Name: Sparowany układ ściegów i magnesów do formowania mikrostudzienek o zmiennej geometrii wklęsłej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikrostudzienek wklęsłych z wykorzystaniem siły magnetycznej i kulek stalowych w podłożu PDMS. Technika ta umożliwia tworzenie setek mikrostudzienek do trójwymiarowych kultur komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2014R1A1A2057527 i NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. Przygotowanie aluminiowej płyty z otworem przelotowym i tablicy magnetycznej
<ol>
	<li>Przygotuj dwie płyty aluminiowe o wymiarach 50 mm x 50 mm (lub większe). Grubość każdej płytki wynosiła 300 μm, co stanowi połowę średnicy ściegu.</li>
	<li>Uformuj układ otworów przelotowych 30 x 30 na jednej z aluminiowych płyt za pomocą grawerki obrotowej CNC z mikrowiertłem Φ550 μm o prędkości zanurzania 30 mm/s i prędkości wrzeciona 8000 obr./min. Odległość między każdym otworem (od środka do środka) wynosiła 1 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a i <silna klasa="xfig">Rysunek 2a, i).</li>
	<li>Uformuj układ 30 x 30 otworów przelotowych Φ750-μm na drugiej płycie aluminiowej, stosując tę samą procedurę, co opisana w 1.2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a i <silna klasa="xfig">Rysunek 2a, ii).</li>
	<li>Przymocuj dwie płyty do siebie za pomocą taśmy klejącej i uformuj otwory wyrównujące Φ3 mm w każdym z czterech rogów obu aluminiowych płyt.</li>
	<li>Namocz aluminiowe płyty w 15% kwasie siarkowym na 12 godzin, aby wyczyścić ich powierzchnie. Ponieważ cienka warstwa tlenku glinu na powierzchni aluminium sprawia, że jest ono odporne na korozję, średnica otworu i grubość płyty nie zmieniają się w wyniku tej obróbki kwasem.</li>
	<li>Utwórz układ 30 × 30 magnesów neodymowych 1 x 1 x 1 mm (o sile magnetycznej 0,363 N). Upewnij się, że każdy magnes ma biegunowość przeciwną do sąsiedniego. Aby zapobiec pęknięciu lub rozproszeniu układu magnesów, przymocuj aluminiową płytkę o wymiarach 30 x 30 mm do dolnej części układu magnesów za pomocą taśmy dwustronnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2a, iii i wstawka w <silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Proces zalewania koralików
<ol>
	<li>Wyrównaj i ułóż dwie aluminiowe płyty (płyta górna: płyta z otworem 750 μm, płyta dolna: płyta z otworem 550 μm), korzystając z przygotowanych otworów wyrównujących w czterech rogach każdej płyty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1b).</li>
	<li>Zablokuj obie płytki razem, wkładając M3 do otworów wyrównujących, a następnie zabezpiecz nakrętkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1b).</li>
	<li>Ułóż zespół płyty aluminiowej na przygotowanym układzie magnesów (Rysunek 1b, 2b i 2c). Wyrównaj układ magnesów i układ otworów przelotowych w płycie aluminiowej podczas procesu układania w stosy. Następnie użyj taśmy klejącej, aby ustalić położenie układu magnesów.</li>
	<li>Umieść wystarczającą liczbę stalowych koralików SUJ2 Φ600 mm na zespole płyty i manipuluj koralikami za pomocą akrylowej (lub niemetalowej) płytki tak, aby koralik został uwięziony w każdym otworze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1c, 1d i 1e), jednocześnie usuwając nadmiar koralików, które nie utknęły w otworach.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij górną płytę, aby uniknąć niepożądanego rozproszenia i przemieszczenia uwięzionych koralików (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1f).</li>
</ol>
3. Produkcja wklęsłych mikrostudzienek
<ol>
	<li>Przenieś wklęsłą formę mikrostudzienki, wykonaną w krokach od 2.1 do 2.5 powyżej, na szalkę Petriego.</li>
	<li>Wymieszaj monomer polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz zgodnie z instrukcjami producenta19 ze stosunkiem monomeru PDMS do utwardzacza wynoszącym 10:1.</li>
	<li>Odgazować mieszaninę PDMS za pomocą eksykatora i pompy próżniowej w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków uwięzionych w mieszaninie PDMS.</li>
	<li>Wlej mieszaninę PDMS do wklęsłej formy mikrostudzienkowej i ponownie odgazuj, stosując tę samą procedurę, jak opisano w 3.3 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1f).</li>
	<li>Piecz mieszaninę PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny, aby utworzyć podłoże PDMS zatopione w kulkach (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1g).</li>
