Name: Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj analizę pojedynczych cząsteczek uszkodzeń DNA wywołanych laserem w celu badania odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia genomu. Ta metoda umożliwia bezpośrednie obrazowanie zmian w DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) oraz Fanconi Anemia Research Fund.

1. Przygotowanie Dig-TMP
<ol>
	<li>Zmieszać 50 mg (0,18 mmol) 4'-chlorometylo-4,5',8-trimetylopsoralenu i 590 mg (2,7 mmol) 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminy w suchej kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml pod azotem. Dodaj 10 ml toluenu i odłączaj przez 12 godzin. Usunąć rozpuszczalnik z wyparki obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.
	<ol>
		<li>Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem na żelu krzemionkowym. Eluować kolumnę chloroformem, metanolem i 28% roztworem amoniaku (9:1:0,5). Odparować rozpuszczalnik w wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem i odzyskać czystą 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioksatrydekę)]aminometylo-4,5',8-trimetylopsoralen w postaci jasnożółtej lepkiej cieczy.</li>
		<li>Zmieszać 5,5 mg (0,012 mmol) 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioksatrydeki)]aminometylo-4,5',8-trimetylopsoralenu z 5 mg (0,008 mmol) estru digoksygeniny NHS w suchej kolbie okrągłodennej pod azotem. Dodać 0,5 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) i 3,4 μl trimetyloaminy i mieszać w temperaturze 50 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik z wyparki obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.</li>
		<li>Rozpuścić pozostałość w minimalnej ilości dichlorometanu. Nanieść roztwór w 2 μl punktowo poziomo na dno preparatywnej płytki cienkowarstwowej z żelem krzemionkowym jako fazą stacjonarną. Uruchomić preparatywną TLC w chloroformie: metanol: 28% wodorotlenek amonu (8:1:0,1).</li>
		<li>Zamaskuj płytkę z wyjątkiem pionowych krawędzi i zidentyfikuj pasmo produktu za pomocą lampy UV o krótkiej długości fali 254 nm. Zeskrobać produkt z płytki szpatułką i wyizolować czysty produkt za pomocą mieszaniny chloroformu: metanolu: 28% wodorotlenku amonu (8:1:0,1).</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalniki z wyparki obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozpuść pozostałe granulki w 1 ml 50% EtOH:H2O, rozlej do 50 μl porcji w probówkach 1,5 ml (~20 podwielokrotności) i wysusz w parowniku odśrodkowym, aż cały rozpuszczalnik odparuje (~3 h).</li>
		<li>Każdą podwielokrotność należy ponownie rozpuścić w 200 μl 50% EtOH:H2O i ponownie wysuszyć w wyparce odśrodkowej. Każdą podwielokrotność rozpuścić ponownie w 200 μl 50% EtOH:H2O, wysuszyć w parowniku odśrodkowym i przechowywać granulki w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed użyciem rozpuścić osad w 50 μl 50% EtOH:H2O. Przygotować rozpuszczony Dig-TMP wH2Orozcieńczyć w stosunku 1:100 i zmierzyć OD przy 250 nm. Współczynnik ekstynkcji Dig-TMP wynosi 25 000. Roztwór jest stabilny przez około miesiąc, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Przed każdym użyciem sprawdzić stężenie, mierząc OD przy 250 nm.
