Rekombinacja i celowanie genowe
Jednym z najczęściej stosowanych narzędzi we współczesnej biologii jest klonowanie molekularne za pomocą enzymów restrykcyjnych, które tworzą kompatyb…
Klonowanie za pomocą rekombinacji homologicznej lub rekombinacji znacznie poprawiło zdolność naukowców do prowadzenia wysokoprzepustowej inżynierii genetycznej. Klasyczne klonowanie molekularne wymaga trawienia wektorów i insercji z tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w celu wygenerowania kompatybilnych końców do "rekombinacji", ale szczególnie podczas próby wyizolowania regionu z dłuższej sekwencji, takiej jak odcinek genomowego DNA, nie zawsze istnieją enzymy restrykcyjne, które będą ciąć unikalnie wokół obszaru zainteresowania. a nie w obrębie regionu lub w innym miejscu sekwencji. Unikając konieczności stosowania tych miejsc ograniczających, rekombinacja zapewnia znacznie bardziej wydajny i opłacalny sposób tworzenia konstruktów inżynierii genetycznej.
W tym filmie przedstawimy zasady rekombinacji genetycznej, przedstawimy ogólny protokół rekombinacji wektora ukierunkowanego na gen i omówimy kilka zastosowań tych technologii.
Najpierw omówmy, czym jest rekombinacja i jak można ją zastosować.
Rekombinacja genetyczna pociąga za sobą wymianę informacji między cząsteczkami DNA. W "rekombinacji homologicznej" wymieniane są stosunkowo duże odcinki podobnych lub identycznych sekwencji DNA. Komórki wykorzystują ten proces do naprawy pęknięć podwójnej nici, a rozmnażające się płciowo eukarionty również przeprowadzają to między chromosomami homologicznymi podczas mejozy, aby zwiększyć różnorodność genetyczną.
Rekombinacja homologiczna została wykorzystana do wielu celów eksperymentalnych, w tym do modyfikacji określonych endogennych loci w komórkach - zwanej "celowaniem genowym". Jest również stosowana do inżynierii konstruktów genetycznych, procesu zwanego "rekombinacją", który jest szczególnie przydatny do wprowadzania modyfikacji dużych odcinków DNA w celu ukierunkowania na genom organizmu. W tym celu naukowcy mogą skorzystać z "bibliotek genomicznych", czyli zestawów wektorów, z których każdy zawiera długie fragmenty genomowego DNA. Stworzono różnego rodzaju biblioteki o różnej pojemności, zwykle rozmnażane w klonach bakteryjnych, które można zamawiać w repozytoriach komercyjnych lub non-profit. Jednym z najczęściej używanych typów bibliotek genomowych jest nazywany sztucznym chromosomem bakteryjnym lub BAC, który może przenosić wstawkę o rozmiarze od 150 do 350 kilozasad.
Aby zrekombinować konstrukt, naukowcy potrzebują organizmu, w którym zachodzi rekombinacja homologiczna. Drożdże Saccharomyces cerevisiae są naturalnie "kompetentne do rekombinacji" i mogą łatwo przeprowadzać homologiczną rekombinację między wektorem a insertem. Inny powszechnie stosowany system wykorzystuje "czerwone" białka bakteriofaga lambda, które są odtwarzane w bakteriach E. coli. Wektory mogą być rekombinowane albo we wcześniej ustalonych szczepach bakteryjnych z ekspresją czerwieni, albo plazmid kodujący składniki systemu czerwonego mogą być współprzekształcane z substratami rekombinującymi w bakterie.
Przejdźmy teraz przez protokół tworzenia wektora ukierunkowanego na gen poprzez rekombinację.
Celem tego protokołu jest stworzenie genetycznie zmodyfikowanej myszy z ukierunkowanymi zmianami w określonym genie. Krótko mówiąc, pożądane modyfikacje genu będącego przedmiotem zainteresowania są dokonywane w BAC; Zmodyfikowana sekwencja jest "pobierana" do wektora docelowego, a wektor ten jest transfekowany do embrionalnych komórek macierzystych w celu celowania w geny. Komórki macierzyste mogą być następnie wykorzystane do wytworzenia genetycznie zmodyfikowanego zwierzęcia. Aby uzyskać instrukcje dotyczące tej końcowej procedury, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education "Inżynieria genetyczna organizmów modelowych".
