Name: Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę iniekcji zwoju korzenia grzbietowego i urazu zmiażdżenia w szczurach do badania regeneracji aksonów czuciowych. Technika umożliwia ocenę terapii genowej bez bezpośredniego uszkodzenia rdzenia kręgowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty Fundacji Christophera i Dany Reeve, Rady Badań Medycznych, Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych ECMneuro oraz Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Pragniemy wyrazić naszą głęboką wdzięczność Heleen Merel van 't Spijker i Justynie Barratt za pomoc techniczną podczas realizacji zdjęć. Chcielibyśmy podziękować dr Elizabeth Moloney i profesorowi Joostowi Verhaagenowi (Holenderski Instytut Neuronauki) za pomoc w produkcji AAV.

Wszystkie poniższe procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. Jeśli nie jesteś zaznajomiony z tymi procedurami, zapoznaj się z lokalnymi/krajowymi przepisami i zasięgnij porady weterynarza przed rozpoczęciem protokołu.
1. Wybór odpowiedniego szczepu zwierząt
UWAGA: Uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego powoduje utratę czucia i deaffencję łapy. Częste działania niepożądane związane z deaferentacją przedniej łapy mogą obejmować nadmierną pielęgnację, samookaleczenie i autotomię łapy.
<ol>
	<li>Pozyskaj zwierzęta do zabiegu. 
	UWAGA: W przypadku szczurów, bardziej aktywne szczepy, takie jak Lister-Hooded i Wistar, mają większą częstość autotomii łap po deaferentacji w porównaniu z bardziej łagodnymi szczepami, takimi jak Lewis i Sprague-Dawley. Jeśli to możliwe, najbardziej posłuszny szczep, Lewis, powinien być zawsze brany pod uwagę w pierwszej kolejności. Jeżeli do eksperymentu konieczny jest szczególnie aktywny szczep ze względu na modyfikację genetyczną lub szczególne wymagania dotyczące oceny behawioralnej, należy zastosować leczenie weterynaryjne w celu zaradzenia spodziewanym skutkom ubocznym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wirusa do wstrzyknięcia
UWAGA: Z wszystkimi wirusami należy obchodzić się zgodnie z przepisami bezpieczeństwa biologicznego i laboratoryjnego.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć lub zagęścić wirusa do miana 2 x10 12 kopii genomu (GC)/ml zgodnie z indywidualnymi protokołami pakowania wirusów9. 
	UWAGA: W tym przypadku wirus został rozcieńczony w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco z 5% sacharozą. Miano może wymagać optymalizacji w zależności od rodzaju wirusa, promotora, rozmiaru konstruktu i docelowego typu komórki.</li>
	<li>Opcjonalnie: Dodaj 1% kolorowego barwnika (np. Fast Green) do roztworu wirusa, aby ułatwić późniejszą wizualizację wstrzyknięcia. Bardzo delikatnie wymieszaj roztwór.</li>
	<li>Roztwór należy przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia (w ciągu 4 godzin) lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie przedoperacyjne zwierzęcia
UWAGA: Ze względu na ekstremalną inwazyjność zabiegu, techniki aseptyczne powinny być stosowane przez cały czas.
<ol>
	<li>Przygotuj i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i ramę stereotaktyczną kręgosłupa przed rozpoczęciem operacji. Na przykład wysterylizuj narzędzia w autoklawie w temperaturze 134 °C. Użyj świeżego zestawu wysterylizowanych narzędzi dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc łapę, aby sprawdzić odruch wycofania lub dotykając rogówki w przypadku odruchu powiekowego.
