpnI, aby rozbić matrycę DNA. 
		UWAGA: Enzym DpnI rozpoznaje tylko metylowane sekwencje DNA (5'-GATC-3').
		<ol>
			<li>Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podwójnie trawić wszystkie komplementarne fragmenty DNA za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych zgodnie ze wskazówkami producenta. Jeśli to możliwe, używaj szybko trawionych enzymów restrykcyjnych. Na przykład podwójnie trawij fragment DNA pUC18rpoDσ1-σ2 za pomocą AflII i SpeI, korzystając z protokołu producenta. Pozostawić reakcję trawienia w temperaturze 37 °C na 15 minut.</li>
		<li>Dezaktywuj enzymy restrykcyjne zgodnie z wytycznymi producenta. Na przykład dezaktywować Afl II-SpeI w temperaturze 80 °C przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie plazmidu za pomocą ligacji DNA i transformacji bakteryjnej.
	<ol>
		<li>Wymieszaj odpowiednie fragmenty DNA w stosunku wolumetrycznym 1:1, aby złożyć pożądany gen chimeryczny (Rysunek 1, krok 7). 
		UWAGA: W ten sposób przywracana jest integralność genu ampR, wytwarzającego funkcjonalne białko.
		<ol>
			<li>Na przykład zmieszaj 4 μl DNA pUC18rpoDσ1-σ2 (trawionego przez Afl II-SpeI, 150 ng/μL), 4 μL DNA pUC18sigAσ3-σ4 (Afl II-SpeI, 150 ng/μL), 10 μL buforu 2x, 2 μl ultraczystej wody i 1 μl ligazy DNA T4; stężenie DNA po oczyszczeniu zestawu jest wystarczająco dobre do trawienia i Kolejne podwiązanie. Pozostawić reakcję podwiązania w temperaturze 25 °C na 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przekształć E. coli DH5α za pomocą 3-5 μl reakcji ligacji zespołu chimery (materiały uzupełniające). Hoduj ogniwa transformacyjne na płytkach LB/Amp/X-gal/IPTG przez noc w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Wybierz białe kolonie transformacyjne E. coli i umieść je na nowej płytce LB/Amp. Pozostaw płytki na noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wykonaj PCR kolonii, aby wybrać kandydatów do reakcji sekwencjonowania, zgodnie z opisem w materiałach uzupełniających. Uwidocznij pasma w żelu agarozowym 1-1,2% (w/v), wykonując elektroforezę (opisaną w kroku 2.3.2.1).</li>
		<li>Rozwijaj kultury z pozytywnych kandydatów. Wyodrębnij z nich plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekwencja kandydująca do budowy chimerycznej
<ol>
	<li>Upewnij się, że jakość plazmidowego DNA jest wystarczająco dobra dla reakcji sekwencjonowania, postępując zgodnie z wytycznymi dostawcy usług sekwencjonowania. Ekstrakcja DNA za pomocą zestawów do oczyszczania. Na przykład na stronie internetowej dostawcy usług sekwencyjnych należy zwrócić szczególną uwagę na zalecane stężenie DNA dla próbek. Uzyskać stężenie próbek za pomocą przyrządu do oznaczania ilościowego DNA.</li>
	<li>Sekwencja kandydatów na konstrukcje chimeryczne z dostawcą usług sekwencjonowania10.</li>
	<li>Sekwencjonowanie składa się z odczytów za pomocą asemblera DNA in silico11.</li>
	<li>Wyrównywanie sekwencji chimerycznych zaprojektowanych przez simerykę w porównaniu z sekwencjami zaprojektowanymi za pomocą narzędzi do wyrównywania sekwencji9,12. Sprawdź, czy gen chimeryczny został pomyślnie połączony.</li>
</ol>
3. Przygotowania
UWAGA: Wszystkie czynności dotyczące żywych komórek należy wykonywać w czystym okapie z przepływem laminarnym przy włączonym palniku Bunsena.
<ol>
	<li>Wytwarzanie komórek E. coli kompetentnych do DH5α.