Aby rozpocząć, identyfikowany i porządkowany jest klon BAC zawierający sekwencję genomową, która jest przedmiotem zainteresowania. Następnie projektowane są ramiona homologiczne lub oligonukleotydy zawierające regiony homologiczne 30-50 par zasad. Te oligonukleotydy są używane jako startery w reakcjach PCR do generowania "kaset" DNA używanych do modyfikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Kasety te zazwyczaj zawierają, na przykład, geny oporności na antybiotyki, które mogą działać jako markery selekcyjne, które można łatwo amplifikować z wielu publicznie dostępnych plazmidów. Klon bakteryjny BAC jest następnie przekształcany, na przykład przez elektroporację, za pomocą plazmidu kodującego składniki systemu czerwonego, a następnie kaset zawierających ramię homologiczne. Bakterie są następnie inkubowane w odpowiedniej temperaturze w celu wywołania rekombinacji.
Aby odzyskać zmodyfikowaną sekwencję z BAC, wektor "odzyskiwania" jest linearyzowany i amplifikowany przy użyciu starterów zawierających ramiona homologiczne, które pokrywają kilka kilozasad wokół miejsca modyfikacji. Ten szkielet wektora jest przekształcany w klon bakteryjny BAC i ponownie indukowana jest rekombinacja. Wektor zostanie "naprawiony w przerwie" poprzez "pobranie" odpowiedniej sekwencji z BAC. W ten sposób powstaje wektor ukierunkowany na gen zawierający zmodyfikowaną sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania, a także regiony, które są homologiczne do genomowego DNA otaczającego zmodyfikowaną sekwencję. Wektor ten może być następnie oczyszczony, zlinearyzowany i wprowadzony do embrionalnych komórek macierzystych, gdzie endogenna maszyneria rekombinacji homologicznej będzie kierować zmodyfikowaną sekwencję do odpowiedniego locus, zmieniając w ten sposób genom gospodarza.
Przyjrzyjmy się teraz niektórym zastosowaniom technik inżynierii opartej na rekombinacji.
Po pierwsze, naukowcy mogą wykorzystać rekombinację do szybkiej i łatwej inżynierii genomu bakteryjnego, na przykład w celu badania kompleksów białkowych. W tym przypadku zaprojektowano kasetę kodującą sekwencyjny znacznik powinowactwa peptydowego, a także marker selekcyjny oporności na kanamycynę, który miał zostać ponownie połączony z końcem 3¢ genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wektor ten został następnie wprowadzony do czerwonego "kompetentnego rekombinacji" E. coli, a udane rekombinanty wyizolowano przy użyciu selektywnych pożywek. Znakowane kompleksy białkowe zostały oczyszczone biochemicznie przy użyciu białek, które silnie wiążą się ze znacznikami, i przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania partnerów interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Rekombinacja i celowanie w geny mogą być również wykorzystywane do modyfikowania genomu organizmów pasożytniczych, takich jak obligatoryjny pasożyt wewnątrzkomórkowy Toxoplasma gondii, który powoduje chorobę toksoplazmozę. W tym badaniu wektor celujący został ponownie połączony w drożdżach, gdzie sekwencje genomowe flankujące gen będący przedmiotem zainteresowania zostały umieszczone wokół markera selekcyjnego. Wektor został następnie zlinearyzowany i elektroporowany do pasożytów. Do wyizolowania udanych rekombinantów zastosowano posiewy ograniczające rozcieńczenie w pożywkach selektywnych, w których maszyneria rekombinacji homologicznej pasożyta zastąpiła sekwencję genomową sekwencją zmodyfikowaną, usuwając w ten sposób gen będący przedmiotem zainteresowania. PCR regionu docelowego potwierdził pozytywne zdarzenia rekombinacji.