	<ol>
		<li>W przypadku dorosłych szczurów stosujących znieczulenie wziewne, takie jak izofluran, należy użyć 4% izofluranu w 2,0 l/min tlenu do indukcji. W celu utrzymania dawki przez cały okres zabiegu należy stosować 2-3% izofluranu w 1,5 l/min tlenu, zmieniając stężenie izofluranu w zależności od wzorca oddychania zwierzęcia, aby uniknąć przedawkowania lub niedodawkowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy zwierzę zostanie wstępnie znieczulone, zapisz przedoperacyjną masę ciała zwierzęcia.</li>
	<li>W przypadku wstrzyknięcia DRG szyjki macicy należy zgolić sierść na szyi od przestrzeni między uszami do dystalnej części łopatki. Zdezynfekuj ogolony obszar środkiem antyseptycznym.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 2 ml soli fizjologicznej w bok zwierzęcia wraz z odpowiednią dawką środka przeciwbólowego (np. 5 mg/kg karprofenu) i antybiotyku (np. 5 mg/kg enrofloksacyny).</li>
	<li>Nałóż maść do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.</li>
	<li>Przystąp do operacji na stereotaktycznej ramie kręgosłupa z poduszką grzewczą w temperaturze 37 °C umieszczoną pod zwierzęciem.</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie DRG i wykonanie uszkodzenia grzbietowego korzenia
UWAGA: To jest niezwykle delikatna operacja. Wskazane jest, aby najpierw poćwiczyć na kilku martwych zwierzętach, aby zapoznać się z anatomią przed przejściem do chirurgii na żywych zwierzętach.
<ol>
	<li>Zlokalizuj widoczne wyrostki kolczyste C2 i T2 na skórze. Wykonaj nacięcie skóry między wyrostkami kolczystymi C2 i T2 za pomocą ostrza skalpela nr 10 (po otwarciu skóry na pierwszej warstwie mięśni powinna być widoczna biała, włóknista linia środkowa; pierwsza warstwa mięśnia ma "galaretowatą" teksturę).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie podobnej wielkości na pierwszej warstwie mięśnia wzdłuż białej linii środkowej za pomocą ostrza skalpela. Nie wychodź poza wydatny wyrostek kolczysty T2, ponieważ w pobliżu znajduje się główna gałąź tętnicza z aorty zstępującej. 
	UWAGA: Obfite krwawienie może wystąpić w dowolnym miejscu od tego kroku. Zawsze tamuj krwawienie i usuwaj krew za pomocą wysterylizowanych patyczków kosmetycznych lub wchłanialnych gąbek chirurgicznych, aby umożliwić wyraźną wizualizację przez cały czas. Postępowanie "na ślepo" może skutkować niepożądanym uszkodzeniem rdzenia kręgowego, DRG lub korzenia grzbietowego, prowadząc do nieoczekiwanych działań niepożądanych u zwierzęcia w późniejszym czasie.</li>
	<li>Wycofaj pierwszą warstwę mięśni za pomocą dwóch retraktorów, jednego umieszczonego rostralnie, a drugiego doogonowo; druga warstwa mięśnia, o wyglądzie prążkowanym, powinna być widoczna.</li>
	<li>Zlokalizuj linię środkową drugiej warstwy mięśni (gdzie można zaobserwować dwa podłużne mięśnie połączone cienką, błoniastą tkanką). Wypreparuj tkankę błoniastą za pomocą mikronożyczek, aby oddzielić dwa mięśnie podłużne. Jeśli to możliwe, unikaj używania ostrza skalpela, ponieważ może to spowodować niepotrzebne uszkodzenie mięśni i krwawienie.</li>