	<li>Wyjmij utwardzony substrat PDMS z formy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1g). W procesie usuwania spryskaj metanol za pomocą butelki do mycia, aby odłączyć podłoże PDMS od formy.</li>
	<li>Za pomocą magnesu Φ15 mm x 2 mm usuń uwięzione stalowe koraliki z podłoża PDMS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1h). Do tego procesu można użyć dowolnego magnesu, który jest wystarczająco silny, aby wydobyć kulki z podłoża PDMS.</li>
</ol>
4. Kultura sferoidalna
<ol>
	<li>Wytnij wklęsły substrat PDMS z mikrodołkiem za pomocą stempla do biopsji Φ14 mm, który ma być umieszczony w płytce 24-dołkowej w tym badaniu.</li>
	<li>Wysterylizuj otrzymany substrat PDMS Φ14 mm w sterylizatorze autoklawy w temperaturze 121 °C i 15 psi.</li>
	<li>Umieść wysterylizowany substrat PDMS na płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Pokryj cały substrat PDMS 4% (w/v) roztworem pluronicznym F-127 przez noc, aby zapobiec przyczepianiu się komórek do powierzchni mikrostudzienki. Podczas procesu powlekania należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione we wklęsłych mikrostudzienkach za pomocą pipetowania lub użycia myjki ultradźwiękowej.</li>
	<li>Przepłukać roztwór F-127 trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Zasiew: 1 ml roztworu pożywki komórkowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (który zawiera 2 x 106 komórek) na podłożu PDMS. Należy pamiętać, że gęstość wysiewu można zmienić w zależności od docelowego rozmiaru sferoidy i/lub typu komórki docelowej. W tym przypadku wykorzystano komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC).</li>
	<li>Odessać 1 ml pożywki za pomocą pipety 1000 μl, aby usunąć nadmiar komórek, które nie zostały uwięzione w mikrostudzienkach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5% CO2 . W przypadku ASC użytych w naszym badaniu, komórki agregują się do sferoidy w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li>
<li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li>
<li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brave+little+world%3A+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li>
<li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13233-014-2044-7">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li>
<li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol-Animal%22%5BJournal%5D)">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li>
<li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplant%22%5BJournal%5D)">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li>
<li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol-Animal%22%5BJournal%5D)">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li>
<li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13233-012-1202-4">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li>
<li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li>
<li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li>
<li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li>
<li>Corning, D. <a target="_blank" href="null">Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet</a>. , (2008).</li>
<li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li>
<li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra09730k#!divAbstract">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li>
<li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030402613014460">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+advances%22%5BJournal%5D)">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+MAter+Res+A%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li>
<li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Głównym wyzwaniem stojącym przed tą metodą produkcji było bezpieczne zamocowanie koralików w układzie otworów przelotowych w płycie aluminiowej. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystano siłę magnetyczną w postaci układu magnetycznego o wymiarach 30 x 30 w celu bezpiecznego zamocowania koralików, jak pokazano na rysunkach 6 i 7. Gęstość strumienia magnetycznego układu magnesów, który ma przeciwną biegunowość, jest najsilniejsza w środku każdej powierzchni magnesu. Ponieważ siła siły magnet...