Wreszcie, opracowano procedurę znaną jako subklonowanie plus insercja lub SPI, w której naprawa szczelin i wkładanie kasety odbywają się jednocześnie, dzięki czemu proces rekombinacji jest prostszy i bardziej elastyczny. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tego procesu ma właściwa konstrukcja ramion wielokrotnych homologii, które przy ciśnieniu do 180 pz są dłuższe niż w konwencjonalnej rekombinacji, aby zwiększyć wydajność rekombinacji. Po włączeniu ramion homologicznych do plazmidu subklonującego i kaset insercyjnych za pomocą PCR, zostały one przekształcone razem w klon BAC z ekspresją czerwieni i indukowano rekombinację. Pomyślnie zrekombinowane konstrukty zidentyfikowano następnie za pomocą PCR lub analizy trawienia restrykcji.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat rekombinacji. W tym filmie omówiliśmy zasady rekombinacji i sposób ich wykorzystania w inżynierii genetycznej, protokół projektu rekombinacji, a także kilka zastosowań tych technik. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Klonowanie za pomocą rekombinacji homologicznej lub rekombinacji znacznie poprawiło zdolność naukowców do prowadzenia wysokoprzepustowej inżynierii genetycznej. Klasyczne klonowanie molekularne wymaga trawienia wektorów i insercji z tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w celu wygenerowania kompatybilnych końców do "rekombinacji", ale szczególnie podczas próby wyizolowania regionu z dłuższej sekwencji, takiej jak odcinek genomowego DNA, nie zawsze istnieją enzymy restrykcyjne, które będą ciąć unikalnie wokół obszaru zainteresowania. a nie w obrębie regionu lub w innym miejscu sekwencji. Unikając konieczności stosowania tych miejsc ograniczających, rekombinacja zapewnia znacznie bardziej wydajny i opłacalny sposób tworzenia konstruktów inżynierii genetycznej.
W tym filmie przedstawimy zasady rekombinacji genetycznej, przedstawimy ogólny protokół rekombinacji wektora ukierunkowanego na gen i omówimy kilka zastosowań tych technologii.
Najpierw omówmy, czym jest rekombinacja i jak można ją zastosować.
Rekombinacja genetyczna pociąga za sobą wymianę informacji między cząsteczkami DNA. W "rekombinacji homologicznej" wymieniane są stosunkowo duże odcinki podobnych lub identycznych sekwencji DNA. Komórki wykorzystują ten proces do naprawy pęknięć podwójnej nici, a rozmnażające się płciowo eukarionty również przeprowadzają to między chromosomami homologicznymi podczas mejozy, aby zwiększyć różnorodność genetyczną.
Rekombinacja homologiczna została wykorzystana do wielu celów eksperymentalnych, w tym do modyfikacji określonych endogennych loci w komórkach - zwanej "celowaniem genowym". Jest również stosowana do inżynierii konstruktów genetycznych, procesu zwanego "rekombinacją", który jest szczególnie przydatny do wprowadzania modyfikacji dużych odcinków DNA w celu ukierunkowania na genom organizmu. W tym celu naukowcy mogą skorzystać z "bibliotek genomicznych", czyli zestawów wektorów, z których każdy zawiera długie fragmenty genomowego DNA. Stworzono różnego rodzaju biblioteki o różnej pojemności, zwykle rozmnażane w klonach bakteryjnych, które można zamawiać w repozytoriach komercyjnych lub non-profit. Jednym z najczęściej używanych typów bibliotek genomowych jest nazywany sztucznym chromosomem bakteryjnym lub BAC, który może przenosić wstawkę o rozmiarze od 150 do 350 kilozasad.
Aby zrekombinować konstrukt, naukowcy potrzebują organizmu, w którym zachodzi rekombinacja homologiczna. Drożdże Saccharomyces cerevisiae są naturalnie "kompetentne do rekombinacji" i mogą łatwo przeprowadzać homologiczną rekombinację między wektorem a insertem. Inny powszechnie stosowany system wykorzystuje "czerwone" białka bakteriofaga lambda, które są odtwarzane w bakteriach E. coli. Wektory mogą być rekombinowane albo we wcześniej ustalonych szczepach bakteryjnych z ekspresją czerwieni, albo plazmid kodujący składniki systemu czerwonego mogą być współprzekształcane z substratami rekombinującymi w bakterie.
Przejdźmy teraz przez protokół tworzenia wektora ukierunkowanego na gen poprzez rekombinację.
Celem tego protokołu jest stworzenie genetycznie zmodyfikowanej myszy z ukierunkowanymi zmianami w określonym genie. Krótko mówiąc, pożądane modyfikacje genu będącego przedmiotem zainteresowania są dokonywane w BAC; Zmodyfikowana sekwencja jest "pobierana" do wektora docelowego, a wektor ten jest transfekowany do embrionalnych komórek macierzystych w celu celowania w geny. Komórki macierzyste mogą być następnie wykorzystane do wytworzenia genetycznie zmodyfikowanego zwierzęcia. Aby uzyskać instrukcje dotyczące tej końcowej procedury, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education "Inżynieria genetyczna organizmów modelowych".