	<ol>
		<li>Aby wyprodukować komórki kompetentne dla E. coli, postępuj zgodnie z opublikowanymi protokołami13 lub zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi. Alternatywnie można użyć dostępnych na rynku kompetentnych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformacja komórek E. coli kompetentnych DH5α.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać informacje na temat przemiany chemicznej kultur E. coli, postępuj zgodnie z opublikowanymi protokołami13 lub zobacz Materiały dodatkowe. Alternatywnie użyj elektroporacji do transformacji bakteryjnej. Jeśli używane są dostępne na rynku kompetentne ogniwa, postępuj zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie genomowego i plazmidowego DNA z E. coli DH5α.
	<ol>
		<li>Wykonaj ekstrakcję kwasów nukleinowych, jak określono w materiałach uzupełniających, przy użyciu dostępnych na rynku zestawów lub zgodnie z opublikowanymi protokołami13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj PCR kolonii.
	<ol>
		<li>Użyj tej techniki, aby zidentyfikować potencjalne kolonie transformujące do późniejszej reakcji sekwencjonowania. 
		UWAGA: Metoda ta nie stanowi ostatecznej weryfikacji integralności sekwencji. Szczegółowy opis tej techniki dostępny jest w Materiałach Uzupełniających.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów.
	<ol>
		<li>Więcej informacji na temat przygotowania roztworu znajduje się w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz skrypty i pliki sekwencji wymagane dla protokołu CAPRRESI.
	<ol>
		<li>Pobierz pliki banku genów zawierające pełną sekwencję genomu pożądanego gatunku, wyodrębnij sekwencję DNA wybranego genu za pomocą przeglądarki genomów i zapisz ją w formacie pliku fasta. Pobierz skrypty Perla wymagane dla protokołu CAPRRESI. Skrypty i pliki sekwencji należy przechowywać w tym samym katalogu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li>
<li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+The+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li>
<li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li>
<li>Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp">http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp</a> (2016).</li>
<li>Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.chevreux.org/thesis/index.html">http://www.chevreux.org/thesis/index.html</a> 1-161 (2005).</li>
<li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.molecularcloning.com/">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li>
<li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemis%3A+sequence+visualization+and+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

CAPRRESI został zaprojektowany jako alternatywa dla PRM2. Oryginalny PRM to potężna technika; pozwala na fuzję sekwencji DNA wzdłuż dowolnej części wybranych genów. W przypadku PRM geny typu dzikiego powinny być klonowane do tego samego plazmidu. Następnie oligonukleotydy są projektowane wewnątrz genów oporności na antybiotyki typu dzikiego i antybiotyków znajdujących się w plazmidzie. Rozerwanie plazmidu uzyskuje się za pomocą PCR przy użyciu tępo zakończonych, polimeraz DNA o wysokiej wierności ...

Chimeryczny zespół genów był szeroko stosowany w biologii molekularnej do wyjaśniania funkcji białek i/lub do celów biotechnologicznych. Istnieją różne metody fuzji genów, takie jak nakładająca się amplifikacja produktu PCR1, odzyskiwanie plazmidu2, rekombinacja homologiczna3, systemy CRISPR-Cas94, site-directed recombination5 i Gibson assembly6. Każdy z nich oferuje inne zalety techniczne; na przykład elastyczność nakładającego się projektowania PCR, wybór konstrukcji in vivo podczas odzyskiwania plazmidu lub wysoka wydajność systemów CRISPR-Cas9 i Gibsona. Z drugiej strony mogą pojawić się pewne trudności podczas wykonywania niektórych z tych metod; na przykład pierwsze dwa podejścia opierają się na końcach fragmentów DNA, a ligacja tego typu produktów może być technicznie trudna w porównaniu z ligacją z lepkimi końcami. Rekombinacja ukierunkowana na miejsce może pozostawić ślady dodatkowych sekwencji DNA (blizn) na oryginale, jak w systemie Cre-loxP5. CRISPR-Cas9 może czasami modyfikować inne regiony genomu oprócz miejsca docelowego4.