Komórki wyhodowane w formie sferoidalnej są bardziej podobne do prawdziwej tkanki w ciele niż dwuwymiarowa hodowla planarna1. Biorąc pod uwagę tę przewagę, zastosowanie sferoidów zostało przyjęte w celu poprawy badań interakcji między komórkami2,3, immuno-activation4, badanie przesiewowe leków5, oraz differentiation6. Ponadto, sferoidy zawierające wiele typów komórek zostały ostatnio zastosowane w organoidach (prawie fizjologicznych tkankach trójwymiarowych (3D)), które są bardzo przydatne do badania rozwoju i chorób człowieka7. Do produkcji sferoidów zastosowano kilka metod. Najprostsza metoda polega na wykorzystaniu nieadhezyjnej powierzchni, tak aby komórki agregowały się ze sobą i tworzyły sferoidy. Szalka Petriego może być traktowana albuminą surowicy bydlęcej, pluronem F-127 lub hydrofobowym polimerem (np. metakrylanem poli 2-hydroksyetylu), aby jej powierzchnia była nieprzywierająca8,9. Metoda spinner-flask to kolejny dobrze znany sposób wytwarzania dużych ilości sferoid10,11. W tej metodzie komórki są utrzymywane w zawiesinie przez mieszanie, aby zapobiec ich przyczepieniu się do podłoża. Zamiast tego pływające komórki agregują się, tworząc sferoidy. Zarówno metoda powierzchni nieadhezyjnej, jak i metoda kolby obrotowej mogą wytwarzać duże ilości sferoid. Podlegają one jednak ograniczeniom, w tym trudnościom w kontrolowaniu wielkości sferoidy, a także śledzeniu i monitorowaniu każdej sferoidy. Jako remedium na takie problemy można zastosować inną metodę produkcji sferoidów, a mianowicie metodę wiszącej kropli12. Polega to na osadzaniu kropli zawiesiny komórkowej na spodniej stronie pokrywki naczynia hodowlanego. Krople te mają zwykle wielkość od 15 do 30 μl i zawierają około 300 do 3000 komórek13. Gdy pokrywka jest odwrócona, krople są utrzymywane na miejscu przez napięcie powierzchniowe. Środowisko mikrograwitacji w każdej kropli koncentruje komórki, które następnie tworzą pojedyncze sferoidy na swobodnej granicy faz ciecz-powietrze. Zaletą metody wiszącej kropli jest to, że zapewnia dobrze kontrolowany rozkład wielkości, a jednocześnie łatwo jest śledzić i monitorować każdą sferoidę w stosunku do metody nieprzywierającej powierzchni i kolby obrotowej. Metoda ta ma jednak jedną wadę, ponieważ masowa produkcja sferoid i sam proces produkcji jest nadmiernie pracochłonny.
Tablica mikrostudzienek to płaska płytka z wieloma mikro-rozmiarowymi dołkami, z których każda ma średnicę od 100 do 1000 μm. Zasada produkcji sferoidów przy użyciu mikrostudzienek jest podobna do tej stosowanej w przypadku metody powierzchni nieadhezyjnej. Korzyści obejmują fakt, że mikrostudzienki zapewniają przestrzenie między mikrostudzienkami w celu oddzielenia komórek lub sferoid, dzięki czemu łatwo jest kontrolować rozmiar sferoidy, a jednocześnie ułatwia monitorowanie każdej pojedynczej sferoidy. Dzięki dużej liczbie mikrostudzienek możliwa jest również wysokoprzepustowa produkcja sferoidów. Kolejną zaletą mikrostudzienek jest możliwość formowania studzienek o różnych kształtach (sześciościenne, cylindryczne, pryzmatyczne trygonalne) w zależności od unikalnych celów eksperymentalnych użytkowników. Ogólnie rzecz biorąc, trójwymiarowy (3D) wklęsły (lub półkulisty) kształt jest uważany za najbardziej odpowiedni do wytwarzania pojedynczych sferoid o jednolitych rozmiarach. W związku z tym przydatność wklęsłych mikrostudzienek została opisana w wielu badaniach z zakresu biologii komórki, takich jak te badające różnicowanie kardiomiocytów embrionalnych komórek macierzystych14, wydzielanie insuliny przez klastry komórek wysp trzustkowych15, aktywność enzymatyczna hepatocytów16 oraz lekooporność sferoidów nowotworowych17.