	<ol>
		<li>Obliczać stężenie zapasów: Abs x 100 x106/25 000 = Stężenie (w μM). Zazwyczaj roztwór podstawowy ma około 3 mM. Ważne jest, aby mieścić się w tym zakresie, aby zminimalizować objętość EtOH dodawanego do pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Laserowo zlokalizowane ICL Dig-TMP
<ol>
	<li>Wykonaj lokalizację laserową za pomocą mikroskopu konfokalnego z laserem azotowym SRS (337 nm) przepompowanym przez komórkę barwnikową emitującą linię 365 nm i wyzwalającą impulsy 3 ns o częstotliwości 10 Hz, o mocy 0,7 nW.</li>
	<li>Wykonaj pionowy znak na boku naczynia do hodowli komórkowych ze szklanym dnem o średnicy 35 mm za pomocą pisaka. Zdrap krzyż na środku szklanki na powierzchni kultury diamentowym pisakiem tak, aby pasek z boku naczynia znajdował się na górze jednego ramienia krzyża. Krzyż jest zaznaczony na powierzchni wzrostu szkła tak, aby ono i komórki znajdowały się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.</li>
	<li>Wysterylizuj płytkę po znakowaniu płukaniem 70% EtOH. Wysuszyć przed poszyciem komórek.</li>
	<li>Komórki płytkowe (standardowe szczepy laboratoryjne, takie jak HeLa lub U2OS) w krzyżówkach oznaczonych na szalkach hodowlanych jeden lub dwa dni wcześniej. Komórka powinna być aktywnie dzieląca się i zlewać się w 50-70% w dniu eksperymentu. Inkubować przez 24 godziny z 1 μM 5-chloro-2-deoksyurydyną (CldU) w celu równomiernego znakowania DNA.</li>
	<li>Dodać Dig-TMP w 50% EtOH:H2Odo pożywki do hodowli komórkowej do końcowego stężenia 20 μM. Doprowadzić pożywkę do 37 °C. Zmienić pożywkę na komórkach i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie Dig-TMP.</li>
	<li>Podczas inkubacji komórek ustal współrzędne x/y pola widzenia, w którym laser jest aktywny. Postępuj zgodnie z procedurą kalibracji producenta, w której laser jest kierowany przez oprogramowanie w celu wytrawienia lustrzanego szkiełka szkiełkowego wzdłuż linii poziomej i ukośnej. Dwie linie wyznaczają granice pola, w którym laser może uderzyć w cel.</li>
	<li>Umieść płytkę w komorze środowiskowej w temperaturze 37 °C z kontrolowanym poziomem CO2 i wilgotnością na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość za pomocą obiektywu olejowego 60X na przecięciu krzyża.</li>
	<li>Skieruj wiązkę lasera 365 nm na zwrot z inwestycji, ustalony przez badacza za pomocą narzędzia do kształtowania w oprogramowaniu, aby utworzyć pasek o wymiarach 3 μm x 0,6 μm. Kontur ROI umieszczany jest za pomocą kursora w jądrach komórek znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie przecięcia krzyża. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej z, aby skierować laser w połowie jądra. Stosować laser w zakresie 350-370 nm. Lasery 405 nm nie mogą indukować wiązań krzyżowych <klasa sup="xref">19. 
	UWAGA: Lokalizujemy ROI w obszarach nukleoplazmatycznych poza jąderkami, które można odróżnić od nukleoplazmy w obrazowaniu z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC).</li>
	<li>Sprawdź ostrość i aktywność lasera, zwiększając ustawienie mocy do poziomu wystarczającego do zniszczenia komórki (komórka ciemnieje, a następnie zniknie). Jest to ważna diagnostyka niezakłóconej ścieżki światła dla lasera przez mikroskop, a następnie przez szkiełko nakrywkowe do komórek.
	<ol>
		<li>Zmniejsz ustawienie mocy do poziomu wystarczającego do aktywacji psoralenu i DDR indukowanego przez ICL (należy to określić empirycznie dla każdej kombinacji laser/mikroskop). Użyj ustawienia intensywności lasera (tutaj 1,7%), które nie aktywuje DDR przy braku psoralenu (monitorowanego przez tworzenie γ-H2AX). 
		UWAGA: Jest to ważne ustalenie i ustawienia mogą wymagać regulacji, jeśli źródło lasera lub komponent na ścieżce światła zostanie zmieniony. Śledź akumulację białek naprawczych znakowanych GFP, takich jak XPC lub FAN1, z których oba są szybko rekrutowane (w ciągu kilku sekund) do laserowych pasków psoralenu, ale nie do ROI wystawionego na działanie samego lasera. Niektóre białka DDR pojawiają się w ciągu kilku sekund, podczas gdy w innych może być wymagane kilka minut. Konieczne jest wykonanie oznaczeń przebiegu czasowego dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zauważamy również, że w komórkach, które nie były wystawione na działanie lasera, nie ma pasków reagujących białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po tym, jak wszystkie komórki w polu zostaną namierzone, przenieś płytkę do nowego pola, trzymając się blisko przecięcia krzyża.</li>
	<li>W eksperymentach mających na celu określenie rozkładu odległości między zmianami należy naświetlić komórki laserem w 20-25 polach (4-5 komórek/pole) wokół przecięcia. W celu analizy wzorców replikacji w pobliżu zlokalizowanych ICL, należy inkubować komórki z 10 μM 5-Jodo-2-deoksyurydyną (IdU) po wypaleniu laserowym. 