	<li>Wyreguluj odpowiednio zwijacze, aby odsłonić trzecią warstwę cienkiego mięśnia pokrywającego kręgosłup. Wyrostki kolczyste można wyczuć, lekko dotykając kleszczami trzeciej warstwy mięśni.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie na trzeciej warstwie mięśnia za pomocą mikronożyczek i delikatnie zeskrob mięsień z kości za pomocą kirety lub skalpela w bok, aby wyraźnie odsłonić kręgi. W razie potrzeby odetnij część mięśnia lub ścięgna, aby ułatwić laminektomię.</li>
	<li>Aby odsłonić lewe DRG C5 - C8, wykonaj lewą hemi-laminektomię na kręgach C4 - T1, ostrożnie usuwając część blaszki i szypułki za pomocą pary cienkich rongeurs. DRG znajduje się w pobliżu otworu poprzecznego kręgów. 
	UWAGA: Kręgi C3 - C7 nie mają wydatnego wyrostka kolczystego. C5 DRG znajduje się między kręgami C4 i C5, C6 DRG znajduje się między kręgami C5 i C6 i tak dalej, podczas gdy C8 DRG znajduje się między kręgami C7 i T1. Nie ma kręgu C8, pomimo obecności C8 DRG i segmentu rdzenia kręgowego C8.</li>
	<li>Po wystawieniu wystarczającej ilości DRG do wstrzyknięcia, należy przygotować strzykawkę, umieszczając wypełnioną wirusem mikrolitrową strzykawkę wyposażoną w specjalnie wykonaną, igłę o rozmiarze 33 na stereotaktycznym uchwycie strzykawki. Przed wstrzyknięciem należy użyć igły ze skosem w rozmiarze 30, aby wykonać mały powierzchowny otwór na każdym z docelowych DRG, aby pomóc w wprowadzeniu igły do wstrzykiwań.</li>
	<li>Włóż igłę o rozmiarze 33 do środka DRG, delikatnie obracając pokrętła, aby dostosować współrzędne stereotaktyczne. Nie należy nadmiernie wkładać igły, ponieważ może to spowodować wyciek płynu z brzusznej strony DRG. W przypadku wystąpienia wycieku należy natychmiast wyregulować położenie igły. 
	UWAGA: Numeryczne współrzędne stereotaktyczne nie są używane; Pomocne jest jednak wykorzystanie ramy do przytrzymania igły do wstrzykiwania.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 μl wirusa do każdego DRG w tempie 0,2 μl/min za pomocą pompy strzykawkowej do infuzji. Odczekaj dodatkowe trzy minuty przed wyjęciem igły. Podczas wstrzyknięcia DRG będzie powoli zmieniać kolor, jeśli roztwór wirusa zawiera kolorowy barwnik.</li>
	<li>Aby wykonać jednoczesne zmiażdżenie korzenia grzbietowego C5 - C8, zmiażdż każdy korzeń trzy razy przez 10 sekund za pomocą pary kleszczyków z cienką końcówką (Bonn Micro), całkowicie przeciwlegle do końców kleszczy; w miejscu zgniecenia powinna pojawić się biała linia w tkance. Nie wchodź kleszczami głębiej niż jest to wymagane, ponieważ może to spowodować uszkodzenie korzenia brzusznego.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu i (lub) zmiażdżeniu należy upewnić się, że w miejscu nacięcia nie pozostało krwawienie ani małe kawałki fragmentów kości. Jeśli wolisz, umieść mały kawałek wchłanialnej gąbki chirurgicznej na odsłoniętym rdzeniu kręgowym i DRG.</li>
	<li>Pozwól, aby trzecia warstwa mięśnia cofnęła się naturalnie z powrotem na kręgosłup bez szycia. Luźno zszyj dwa mięśnie podłużne na drugiej warstwie (≈ 3 szwy przerywane) wchłanialnym materiałem szwowym 6-0. Zszyj pierwszą warstwę mięśnia (≈ 5 szwów przerywanych) wchłanialnym materiałem szewnym 6-0.</li>
	<li>Zszyj skórę wchłanialnym materiałem szwowym 5-0 (≈ 10 szwów przerywanych). 
	UWAGA: Upewnij się, że szwy nie są zbyt ciasne. Wybrzuszenie skóry jest oznaką nadmiernego napięcia i może powodować dyskomfort u zwierzęcia.</li>
	<li>Jeśli podczas operacji wystąpiło obfite krwawienie, wstrzyknij podskórnie 1-2 ml soli fizjologicznej, aby uzupełnić utratę płynów od zwierzęcia, zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