Niestety, produkcja mikrostudzienek często wymaga specjalistycznych urządzeń do mikrowzorów; konwencjonalne metody oparte na fotolitografii wymagają naświetlania i wywoływania, podczas gdy metody oparte na reaktywnym trawieniu jonowym wymagają sprzętu plazmowego i wiązki jonów. Taki sprzęt jest kosztowny, co w połączeniu ze skomplikowanym procesem produkcji stanowi wysoką barierę wejścia dla biologów, którzy nie mają dostępu do mikrotechnologii. Aby przezwyciężyć te problemy, zaproponowano inne opłacalne metody, takie jak litografia lodu18 (przy użyciu zamrożonych kropelek wody) oraz metoda elastycznej membrany14 (przy użyciu membrany, podłoża przewlekanego i próżni). Jednak metody te mają również poważne wady, takie jak trudność w kontrolowaniu rozmiarów wzorów, osiąganie wysokich proporcji i produkcja mikrostudzienek o większej powierzchni.
Aby przezwyciężyć powyższe problemy, proponujemy nowatorską metodę produkcji wklęsłych mikrostudni z wykorzystaniem podłoża przewlekanego, stalowych koralików i układu magnesów. Korzystając z tej metody, można wytworzyć setki wklęsłych sferycznych mikrostudzienek, wykorzystując mechanizm samoblokujących się metalowych kulek wspomaganych siłą magnetyczną (ryc. 1). Proces produkcji wiąże się z użyciem bardzo niewielu drogich i skomplikowanych urządzeń i nie wymaga wielu zaawansowanych umiejętności. W związku z tym nawet niewykwalifikowane osoby mogą z łatwością podjąć się tej metody wytwarzania. Aby zademonstrować proponowaną metodę, komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej wyhodowano we wklęsłych mikrostudzienkach w celu wytworzenia sferoid.

<table><tbody><tr><td>Grawer obrotowy CNC</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło Micro</td><td>HAM Pr&auml; zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&Phi; 0,55 i 0,75 mm</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>Do czyszczenia płyty aluminiowej. Rozcieńczyć wodą destylowaną z 15% roztworem</td></tr><tr><td>Magnes neodymowy</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Łożysko kulkowe</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&Phi; 600 &mu; m koralik stalowy</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami do 4% (w/v) roztworu</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

sparowany układ ściegów i magnesów do formowania mikrostudzienek o zmiennej geometrii wklęsłej

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Kultura sferoidów jest użytecznym narzędziem do zrozumienia zachowania komórek, ponieważ zapewnia trójwymiarowe środowisko podobne do in vivo. Różne metody produkcji sferoidów, takie jak powierzchnie nieadhezyjne, kolby przędzalnicze, wiszące krople i mikrostudzienki, były stosowane w badaniach nad interakcją między komórkami, aktywacją immunologiczną, badaniami przesiewowymi leków, różnicowaniem komórek macierzystych i generowaniem organoidów. Wśród tych metod, mikrostudzienki o trójwymiarowej geometrii wklęsłej przyciągnęły uwagę naukowców i inżynierów, ze względu na ich zalety generowania sferoidów o jednolitych rozmiarach i łatwość, z jaką można monitorować reakcje poszczególnych sferoid. Mimo że zaproponowano opłacalne metody, takie jak zastosowanie elastycznych membran i litografia lodowa, techniki te wiążą się z poważnymi wadami, takimi jak trudności w kontrolowaniu rozmiarów wzorów, osiąganie wysokich proporcji i