	UWAGA: Czas inkubacji z IdU jest nieco arbitralny. Użyliśmy tak krótkich, jak 20 minut i tak długich, jak 60 minut (patrz poniżej). Dłuższe impulsy (kilka godzin) często powodują łączenie się wielu torów replikacji, tracąc w ten sposób możliwość obrazowania postępu pojedynczych rozwidleń. W niektórych eksperymentach ces są znakowane CldU przez 24 godziny w celu równomiernego znakowania DNA przed ekspozycją na Dig-TMP, a następnie znakowaniem impulsowym dróg replikacji.</li>
</ol>
3. Pobieranie komórek i rozciąganie włókien DNA
<ol>
	<li>Zdjąć płytkę ze sceny, usunąć pożywkę i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń roztwór PBS. Umieść 10 μl kropli dostępnego w handlu roztworu trypsyny/EDTA na przecięciu krzyża pośrodku powierzchni szkła.</li>
	<li>Inkubować przez 3-4 minuty w temperaturze pokojowej (RT), a następnie pobrać roztwór trypsyny z oderwanymi komórkami do końcówki pipety. Nie ma potrzeby neutralizowania trypsyny.</li>
	<li>Umieść kroplę trypsyny/EDTA z komórkami na jednym końcu szkiełka mikroskopowego ze szkła silanizowanego. Poddać komórki lizie i uwolnić DNA przez dodanie 10 μl 0,5% roztworu SDS i inkubować przez 3-4 minuty w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając końcówką pipety, pozwalając na wyschnięcie obwodu basenu.</li>
	<li>Przechyl suwak o 20º i pozwól, aby płyn spłynął do końca. Włókna DNA są rozciągane/rozciągane przez siły hydrodynamiczne przepływającej cieczy. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu (~10 min) i utrwal w 3:1 metanolu/kwasie octowym na 10 minut. Wyjmij szkiełka z roztworu utrwalającego i ponownie wysusz na powietrzu. W tym momencie można je przechowywać przez czas nieokreślony w 70% EtOH w temperaturze -20 °C. Po usunięciu z 70 % EtOH pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przed następnym krokiem.</li>
	<li>Umyj szkiełka w PBS, a następnie denaturuj w 2,5 M HCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zabieg ten oczyszcza DNA, dzięki czemu włączone chlorowcowane zasady nukleinowe są dostępne dla przeciwciał.</li>
	<li>Neutralizować szkiełka w 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Prać dwukrotnie w PBS/0,5% Tween-20 (PBST) przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Szkiełka blokowe z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 10% surowicą kozią w PBS. Delikatnie przykryj szkiełka parafilmem, aby równomiernie rozprowadzić roztwór blokujący na szkiełku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odmierzyć 100 μl rozcieńczenia 1:200 w roztworze blokującym szczurzego przeciwciała pierwszorzędowego anty-bromodeoksyurydyny (specyficznie wykrywającego CldU) do każdego szkiełka. Delikatnie przykryć szkiełka parafilmem, aby równomiernie rozprowadzić rozcieńczenie na szkiełku i inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć parafilm i umyć szkiełka trzy razy w PBST przez 5 minut każde.</li>
	<li>Na każde szkiełko odmierzyć 100 μl rozcieńczonego (1:100) koziego preparatu przeciw szczurom Alexa Fluor 647 w roztworze blokującym. Delikatnie przykryj szkiełka parafilmem i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzy razy w PBST przez 5 minut każde.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl rozcieńczonej (1:40) mysiej anty-bromodeoksyurydyny (wykrywa ldU i CldU. Ta podwójna specyficzność wymaga blokowania CldU przez szczurze przeciwciało pierwszorzędowe anty BrdU w poprzedniej inkubacji) i królicze przeciwciało anty-DIG (1:200) w roztworze blokującym do każdego szkiełka. Preparaty należy delikatnie przykryć parafilmem i inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Preparaty należy myć trzykrotnie w PBST przez 5 minut każde.</li>
	<li>Odmierzyć 100 μl rozcieńczonego (1:100) koziego anty-mysiego Alexa Fluor 488 i c(1:5 000) koziego roztworu anty-króliczego (np. Qdot 655) w roztworze blokującym do każdego szkiełka. Delikatnie przykryj szkiełka parafilmem i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzy razy w PBST przez 5 minut każde.</li>
	<li>Nadmiar PBST odsączyć na ręcznik papierowy. Na każde szkiełko nanieść 50 μl podłoża zapobiegającego blaknięciu i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Przechowywać lub przechowywać nie dłużej niż 48 godzin w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Obrazowanie włókien za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą obiektywu 63X na odwróconym mikroskopie z dołączonym, w pełni zmotoryzowanym kołem filtrów z detekcją FITC, Cy5 i Q Dot 655. Filtr wzbudzenia ma 425 nm, a filtr emisyjny ma 655 nm, przy czym 20 nm jest wyśrodkowane na szczycie emisji 20.</li>
</ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technologia lokalizacji laserowej wymaga użycia przylegających komórek z jądrami, które są widoczne w mikroskopii jasnego pola. Próbowaliśmy przymocować nieprzylegające komórki, takie jak limfocyty pierwotne lub luźno przylegające komórki hodowlane, takie jak AD293, do powierzchni szkła za pomocą preparatów adhezyjnych komórek, takich jak polilizyna lub kolagen, lub bardziej złożonych mieszanin. Chociaż te zabiegi mogą wiązać komórki z powierzchnią, okazuje się, że na ogół pozostają zaokrąglone, co bardzo utrudnia skupie...