	<li>Zapewnij jadalny żel nawilżający i pozwól zwierzęciu w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu, wykonując regularne monitorowanie przez co najmniej 1 godzinę przed powrotem zwierzęcia do obszaru gospodarstwa.</li>
	<li>Trzymaj zwierzę przez co najmniej 3 tygodnie, aby uzyskać optymalną ekspresję transgenu w celu oceny regeneracji aksonów czuciowych.</li>
</ol>
5. Wykonywanie opieki pooperacyjnej nad zwierzęciem
<ol>
	<li>Zapewnij zwierzęciu zacier spożywczy i miękką bawełnianą ściółkę w pierwszym tygodniu po operacji. W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki leków przeciwbólowych i antybiotyków, aby pomóc w powrocie do zdrowia, zgodnie z lokalnymi/krajowymi przepisami i zaleceniami weterynaryjnymi.</li>
	<li>Usuń szwy na skórze po 7 - 10 dniach. 
	UWAGA: Częste działania niepożądane operacji obejmują tworzenie się surowicy lub krwiaka w miejscu nacięcia, ślady zadrapań na skórze spowodowane swędzeniem spowodowanym wewnętrznymi wchłanialnymi szwami, subtelne deficyty czucia lub lokomocji oraz oznaki samookaleczenia na pozbawionej obezwładnienia łapie po urazie zmiażdżenia korzenia grzbietowego. W przypadku jakichkolwiek problemów związanych z dobrostanem, które są znacznie poważniejsze niż oczekiwano, należy natychmiast zasięgnąć porady lekarza weterynarii.</li>
</ol>
6. Wykonywanie iniekcji CTB w kierunku następczym w celu śledzenia aksonów
UWAGA: Zaleca się wykonanie śledzenia aksonów podjednostki B toksyny (CTB) na tydzień przed pobraniem tkanki.
<ol>
	<li>Przygotuj 1% roztwór CTB zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Opcjonalnie: Dodaj 1% kolorowego barwnika do roztworu, aby ułatwić wizualizację późniejszej iniekcji. Bardzo delikatnie wymieszaj roztwór.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę (patrz krok 3.2.1) i ustabilizować lewą przednią łapę, przyklejając kończynę do stołu.</li>
	<li>Ręcznie i powoli wstrzyknąć 1 μl 1% CTB podskórnie w środek nagiej opuszki stopy i czterech cyfr za pomocą mikrolitrowej strzykawki wyposażonej w specjalnie wykonaną krótką igłę o rozmiarze 33. 
	UWAGA: Przed wstrzyknięciem warto najpierw użyć igły ze skosem o rozmiarze 30, aby zrobić mały powierzchowny otwór na skórze, który pomaga w wprowadzeniu igły do wstrzykiwań.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu przed powrotem zwierzęcia do obszaru przetrzymywania.</li>
</ol>
7. Zbieranie tkanek
<ol>
	<li>Aby pobrać wstrzyknięty wirus DRG i rdzeń kręgowy do immunohistochemii, należy podać nadmierną dawkę środka znieczulającego i przezsercowo perfuzjować zwierzę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie zimnym 4% paraformaldehydem. Ostrożnie wykonaj pełną laminektomię kręgosłupa, aby zebrać utrwaloną tkankę pod mikroskopem. Kontynuuj przygotowanie, cięcie i przetwarzanie tkanek zgodnie z wymaganiami do analizy4,5,6. 
	UWAGA: Odzyskane miejsce nacięcia powinno być widoczne, co widać po obecności tkanki bliznowatej.</li>
	<li>Alternatywnie, aby zebrać wstrzyknięty wirus DRG do hodowli in vitro, należy złożyć zwierzę w ofierze w sposób humanitarny za pomocą zatwierdzonej metody, takiej jak rosnące stężenie dwutlenku węgla. Ostrożnie przeanalizuj DRG pod mikroskopem, zapewniając warunki aseptyki, gdy tylko jest to możliwe. Kontynuuj hodowlę tkankową zgodnie z potrzebami4,5,6,10.</li>
</ol>