produkcja większych obszarów mikrostudzienek. Aby przezwyciężyć te problemy, proponujemy solidną metodę wytwarzania wklęsłych mikrostudzienek bez konieczności stosowania skomplikowanych, kosztownych urządzeń. Metoda ta wykorzystuje układ otworów przelotowych 30 x 30, kilkaset stalowych kulek rzędu mikrometrów i siłę magnetyczną do wytworzenia 900 mikrostudzienek w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS) o wymiarach 3 cm x 3 cm. Aby zademonstrować możliwość zastosowania naszej metody w zastosowaniach biologicznych komórek, hodowaliśmy komórki macierzyste tłuszczu przez 3 dni i z powodzeniem wyprodukowaliśmy sferoidy za pomocą naszej platformy microwell. Ponadto przeprowadziliśmy symulację magnetostatyczną w celu zbadania mechanizmu, w którym siła magnetyczna została wykorzystana do uwięzienia stalowych kulek w otworach przelotowych. Uważamy, że proponowana metoda wytwarzania mikrostudzienek może być zastosowana w wielu badaniach komórkowych opartych na sferoidach, takich jak badania przesiewowe leków, regeneracja tkanek, różnicowanie komórek macierzystych i przerzuty raka.

Wypukła forma oraz wzór mikrootworów zostały z sukcesem wykonane zgodnie z krokami od 2.1 do 3.7 (Rysunek 4). Komercyjne stalowe kuleczki zostały uwięzione w matrycy otworów przelotowych o wymiarach 30 x 30. Kuleczki były mocno utrzymywane, bez żadnych szczelin między nimi a odpowiadającymi im otworami przelotowymi (Rysunek 4a). Kształt wykonanego wklęsłego mikrootworu jest półkulisty, o średnicy 600 µm, co odpowiada średnicy sta...

Ten manuskrypt przedstawia solidną metodę wytwarzania wklęsłych mikrostudzienek bez potrzeby skomplikowanych, kosztownych urządzeń. Wykorzystując siłę magnetyczną, stalowe kulki i układ otworów przelotowych, uformowano kilkaset mikrostudzienek w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS) o wymiarach 3 cm x 3 cm.

Sparowany układ ściegów i magnesów do formowania mikrostudzienek o zmiennej geometrii wklęsłej

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Ogólnym celem tej metody jest wytwarzanie wklęsłych mikrowypukłości sferycznych z wykorzystaniem samoblokujących się kulek metalicznych wspomaganych siłami magnetycznymi. Witam, nazywam się Gi Hun Lee i jestem asystentem naukowym na Uniwersytecie Chung-Ang. W naszym laboratorium zajmujemy się wytwarzaniem różnorodnych urządzeń i platform w mikroskali w celu usprawnienia badań nad rozwojem instrumentów biologicznych, ich hodowlą oraz nowymi mikrostrukturami.Jednym z naszych obszarów zainteresowań badawczych jest opracowywanie nowych urządzeń mikroprzepływowych oraz metodologii pozwalających na kurczenie się tkanek w środowisku trójwymiarowym. Nazywamy to hodowlą 3D. Hodowla ta jest bardzo użyteczna do zrozumienia odpowiedzi trójwymiarowej, ponieważ bardziej przypomina ona rzeczywistą tkankę niż konwencjonalna dwuwymiarowa hodowla płaska.Próbowano kilku metod wytwarzania sfer, takich jak w kolbach lub probówkach, w sieci bębnowej oraz za pomocą mikrofal. Wśród tych metod metoda mikro-wklęsła jest bardzo potężnym narzędziem do wytwarzania produktów trójwymiarowych. Każdy parametr aparatury mikrofalowej jest monitorowany, co pozwala na kontrolę rozmiarów i rozkładu sfer.W niniejszej pracy proponujemy metodę wytwarzania wklęsłych mikrownęk przy użyciu kulek oraz macierzy małych magnesów. Dzięki zastosowaniu tej techniki możliwe jest