DNA jest nieustannie atakowane przez czynniki egzogenne, takie jak promieniowanie, światło ultrafioletowe, toksyny środowiskowe, produkty spalania, itp. Dodatkowo, jest również atakowane przez endogenne rodniki wytwarzane przez metabolizm oksydacyjny. Wszystko to może chemicznie lub fizycznie zakłócić integralność DNA 1. Perturbacje w genomie mogą aktywować odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), kaskadę rekrutacji i modyfikacji potranslacyjnej z setkami, jeśli nie tysiącami, białek i mikroRNA zaangażowanych w naprawę zmian, regulację cyklu komórkowego, apoptozę, starzenie się i szlaki zapalne 2.
Większość naszych informacji na temat DDR pochodzi z badań z DSB. Wynika to w dużej mierze z dostępności technologii wprowadzania pęknięć, w tym pęknięć specyficznych dla sekwencji, w genomowym DNA w żywych komórkach 3. Ponadto skłonność do pęknięć w celu indukowania ognisk białek DDR, które mogą być wykazywane przez immunofluorescencję, była bardzo pomocna w identyfikacji kinetyki i wymagań reagujących białek. Jedna z kluczowych technologii do badania DDR została wprowadzona przez Bonnera i współpracowników, którzy wykorzystali wiązkę laserową do skierowania paska DSB w "Regionie Zainteresowania" (ROI) w jądrach żywych komórek 4. W efekcie stworzyli długotrwałe ognisko, w którym białka DDR można było zidentyfikować za pomocą immunofluorescencji. Zostało to zilustrowane przez demonstrację silnego paska fosforylowanego histonu H2AX (γ-H2AX) w komórkach naświetlonych laserem. Od tego czasu podejście laserowe zostało wykorzystane w licznych badaniach DDR indukowanych przez DSB. Chociaż jest potężny i popularny, a także źródłem dramatycznych obrazów immunofluorescencyjnych, należy zauważyć, że w większości eksperymentów intensywność lasera jest dostosowywana tak, aby uzyskać obserwowalne wyniki, bez obawy o tożsamość zmiany, gęstość lub odstępy. Rzeczywiście, dokonanie tych szacunków może być trudne. W związku z tym są one w dużej mierze ignorowane, pomimo mnogości zmian wprowadzonych do DNA przez lasery 5. Przyczynia się to do wielu sprzeczności w literaturze 6.
W przeciwieństwie do DSB, większość chemicznych modyfikacji DNA nie stymuluje tworzenia dyskretnych ognisk białek DDR. Jest to ważne w świetle naszej obecnej wiedzy na temat częstości występowania zmian chorobowych. Szacuje się, że komórki ludzkie w hodowli generują aż 50 DSB na cykl komórkowy, powstający głównie podczas fazy S 7,8,9. Mniej powstaje w komórkach nieproliferujących. Kontrastuje to z liczbą strat lub modyfikacji zasad nukleotydowych, które wynoszą dziesiątki tysięcy na komórkę/dzień 1,10. W związku z tym najwięcej wiemy o DDR wywołanym zdarzeniami, które są stosunkowo rzadkie, a znacznie mniej o tych wywołanych zmianami zniekształcającymi helisę, które w sumie występują znacznie częściej.
Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące odpowiedzi komórkowej na kowalencyjne modyfikacje genomowego DNA, chcieliśmy pracować z helisą zniekształcającą addukt DNA, który miał wrodzoną aktywność indukcyjną DDR. Ponadto, aby ułatwić projektowanie i interpretację eksperymentów, zainteresowała nas struktura, której wprowadzenie może być kontrolowane w odniesieniu do czasu i jest podatne na wizualizację. W związku z tym opracowaliśmy strategię opartą na psoralenie. Psoraleny są dobrze scharakteryzowanymi fotoaktywnymi interkalatorami DNA faworyzującymi miejsca 5' TA:AT. W przeciwieństwie do innych środków sieciujących, takich jak iperyt azotowy i mitomycyna C (MMC), nie reagują one na DNA, chyba że są wystawione na działanie długofalowego światła UV (UVA). Interkalowane cząsteczki reagują z zasadami tyminy na przeciwległych niciach, tworząc spiralne zniekształcające wiązania międzyniciowe (ICL) 11. W przypadku psoralenu trimetylowego stosowanego w naszych eksperymentach większość produktów to ICL, generowanych jest stosunkowo niewiele monoadduktów (mniej niż 10%) 12, a wewnątrzniciowe wiązania krzyżowe między sąsiednimi zasadami na jednej nici nie powstają. Ponieważ są one potężnymi blokami replikacji i transkrypcji, psoralen i inne środki sieciujące, takie jak cis-platyna i MMC, są powszechnie stosowane w chemioterapii. W ten sposób psoralen umożliwił badania, które śledziły aktywację DDR przez strukturę zniekształcającą helisę, a także dostarczył informacji na temat odpowiedzi komórkowej na związek o znaczeniu klinicznym.
Zsyntetyzowaliśmy odczynnik, w którym trimetylowy psoralen był połączony z digoksygeniną (Dig), sterolem roślinnym, którego nie znaleziono w komórkach ssaków i często używanym jako immunotag. Wymóg fotoaktywacji pozwala na lokalizację za pomocą światła laserowego (365 nm) ICL psoralenu w określonym ROI w jądrach żywych komórek. Mogą one być wyświetlane przez immunofluorescencję względem znacznika Dig. Naprawa DNA i białka DDR pojawiły się w paskach zlokalizowanych laserowo ICL 13,14.
DDR aktywowane przez wysokie intensywności lasera używane do produkcji DSB może być spowodowane izolowanymi lub grupowanymi uszkodzeniami 15,16. W związku z tym niepewność co do znaczenia wyników tych eksperymentów dla zmian naturalnie występujących, obecnych w znacznie niższym stężeniu. Aby odpowiedzieć na podobne pytania dotyczące częstości adduktów psoralenu i odstępów w DNA, wykorzystaliśmy technologię włókien DNA 17 i kropki immunokwantowe. Kropki kwantowe są znacznie jaśniejsze niż barwniki fluorescencyjne i nie wybielają się pod wpływem światła. Dlatego są one często używane do obrazowania pojedynczych cząsteczek 18, aplikacji, w której barwniki fluorescencyjne są niewystarczająco jasne. Poszczególne włókna DNA mogą być rozciągane na szkiełkach i mogą być wyświetlane za pomocą immunofluorescencji przeciwko analogom nukleozydów włączonym podczas inkubacji przed pobraniem komórek. Potraktowaliśmy komórki Dig-psoralenem i wystawiliśmy ROI na mikropromieniowanie laserowe. Z komórek przygotowano włókna, a poszczególne addukty Dig-psoralen można było uwidocznić za pomocą kropek immunokwantowych. Wystawienie komórek na działanie analogów nukleozydów przez stosunkowo krótki czas (20-60 minut) pozwala na wyświetlanie dróg replikacji w pobliżu zlokalizowanych laserowo ICL.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiamina</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>Płytki TLC</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolumna Flass 24/40, 100 ml</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem firmy Nikon T2000_E2, wyposażony w zautomatyzowany stolik i komorę kontroli środowiska oraz uchwyt na płytkę</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>z oprogramowaniem Volocity</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>z laserem impulsowym azotu&nbsp;</td></tr><tr><td>komórka barwnikowa</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>barwnik 365</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szklane płytki botomm 1,5 szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 10 mm, niepowlekane</td> Szkiełka mikroskopowe <td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nowa część dostawcza Comer</td><td># 5070</td><td>Nowe prowadnice silanowe</td></tr><tr><td>Mysz przeciwciało anty BrdU (IdU)</td> <td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 na 40</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało anty BrdU (CldU) Abcam</td><td></td> <td>ab6326</td><td>1 na 200 i nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi Dig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 koza anty królicza IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 na 5,000</td></tr><tr><td>AF647- koza anty Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 na 100</td></tr><tr><td>AF488-koza anty mysia IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 na 100</td></tr><tr><td>epifluorescencyjny Zeiss mikroskop A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; z oprogramowaniem Axiovision</td></tr><tr><td>filtr Q-dot 655</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Odpowiedź na uszkodzenia DNA (DDR) została szczegółowo opisana w badaniach pęknięć podwójnej nici (DSB) indukowanych przez laserowe promieniowanie mikrowiązką w żywych komórkach. Modyfikacje kowalencyjnego DNA zniekształcające DDR do helisy, w tym wiązania krzyżowe międzyniciowego DNA (ICL), nie są tak dobrze zdefiniowane. Badaliśmy DDR stymulowany przez ICL, zlokalizowany przez laserową fotoaktywację znakowanych immunologicznie psoralensów w jądrach żywych komórek. Aby odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące dystrybucji adduktów i spotkań z widełkami replikacyjnymi, połączyliśmy lokalizację laserową z dwiema innymi technologiami. Włókna DNA są często używane do wyświetlania postępu widełek replikacyjnych poprzez immunofluorescencję analogów nukleozydów włączonych podczas krótkich impulsów. Kropki immunokwantowe są szeroko stosowane w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek. W nowym podejściu włókna DNA z komórek przenoszących zlokalizowane laserowo ICL są rozprowadzane na szkiełkach mikroskopowych. Oznaczone ICL są wyświetlane z kropkami immunokwantowymi i określane są odległości między zmianami chorobowymi. Kolizje widełek replikacyjnych z ICL mogą być wizualizowane, a różne wzorce spotkań identyfikowane i kwantyfikowane.