<ol><li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li>
<li>Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rat+forepaw+function+in+two+models+of+cervical+dorsal+root+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury.</a> J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Cheah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+Activated+Integrin+Promotes+Long-Distance+Sensory+Axon+Regeneration+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord.</a> J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).</li>
<li>Andrews, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha9+integrin+promotes+neurite+outgrowth+on+tenascin-C+and+enhances+sensory+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration.</a> J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).</li>
<li>Tan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-1+enhances+axon+growth+on+inhibitory+chondroitin+sulfate+proteoglycans+and+promotes+sensory+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration.</a> J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Mason, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+AAV+serotypes+for+gene+delivery+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons.</a> Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).</li>
<li>Hermens, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+by+iodixanol+gradient+ultracentrifugation+allows+rapid+and+reproducible+preparation+of+vector+stocks+for+gene+transfer+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).</li>
<li>Kappagantula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu3+sialidase-mediated+ganglioside+conversion+is+necessary+for+axon+regeneration+and+is+blocked+in+CNS+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons.</a> J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).</li>
<li>Alto, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+facilitates+axonal+regeneration+and+synapse+formation+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).</li>
<li>Bonner, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafted+neural+progenitors+integrate+and+restore+synaptic+connectivity+across+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord.</a> J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+restoration+of+sensory+function+by+immediate+or+delayed+systemic+artemin+after+dorsal+root+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury.</a> Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).</li>
<li>Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemin+promotes+functional+long-distance+axonal+regeneration+to+the+brainstem+after+dorsal+root+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Front Mol Neurosci. 8, 36(2015).</li>
<li>Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+intraperitoneal+or+intravenous+injections+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+8+transduce+dorsal+root+ganglia+and+lower+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons.</a> Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).</li>
<li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+adeno-associated+virus+mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31(2010).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+novel+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vector+that+crosses+the+seizure-compromised+blood-brain+barrier+%28BBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB).</a> Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).</li>
<li>Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ATF3+or+the+combination+of+ATF3%2C+c-Jun%2C+STAT3+and+Smad1+promotes+regeneration+of+the+central+axon+branch+of+sensory+neurons+but+without+synergistic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects.</a> Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).</li>
</ol>