Aby rozpocząć, identyfikowany i porządkowany jest klon BAC zawierający sekwencję genomową, która jest przedmiotem zainteresowania. Następnie projektowane są ramiona homologiczne lub oligonukleotydy zawierające regiony homologiczne 30-50 par zasad. Te oligonukleotydy są używane jako startery w reakcjach PCR do generowania "kaset" DNA używanych do modyfikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Kasety te zazwyczaj zawierają, na przykład, geny oporności na antybiotyki, które mogą działać jako markery selekcyjne, które można łatwo amplifikować z wielu publicznie dostępnych plazmidów. Klon bakteryjny BAC jest następnie przekształcany, na przykład przez elektroporację, za pomocą plazmidu kodującego składniki systemu czerwonego, a następnie kaset zawierających ramię homologiczne. Bakterie są następnie inkubowane w odpowiedniej temperaturze w celu wywołania rekombinacji.
Aby odzyskać zmodyfikowaną sekwencję z BAC, wektor "odzyskiwania" jest linearyzowany i amplifikowany przy użyciu starterów zawierających ramiona homologiczne, które pokrywają kilka kilozasad wokół miejsca modyfikacji. Ten szkielet wektora jest przekształcany w klon bakteryjny BAC i ponownie indukowana jest rekombinacja. Wektor zostanie "naprawiony w przerwie" poprzez "pobranie" odpowiedniej sekwencji z BAC. W ten sposób powstaje wektor ukierunkowany na gen zawierający zmodyfikowaną sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania, a także regiony, które są homologiczne do genomowego DNA otaczającego zmodyfikowaną sekwencję. Wektor ten może być następnie oczyszczony, zlinearyzowany i wprowadzony do embrionalnych komórek macierzystych, gdzie endogenna maszyneria rekombinacji homologicznej będzie kierować zmodyfikowaną sekwencję do odpowiedniego locus, zmieniając w ten sposób genom gospodarza.
Przyjrzyjmy się teraz niektórym zastosowaniom technik inżynierii opartej na rekombinacji.
Po pierwsze, naukowcy mogą wykorzystać rekombinację do szybkiej i łatwej inżynierii genomu bakteryjnego, na przykład w celu badania kompleksów białkowych. W tym przypadku zaprojektowano kasetę kodującą sekwencyjny znacznik powinowactwa peptydowego, a także marker selekcyjny oporności na kanamycynę, który miał zostać ponownie połączony z końcem 3¢ genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wektor ten został następnie wprowadzony do czerwonego "kompetentnego rekombinacji" E. coli, a udane rekombinanty wyizolowano przy użyciu selektywnych pożywek. Znakowane kompleksy białkowe zostały oczyszczone biochemicznie przy użyciu białek, które silnie wiążą się ze znacznikami, i przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania partnerów interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Rekombinacja i celowanie w geny mogą być również wykorzystywane do modyfikowania genomu organizmów pasożytniczych, takich jak obligatoryjny pasożyt wewnątrzkomórkowy Toxoplasma gondii, który powoduje chorobę toksoplazmozę. W tym badaniu wektor celujący został ponownie połączony w drożdżach, gdzie sekwencje genomowe flankujące gen będący przedmiotem zainteresowania zostały umieszczone wokół markera selekcyjnego. Wektor został następnie zlinearyzowany i elektroporowany do pasożytów. Do wyizolowania udanych rekombinantów zastosowano posiewy ograniczające rozcieńczenie w pożywkach selektywnych, w których maszyneria rekombinacji homologicznej pasożyta zastąpiła sekwencję genomową sekwencją zmodyfikowaną, usuwając w ten sposób gen będący przedmiotem zainteresowania. PCR regionu docelowego potwierdził pozytywne zdarzenia rekombinacji.
Wreszcie, opracowano procedurę znaną jako subklonowanie plus insercja lub SPI, w której naprawa szczelin i wkładanie kasety odbywają się jednocześnie, dzięki czemu proces rekombinacji jest prostszy i bardziej elastyczny. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tego procesu ma właściwa konstrukcja ramion wielokrotnych homologii, które przy ciśnieniu do 180 pz są dłuższe niż w konwencjonalnej rekombinacji, aby zwiększyć wydajność rekombinacji. Po włączeniu ramion homologicznych do plazmidu subklonującego i kaset insercyjnych za pomocą PCR, zostały one przekształcone razem w klon BAC z ekspresją czerwieni i indukowano rekombinację. Pomyślnie zrekombinowane konstrukty zidentyfikowano następnie za pomocą PCR lub analizy trawienia restrykcji.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat rekombinacji. W tym filmie omówiliśmy zasady rekombinacji i sposób ich wykorzystania w inżynierii genetycznej, protokół projektu rekombinacji, a także kilka zastosowań tych technik. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.