Lokalnie naświetlane laserem ICL-e Dig-TMP (Rysunek 1A) mogą być obrazowane za pomocą immunofluorescencji przeciwko znacznikowi Dig powiązanemu z psoralenem. Chociaż laser może być kierowany tak, aby uderzać w obszar o dowolnym kształcie, pasy nie są „naturalnymi” formami w komórkach, dzięki czemu autentyczne sygnały można łatwo odróżnić od artefaktów wynikających z niespecyficznego wiązania przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych. Cecha ta jest pomocna przy stos...

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie analizy pojedynczych cząsteczek w celu określenia rozkładu lokalizowanych laserem wiązań krzyżowych między niciami w genomowym DNA, aby zbadać odpowiedzi komórkowe na wiązania krzyżowe między niciami DNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA dotyczące rozkładu uszkodzeń DNA wprowadzanych za pomocą technologii laserowej, która jest szeroko stosowanym narzędziem eksperymentalnym. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego obrazowania uszkodzeń DNA wprowadzonych do genomowego DNA przez związek aktywowany laserem.Wcześniej nie było to możliwe. Procedurę zaprezentują Julia Gichimu oraz Hima Gali z naszego laboratorium. Przy każdym użyciu lasera celującego ważne jest przeprowadzenie kalibracji przesuwki lustra, aby zweryfikować, czy laser trafia w odpowiednie współrzędne XYZ oraz aby określić obszar pola obrazowania kamery, w którym można ustawić punkt uderzenia lasera.Znajdź na preparacie pole, które zostało wcześniej wytrawione. Ustaw czas ekspozycji oraz moc lasera. Następnie wyreguluj ostrość, aby przejść do pobliskiego, niecelowanego pola na szkiełku lustrzanym.Rozpocznij procedurę kalibracji. Oprogramowanie uruchomi laser w celu wytrawienia na szkiełku lustrzanym linii poziomych i ukośnych. Linie te wyznaczają granice pola, w którym laser może uderzyć w komórkę docelową.Wyznacz kilka obszarów zainteresowania, lub ROI, w obrębie pola widzenia i uruchom laser, aby potwierdzić, że celuje on w wybrane obszary i tym samym uderza w odpowiednie współrzędne XYZ. Podczas konfiguracji systemu lasera celującego w mikroskopie należy również przeprowadzić kalibrację biologiczną. Pierwszym krokiem jest określenie minimalnej mocy lasera wymaganej do fotoaktywacji trimetylpsoralenu, lub TMP, indukowania wiązań krzyżowych między niciami oraz wywołania rekrutacji czynnika naprawczego z tagiem GFP, którego kinetyka może zostać uprzednio scharakteryzowana.W tym laboratorium wykorzystuje się linię komórkową U2OS stabilnie transfektowaną plazmidem wykazującym ekspresję GFP fan one. Jak pokazano tutaj, gdy komórki są eksponowane na 6 µM TMP oraz obrazowanie laserowe 1,2% przez 10 minut, analiza sekwencji obrazów w formie wideo potwierdza rekrutację GFP fan one do wyznaczonego ROI. Drugim krokiem jest zweryfikowanie, czy to ustawienie mocy nie wywołuje rekrutacji w przypadku braku związku.Jak pokazano tutaj, gdy komórki są eksponowane na sam laser o mocy 1,2% przez 10 minut i obraz jest wyświetlany jako wideo, nie obserwuje się rekrutacji GFP fan one do wyznaczonego ROI. Po trzecie, ważne jest określenie minimalnego ustawienia mocy, które jest w stanie usunąć komórkę (blow out). Zdolność do usunięcia komórki przy tym ustawieniu mocy powinna być testowana jako rutynowa kalibracja biologiczna każdego dnia, w którym używany jest laser celujący.Ustaw ROI wewnątrz jądra komórkowego, unikając jąderek. Dostrój ostrość. Ustaw moc lasera na 12% i wykonaj impuls.Na koniec, w celu prawidłowego ukierunkowania, niezbędne jest ustawienie płaszczyzny ogniskowania na środku komórki. Aby to zademonstrować, trzy komórki zostaną ukierunkowane na trzech różnych płaszczyznach ogniskowania. Środek komórki.Zbyt wysoko. I