James Fawcett jest płatnym konsultantem w firmach Acorda Therapeutics i Novartis.

W tym artykule przedstawiamy przewodnik krok po kroku, jak wykonać wstrzyknięcie DRG i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego w dolnej części rdzenia kręgowego szyjnego dorosłego szczura. Ponieważ jest to niezwykle inwazyjna i delikatna operacja, zdecydowanie zalecamy, aby wszyscy potencjalni użytkownicy przeszli odpowiednie szkolenie i praktykę przed przejściem do chirurgii na żywych zwierzętach. Użytkownicy powinni być zaznajomieni nie tylko z anatomią rdzenia kręgowego, ale także z otaczającymi tkankami mięśniowymi, s...

Osiągnięcie regeneracji aksonów po urazie układu nerwowego jest trudnym zadaniem1. Aby zbadać niepowodzenie regeneracji aksonów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), naukowcy wykorzystali mnóstwo modeli uszkodzeń nerwów. Ponieważ regiony OUN różnią się od siebie, ważne jest, aby do badania regeneracji aksonów używać anatomicznie odpowiedniego modelu. Korzystając z odpowiedniego modelu, naukowcy mogą sformułować konkretne leczenie w oparciu o ciężkość urazu, rodzaj komórek neuronalnych będących przedmiotem zainteresowania i pożądany odcinek kręgosłupa do oceny regeneracji, w przeciwieństwie do strategii leczenia "jeden do wszystkich".
W urazie rdzenia kręgowego, na przykład, najbardziej wyniszczające objawy wynikają z utraty czucia i lokomocji. Utrata czucia jest spowodowana uszkodzeniem wstępujących ścieżek czuciowych, podczas gdy utrata lokomocji jest spowodowana uszkodzeniem zstępujących ścieżek motorycznych. Ze względu na różnice komórkowe i anatomiczne między tymi dwoma szlakami, wiele badań nad regeneracją aksonów koncentruje się tylko na jednym lub drugim szlaku, z uzasadnieniem, że pomyślne odzyskanie któregokolwiek z nich przyniosłoby ogromne korzyści pacjentom. W tym artykule przedstawiamy protokół, który wykorzystuje bezpośrednie wstrzyknięcie do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i jednoczesne zmiażdżenie korzenia grzbietowego w dolnej części rdzenia kręgowego szyjnego dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych.
Neurony czuciowe DRG są odpowiedzialne za przekazywanie informacji sensorycznych, takich jak wrażenia dotykowe i ból, z peryferii do OUN. Długie wypustki aksonalne neuronów czuciowych w rdzeniu kręgowym służą jako dobry model do badania regeneracji aksonów na duże odległości. Ponadto, ponieważ gryzonie mogą przetrwać uszkodzenie szlaku czuciowego, takie jak zmiażdżenie korzenia grzbietowego, przy minimalnych komplikacjach związanych z dobrostanem, naukowcy mogą badać regenerację aksonów OUN bez konieczności całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Wykazano, że poczwórne zmiażdżenie korzenia grzbietowego C5 - C8 (poziom szyjki macicy 5 - 8) jest użytecznym modelem deaferencji przedniej łapy2. Dodatkowo, uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego stanowi "czystszy" model do badania regeneracji aksonów niż bezpośredni uraz rdzenia kręgowego, ponieważ nie jest skomplikowany przez inne czynniki, takie jak tworzenie się blizn glejowych.
Wykorzystanie wirusowej terapii genowej do przeprogramowania neuronów do stanu regeneracyjnego jest coraz częściej uważane za obiecującą strategię leczenia wielu schorzeń neurologicznych3. Badania wykazały, że zastosowanie wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) przenoszącego transgen białka stymulującego wzrost może zapewnić solidną regenerację aksonów z odzyskiwaniem behawioralnym4,5,6. Pozorna niska patogenność AAV w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej i zdolność do transdukcji niedzielących się komórek, takich jak neurony, sprawiają, że jest to optymalny wektor terapii genowej. Dodatkowo w terapii stosuje się rekombinowaną formę AAV. W tej formie nie jest w stanie zintegrować swojego genomu wirusa z genomem gospodarza7, zmniejszając ryzyko mutagenezy insercyjnej w porównaniu z innymi wektorami wirusowymi, takimi jak lentiwirus. To sprawia, że AAV jest bezpiecznym wyborem do zastosowań w terapii genowej.
Ponieważ DRG zawiera ciała komórkowe neuronów czuciowych, jest to najodpowiedniejszy anatomiczny cel dla podania wirusa do terapii genowej w celu zbadania i/lub promowania regeneracji aksonów czuciowych. W badaniu porównującym różne serotypy AAV i lentiwirusa, wykazano, że serotyp 5 AAV (AAV5) jest najbardziej skuteczny w transdukcji neuronów DRG w ciągu co najmniej 12 tygodni, gdy jest wstrzykiwany bezpośrednio do klasy DRG8. Dodatkowo, AAV może osiągnąć ponad 40% wydajność transdukcji, transdukując wszystkie podtypy neuronów DRG, takie jak neurony neurofilamentowe o dużej średnicy 200 kDa (NF200) dodatnie i peptyd związany z genem kalcytoniny o małej średnicy (CGRP) lub izolektyna b4 (IB4)-dodatnie neurony4,8.
Ponieważ zabieg chirurgiczny polegający na wstrzyknięciu DRG i zranieniu korzenia grzbietowego jest niezwykle inwazyjny i delikatny, wierzymy, że ten artykuł pomoże nowym użytkownikom nauczyć się procedury w bardzo efektywny sposób. W tym artykule przedstawiamy reprezentatywne wyniki uzyskane od dorosłych szczurów cztery tygodnie po wstrzyknięciu wirusa kontrolnego AAV5-GFP (zielone białko fluorescencyjne) do DRG C6 - C7 z jednoczesnym uszkodzeniem korzenia grzbietowego C5 - C8. Model ten jest szczególnie odpowiedni dla badaczy, którzy badają zastosowanie wirusowej terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