Tutaj wprowadzamy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół fuzji genów kodujących białka, który łączy metodę odzyskiwania plazmidu (PRM) z wstawianiem miejsc enzymów restrykcyjnych na sekwencje synonimów DNA, zwiększając efektywność ligacji. Aby zapewnić integralność sekwencji aminokwasów, miejsca enzymów restrykcyjnych są wstawiane do odcinków sekwencji synonimów DNA. Jedną z zalet CAPPRESI jest to, że można go wykonać przy użyciu zwykłych odczynników/narzędzi laboratoryjnych (np. enzymów, kompetentnych komórek, roztworów i termocyklera) oraz że może dać szybkie wyniki (gdy stosuje się odpowiednie enzymy). Poleganie na miejscach enzymów restrykcyjnych, które wyłaniają się z synonimów sekwencji DNA, może ograniczyć wybór dokładnych punktów fuzji wewnątrz interesujących białek. W takich przypadkach geny docelowe powinny być połączone za pomocą nakładających się oligonukleotydów, a miejsca enzymów restrykcyjnych powinny zostać wstawione do genu oporności wektora.
CAPRRESI składa się z siedmiu prostych kroków (Rysunek 1): 1) wybór wektora klonowania, pUC18 lub pUC196; 2) analiza in silico sekwencji typu dzikiego, które mają być połączone; 3) wybór regionów łamania do składania chimer i rozerwania plazmidu; 4) wytwarzanie in silico sekwencji synonimów DNA zawierających miejsca enzymów restrykcyjnych; 5) samodzielne klonowanie genów typu dzikiego do wybranego plazmidu; 6) rozerwanie plazmidu metodą PCR, a następnie trawienie enzymem restrykcyjnym; oraz 7) odzyskiwanie plazmidu za pomocą ligacji DNA i transformacji bakteryjnej. Geny chimeryczne wytworzone tą techniką powinny być weryfikowane za pomocą sekwencjonowania.
Wektory pUC18/19 oferują techniczne korzyści do klonowania i składania chimer, takie jak mały rozmiar (tj. 2,686 par zasad), wysoka liczba kopii, korzystne cechy reakcji sekwencjonowania i dostępność komercyjna7. W tym przypadku żywiciel Escherichia coli został użyty do złożenia i obsługi chimer, ponieważ kultury bakteryjne są tanie i szybko rosną. Biorąc to pod uwagę, konieczne będzie późniejsze klonowanie fragmentów fuzji do końcowych plazmidów docelowych (np. wektorów ekspresyjnych jako pRK415 w bakteriach lub pCMV w komórkach ssaków).
CAPRRESI zostało przetestowane pod kątem fuzji dwóch głównych genów czynnika sigma: E. colirpoD i Rhizobium etlisigA. Pierwszorzędowymi czynnikami sigma są podjednostki polimerazy RNA odpowiedzialne za inicjację transkrypcji i składają się z czterech domen (tj. σ1, σ2, σ3 i σ4)8. Długość sekwencji aminokwasów białek kodowanych przez rpoD i sigA wynosi odpowiednio 613 i 685. RpoD i SigA mają 48% wspólnego tożsamości (98% pokrycia). Te pierwotne czynniki sigma zostały podzielone na dwa komplementarne fragmenty między regionami σ2 i σ3. Zgodnie z tym projektem zestawiono dwa chimeryczne geny: chimerę 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) i chimerę 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Produkty fuzji DNA zweryfikowano za pomocą sekwencjonowania.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA Platinum Taq High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Wytwarza mieszankę / 3'-A zakończonych zwisem produktów PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji plazmidu o wysokiej czystości</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Stosowany we wszystkich reakcjach oczyszczania plazmidu Zestaw</td></tr> do <tr><td>oczyszczania produktu PCR o wysokiej czystości</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Stosowany we wszystkich reakcjach oczyszczania PCR z żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Rozpoznaje sekwencję 5'-CTTAAG-3' i tnie pod kątem 37 & stopni; </td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny C KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Rozpoznaje sekwencję 5'-GGTACC-3' i tnie pod kątem 37 & stopni; </td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny C SpeI-HF New</td><td>England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Rozpoznaje sekwencję 5'-ACTAGT-3' i tnie pod kątem 37 & stopni; C</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Rozpoznaje sekwencję 5'-TCTAGA-3' i tnie pod kątem 37 & stopni; C</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Kwas nalidyksowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Ekstrakt</td> drożdżowy <td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Hodowla komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Pepton kazeinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Hodowla komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>chlorek sodu</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td> Enzym restrykcyjny <td>do hodowli komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Enzym szybkiego trawienia XbaI</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>enzym Thermo Fisher</td><td>FD0524</td> Zestaw do szybkiego <td>ligowania KpnI enzym</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Zestaw do szybkiej ligacji DNA</td></tr><tr><td>AflII enzym restrykcyjny</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td> Enzym restrykcyjny <td>< > AflII <em</td></tr><tr><td>>SpeI enzym restrykcyjny</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Szybko trawiony SpeI enzym</td></tr></tbody></table>

caprresi: składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI). CAPRRESI korzysta z wielu zalet oryginalnej metody odzyskiwania plazmidu i wprowadza trawienie enzymem restrykcyjnym w celu ułatwienia reakcji ligacji DNA (wymaganej do składania chimer). W przypadku tego protokołu użytkownicy klonują geny typu dzikiego do tego samego plazmidu (pUC18 lub pUC19). Po selekcji in silico regionów sekwencji aminokwasów, w których chimery powinny być złożone, użytkownicy uzyskują wszystkie synonimiczne sekwencje DNA, które je kodują. ad hoc Skrypty Perla umożliwiają użytkownikom określenie wszystkich synonimów sekwencji DNA. Po tym kroku inny skrypt Perla wyszukuje miejsca enzymów restrykcyjnych we wszystkich sekwencjach DNA synonimów. Ta analiza in silico jest również przeprowadzana przy użyciu genu oporności na ampicylinę (ampR) znajdującego się w plazmidach pUC18/19. Użytkownicy projektują oligonukleotydy w regionach synonimów, aby zakłócić geny typu dzikiego i ampR za pomocą PCR. Po uzyskaniu i oczyszczeniu komplementarnych fragmentów DNA następuje trawienie enzymem restrykcyjnym. Składanie chimery uzyskuje się poprzez ligację odpowiednich komplementarnych fragmentów DNA. Wektory pUC18/19 zostały wybrane do CAPRRESI, ponieważ oferują zalety techniczne, takie jak mały rozmiar (2 686 par zasad), wysoka liczba kopii, korzystne cechy reakcji sekwencjonowania i dostępność komercyjna. Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do składania chimer eliminuje potrzebę polimeraz DNA dających produkty o końcach. CAPRRESI to szybka i tania metoda fuzji genów kodujących białka.

Rysunek 1 przedstawia metodę CAPRRESI. Z wykorzystaniem tej metody zmontowano dwa geny chimeryczne poprzez wymianę domen dwóch bakteryjnych głównych czynników sigma (tj. E. coli RpoD oraz R. etli SigA). Sekwencje DNA genów rpoD i sigA pobrano za pomocą przeglądarki genomów Artemis14 z plików genomowych GenBank NC_000913 i NC_007761, odpowiednio. Sekwencję DNA wektora pUC18 pobrano z bazy nukleotydowej serwera NCB...

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Niniejszy film prezentuje procedurę zwaną składaniem chimer poprzez odzyskiwanie plazmidów i insercję miejsc enzymów restrykcyjnych (CAPRRESI), w której generowane są dwa geny chimeryczne poprzez wprowadzenie specyficznych miejsc enzymów restrykcyjnych do synonimicznego DNA, a następnie wycięcie i zamianę sekwencji DNA. W metodzie CAPRRESI geny dzikiego typu, które są przedmiotem zainteresowania, są najpierw wstawiane do wielu miejsc klonowania tego samego wektora. Następnie wybierane są regiony przerwania dla każdego genu o tej samej sekwencji aminokwasowej oraz region przerwania dla genu oporności na ampicylinę.Skrypty Perl są wykorzystywane do wyznaczania sekwencji synonimicznych zawierających miejsca restrykcyjne dla każdego regionu przełomu. Z zastosowaniem specjalnie zaprojektowanych oligosów przeprowadza się reakcję PCR w celu otrzymania czterech komplementarnych części zawierających synonimiczne DNA z pożądanymi miejscami dla enzymów restrykcyjnych. Powstałe produkty PCR są oczyszczane, trawione, a następnie ligowane w celu uzyskania sekwencji chimerycznej.Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona tworzenie fuzji genów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

Poznaj metodę CAPRRESI do szybkiego i taniego tworzenia genów chimerowych poprzez wstawianie miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych w synonimiczne sekwencje DNA. Technika ta ułatwia fuzję genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Przeglądaj więcej filmów