zbyt nisko. Trzy minuty po celowaniu generowany jest stos obrazów obejmujący trzy mikrony, aby zbadać rozkład GFP fan one stripe w całej obrazowanej płaszczyźnie ogniskowej.Tylko komórka wycelowana w środkowej części wykazuje jeden pasek GFP w wszystkich płaszczyznach Z. Przed przystąpieniem do lokalizacji laserowej należy przygotować 35 mm szalki hodowlane z dna szklanego do hodowli komórek. Za pomocą pisaka permanentnego należy nanieść pionowy znak na boku każdej szalki.Za pomocą rysika diamentowego wydrap krzyżyk na środku szkła na powierzchni hodowlanej w taki sposób, aby czarny pasek z boku szalki znajdował się na górze jednego z ramion krzyżyka. Krzyżyk należy nanieść na powierzchnię wzrostu szkła, aby on i komórki znajdowały się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Wysiej komórki na wysterylizowane szalki z naniesionym krzyżykiem i inkubuj przez 24 godziny w 1 µM 5-chloro-2'-deoksyurydyny w celu jednorodnego znakowania DNA.W dniu eksperymentu dodać TMP sprzężony z digoksigeniną lub dig TMP w 50% etanolu do pożywki hodowlanej do stężenia końcowego 20 micromolar. Podgrzać pożywkę do 37 degrees Celsius. Wymienić pożywkę w naczyniach hodowlanych na pożywkę zawierającą dig TMP i inkubować w temperaturze 37 degrees Celsius i 5%CO2 przez 30 minut, aby umożliwić równowagowanie dig TMP.Podczas inkubacji komórek przeprowadź kalibrację płytki zwierciadlanej oraz 12% blow out komórki, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Umieść płytkę w komorze środowiskowej na stoliku mikroskopu w temperaturze 37 °C, przy kontrolowanym poziomie CO2 i wilgotności. Ustaw ostrość za pomocą obiektywu olejowego 60X na przecięciu krzyża.Wybierz pierwsze pole docelowe i użyj narzędzia do kształtów, aby wyznaczyć ROI w poszczególnych komórkach znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie przecięcia krzyża. Wybierz obszary nukleoplazmy poza jąderkami. Dostosuj płaszczyznę ogniskowania Z, aby laser był skierowany w połowie wysokości jąder.Następnie ustaw moc na minimalną wartość wymaganą do aktywacji psoralenu w odpowiedzi na uszkodzenia DNA indukowane wiązaniami krzyżowymi między niciami. W tym przypadku zastosowano 1,2%. Uruchom laser.Po skierowaniu wiązki na wszystkie komórki w danym polu, przesuń płytkę do nowego pola, pozostając w pobliżu przecięcia krzyża. Powtórz zaprezentowaną procedurę w 12–18 polach, aby objąć łącznie od 80 do 100 komórek. W celu zebrania komórek zdejmij naczynie hodowlane ze stolika.Usunąć medium i przemyć komórki roztworem PBS. Usunąć PBS i nanieść kroplę 10 µL komercyjnego roztworu trypsyny z EDTA na przecięcie krzyża w środku szklanej powierzchni. Inkubować przez trzy do czterech minut w temperaturze pokojowej, a następnie pobrać roztwór trypsyny wraz z ododerwanymi komórkami do końcówki pipety.Nanieś kroplę trypsyny EDTA z komórkami na jeden koniec zylikonyzowanego szkiełka przedmiotowego. Aby zlizować komórki i uwolnić DNA, dodaj 10 µL 5% roztworu SDS i inkubuj przez trzy do czterech minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając końcówką pipety i pozwalając na wyschnięcie obrzeży kropli. Przechyl szkiełko o 20 stopni i pozwól cieczy spłynąć do krawędzi.Siły hydrodynamiczne płynącego cieczy spowodują wydłużenie i rozciągnięcie włókien DNA. Pozostawić preparat do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Zanurzyć preparat w roztworze metanolu i kwasu octowego w stosunku trzy do jednego i utrwalać przez 10 minut.Następnie należy wyjąć preparat z roztworu utrwalającego i ponownie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Na tym etapie preparat można przechowywać bezterminowo w 70% etanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować preparat do