<table><tbody><tr><td>Fast Green FCF barwnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>Do wizualizacji bezbarwnego roztworu. Zalecane stężenie: 1%</td></tr><tr><td>Podjednostka B toksyny</td><td>Wykaz Laboratoria biologiczne</td><td>104</td><td>Do śledzenia aksonów w następstwie choroby. Zalecane stężenie: 1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>Znieczulenie wziewne (składnik aktywny: izofluran)</td></tr><tr><td>Baytril 2,5% antybiotyk</td><td>Bayer</td><td>05032756093017</td> do wstrzykiwań <td>(substancja czynna: enrofloksacyna). Zalecane przez producenta dawkowanie: 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Carprieve 5,0% w/v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>Środek przeciwbólowy (substancja czynna: karprofen). Zalecane przez producenta dawkowanie: 4 mg/kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>Maść do oczu</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Uchwyt na igły</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeur Zakrzywiony kubek 0,7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro Kleszczyki</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11083-07</td><td>Do wykonywania zgniatania korzeni grzbietowych uraz</td></tr><tr><td>Nożyczki do separacji tkanek</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor Goldstein</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas (proste)</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki pięknejFST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM Wchłanialna gąbka żelatynowa</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>Do tamowania krwawienia</td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa RN701 (10 &mu; L)</td><td></td> Hamilton <td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Igła wymienna na zamówienie (do wtrysku DRG)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 38 mm, typ punktowy 3</td></tr> Igła wymienna na <tr><td>zamówienie (do wstrzykiwań CTB)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 10 mm, typ punktowy 3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump z kontrolerem SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Osiągnięcie regeneracji aksonów po urazie układu nerwowego jest trudnym zadaniem. Ponieważ różne części ośrodkowego układu nerwowego (OUN) różnią się od siebie anatomicznie, ważne jest, aby zidentyfikować odpowiedni model do wykorzystania w badaniu regeneracji aksonów. Korzystając z odpowiedniego modelu, możemy sformułować specyficzne leczenie w oparciu o ciężkość urazu, typ komórek nerwowych będących przedmiotem zainteresowania i pożądany odcinek kręgosłupa do oceny regeneracji. W obrębie szlaku czuciowego neurony DRG są odpowiedzialne za przekazywanie informacji sensorycznych z obwodów do OUN. Przedstawiamy tutaj protokół, który wykorzystuje wstrzyknięcie DRG z wektorem wirusowym i jednoczesne uszkodzenie zmiażdżenia korzenia grzbietowego w dolnej części rdzenia kręgowego szyjnego dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Jak wykazano przy użyciu wirusa kontrolnego, AAV5-GFP, wykazaliśmy skuteczność bezpośredniego wstrzyknięcia DRG w transdukcji neuronów DRG i śledzeniu aksonów czuciowych do rdzenia kręgowego. Pokazujemy również skuteczność urazu zmiażdżenia korzenia grzbietowego w odnerwieniu przedniej łapy jako modelu urazu do oceny regeneracji aksonów. Pomimo wymogu specjalistycznego szkolenia w celu wykonania tej inwazyjnej procedury chirurgicznej, protokół jest elastyczny, a potencjalni użytkownicy mogą modyfikować wiele części, aby dostosować je do swoich wymagań eksperymentalnych. Co ważne, może służyć jako podstawa dla osób poszukujących odpowiedniego modelu zwierzęcego do swoich badań. Wierzymy, że ten artykuł pomoże nowym użytkownikom nauczyć się procedury w bardzo wydajny i skuteczny sposób.