detekcji sygnałów dig na włóknach DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy wyjąć preparat z rozciągniętym DNA z roztworu 70% etanolu i pozostawić go do wyschnięcia na powietrzu.Następnie zdenaturuj włókna DNA w chlorku wodoru, a potem przenieś je do naczynia z buforem Tris-HCl o pH 8 w celu neutralizacji. Kolejnym krokiem jest przemycie próbek w PBS. Na koniec zabarw je odpowiednimi przeciwciałami zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.Przedstawiono strukturę trimetylpsoralenu z tagiem dioksygeninowym. Ponadmiędzypasmowe wiązania krzyżowe DNA, czyli ICLs, można wykryć za pomocą immunofluorescencji przeciwko dig TMP. Ten przykład pokazuje komórki z akumulacją znanego markera odpowiedzi na uszkodzenia DNA gamma H2AX, zwizualizowanego na zielono, w obszarach ROI zawierających zlokalizowane laserowo ICLs zwizualizowane na czerwono.Jądro wybarwione DAPI jest koloru niebieskiego. Obraz w świetle jasnym pokazuje komórkę znajdującą się częściowo na oznaczeniu wykonanym piórem diamentowym. Należy zauważyć, że obszary ROI zostały umieszczone poza jąderkami.Aby określić częstotliwość i rozmieszczenie adduktów, komórki inkubowano w 5-chlorodeoksyurydynie przez 24 godziny przed wprowadzeniem ICL. Po zebraniu komórek i rozciągnięciu włókien DNA, sygnały dig wykryto za pomocą aminowych kropek kwantowych wizualizowanych na czerwono, a 5-chlorodeoksyurydynę za pomocą fluorescencji aminowej wizualizowanej na zielono. Analiza sygnałów dig na włóknach wykazała, że odległości między ICL wahają się od mniej niż 10 KB do ponad 160 KB. Nie stwierdzono obecności zgrupowanych adduktów.Postępując zgodnie z tymi wytycznymi, powinno być możliwe rozszerzenie tej metody na inne addukty DNA, takie jak uszkodzenia oksydacyjne, które można zlokalizować za pomocą laserów o odpowiedniej długości fali.

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Opisujemy proces zmiany in situ powierzchni Si (001) potraktowanej HF w stan hydrofilowy lub hydrofobowy poprzez napromieniowanie próbek w komorach mikroprzepływowych wypełnionych roztworem H2O2/H2O (0,01%-0,5%) lub roztworami metanolu za pomocą impulsowego lasera UV o stosunkowo niskiej płynności impulsów.

Selektywna modyfikacja obszaru zwilżalności powierzchni krzemu za pomocą pulsacyjnego naświetlania laserem UV w środowisku ciekłym

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Ten protokół przedstawia metodę wykorzystania wbudowanej dozymetrii rodnikowej i plazmowego źródła światła do przeprowadzenia błyskawicznego śladu białkowego utleniania. Metoda ta zastępuje niebezpieczny laser UV w celu uproszczenia i poprawy odtwarzalności szybkich badań utleniania fotochemicznego białek.

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę efektywnej identyfikacji komórek fazy S do dalszych badań mikroskopowych, takich jak pomiar rekrutacji białka naprawczego DNA za pomocą mikronapromieniowania laserowego.

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

Solidny protokół jest tutaj prezentowany do izolowania granulek neuromelaniny z ludzkiej tkanki pośmiertnej istoty czarnej pars compacta za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ten zmieniony i zoptymalizowany protokół znacznie minimalizuje wymagany czas pobierania próbek, zmniejsza wymaganą ilość próbki oraz usprawnia identyfikację i kwantyfikację białek za pomocą analizy LC-MS/MS.

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Poznaj analizę pojedynczych cząsteczek uszkodzeń DNA wywołanych laserem w celu badania odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia genomu. Ta metoda umożliwia bezpośrednie obrazowanie zmian w DNA.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Przeglądaj więcej filmów