Jako przykład przedstawiono poprzeczny przekrój rdzenia kręgowego z dołączonym zwojem korzeni grzbietowych (DRG), aby wykazać skuteczność tego protokołu w transdukcji neuronów DRG i śledzeniu aksonów sensorycznych w rdzeniu kręgowym cztery tygodnie po wstrzyknięciu wirusa kontrolnego, AAV5-GFP, bezpośrednio do DRG odcinka C7, bez powodowania urazu zgniatości korzenia grzbietowego (Rysunek 1A). GFP wykazują aksony zarówno w słupach tylnych, jak i w rogach tylnych rdzenia k...

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Celem tego podejścia chirurgicznego jest bezpośrednie zastosowanie terapii na poziomie ciała komórki neuronalnej oraz ocena regeneracji aksonów po interwencji terapeutycznej, bez konieczności wykonywania bardziej niszczącej zmiany w obrębie ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji aksonów, takie jak: czy aksony poddane leczeniu terapeutycznemu mogą regenerować się w rdzeniu kręgowym i potencjalnie osiągnąć cele w pniu mózgu? Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania regeneracji aksonów w OUN bez konieczności bezpośredniego uszkadzania rdzenia kręgowego.Zmniejsza to liczbę powikłań pooperacyjnych i poprawia dobrostan zwierząt. Należy rozpocząć od prawidłowego znieczulenia zwierzęcia. Potwierdzenie poziomu znieczulenia chirurgicznego przeprowadza się poprzez sprawdzenie braku reakcji na uciśnięcie palca stopy.Następnie zważ zwierzę i zapisz masę przedoperacyjną. W przypadku chirurgicznego wstrzyknięcia do zwoju korzeniowego tylnego (DRG), ogol sierść na szyi od miejsca między uszami do obszaru tuż poniżej łopatek. Zdezynfekuj ogolony obszar produktem antyseptycznym.Wstrzyknij dwa mililitry soli fizjologicznej

dorsal-root-ganglion-injection-dorsal-root-crush-injury-as-model-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonów. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji specyficznych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacji epigenetycznych histonów i DNA, które są istotne dla regeneracji uszkodzonych aksonów zarówno w obwodowym, jak i ośrodkowym układzie nerwowym.

Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

W niniejszym raporcie opisujemy metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy. Metoda ta wykorzystuje powszechnie dostępne kleszczyki hemostatyczne i pozwala w prosty oraz powtarzalny sposób uzyskać całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisujemy metodę przygotowania preparatów całych mięśni, odpowiednich do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.

Powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Źródło: Li, Q., et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje proces regeneracji aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia. Izolowany nerw jest utrwalony i przygotowany do obrazowania, a białka fluorescencyjne ulegają ekspresji w neuronach w celu wizualizacji wzrostu aksonów. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego śledzi się regenerację aksonów od miejsca urazu, aby ocenić zakres...

Regeneracja aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia

Źródło: Cheah, M., et al. Iniekcja ganglionu korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych. J. Vis. Exp. (2017). Ten film pokazuje krok po kroku procedurę wstrzykiwania zawiesiny wirusa do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i wywoływania kontrolowanego uszkodzenia aksonów poprzez zmiażdżenie korzenia grzbietowego u znieczulonego szczura. Protokół obejmuje odsłonięcie DRG, dostarczenie wektora wirusowego stymulującego wzrost w celu...

Modelowanie regeneracji aksonów czuciowych u szczura za pomocą iniekcji zwoju korzenia grzbietowego i uszkodzenia zmiażdżenia korzenia grzbietowego

Źródło: Li, Q. et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje transfekcję neuronów DRG myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu zbadania regeneracji aksonów. Przedstawiono w nim etapy dostarczania konstruktów kwasu nukleinowego do neuronów DRG, indukowania uszkodzenia nerwu kulszowego i oceny regeneracji aksonów.

Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Poznaj metodę iniekcji zwoju korzenia grzbietowego i urazu zmiażdżenia w szczurach do badania regeneracji aksonów czuciowych. Technika umożliwia ocenę terapii genowej bez bezpośredniego uszkodzenia rdzenia kręgowego.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Przeglądaj więcej filmów