wytworzenie 100 wklęsłych mikrownęk za pomocą mechanizmu siły magnetycznej wspomagającej nieruchome kulki. Wzmocnienia różnią się w procesie dla każdej wnęki i nie wykazują powtarzalnych skal proponowanych rozwiązań.Na wstępie, za pomocą grawerki obrotowej CNC wykonano aluminiowe płyty z macierzą 230 na 30 otworów przelotowych. Płyty te służą jako prowadnica dla kulek, co zostanie przedstawione w kolejnych sekcjach. Płyty nawiercono wiertłami o różnych średnicach, przy czym płytę z mniejszymi otworami umieszczono na spodzie.Zewnętrzne narożniki są również wiercone w celu wyrównania płytek. Następnie dwie płytki są wyrównywane, układane jedna na drugiej i blokowane poprzez włożenie trzech śrub N do otworów ograniczających, a następnie mocowane nakrętkami. Jak wspomniano wcześniej, dla producenta istotne jest, aby płytkę z mniejszym otworem umieścić na dole, tak aby koraliki mogły zostać utrwalone wewnątrz otworów prowadzących.Kolejnym krokiem jest przygotowanie macierzy magnesów neodymowych o wymiarach 30 na 30. Zaczynamy od ręcznego odseparowania magnesów i ułożenia ich w macierz o wymiarach dwa na dwa. Następnie, za pomocą pęsety, ustawiamy je w większą macierz.Aby stworzyć prawidłowy układ magnesów, każdy magnes musi mieć polaryzację przeciwną do sąsiedniego. Ponadto, aby zapobiec pękaniu lub rozproszeniu układu, do jego dolnej części przytwierdza się płytkę aluminiową za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Teraz możemy przystąpić do montażu każdego przygotowanego elementu w formie z mikrootworami.Układ magnesów zostaje ostrożnie przymocowany do dolnej płyty za pomocą zwykłej taśmy. Ważne jest, aby układ magnesów był przymocowany magnesami skierowanymi w dół. Po odpowiednim ułożeniu płyty aluminiowej i układu magnesów, na zmontowanej płycie umieszcza się stalowe kuleczki.Kulki wykorzystane w naszej pracy to stalowe kulki SUJ o średnicy 600 micron. Proces wyrównywania jest bardzo prosty. Wsypujemy odpowiednią liczbę kulek na zespół i usuwamy nadmiar za pomocą płyty akrylowej.Magnes znajdujący się na spodzie zatrzymuje kuleczki, które wpadają do otworów w płycie aluminiowej, natomiast nadmiar kuleczek, które nie osadziły się w otworach, jest usuwany podczas procesu skrobania. Nadmiar kuleczek usuwa się za pomocą innego magnesu. Gdy kuleczki są prawidłowo osadzone w otworach prowadzących, przystępujemy do zdjęcia górnej płyty.W trakcie tego procesu mogą zdarzyć się przypadki, w których kuleczki wypadną i zostaną przesunięte. W takiej sytuacji należy ręcznie włożyć kuleczkę z powrotem do otworu za pomocą pęsety. Teraz forma wklęsłego mikrodobeczka jest gotowa.Przenieś platformę do innej szalki Petriego i przygotuj się do kolejnego kroku. Przygotowujemy PDMS zgodnie z instrukcjami producenta, mieszając monomer PDMS z czynnikiem sieciującym w stosunku 10:1. Aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w mieszaninie PDMS, odgazowujemy ją, umieszczając w deskrypcie przez około jedną godzinę.Po wykonaniu tej czynności odgazowaną mieszaninę PDMS wlewamy do wklęsłej formy mikrowyrobisk i ponownie poddajemy odgazowaniu. Następnie mieszaninę PDMS wypieka się na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez dwie godziny, aby utworzyć zatopioną podtackę z PDMS. Kolejny etap procesu musi zostać przeprowadzony z dużą ostrożnością.Aby ułatwić proces usuwania, na tackę pomocniczą wlewa się metanol, a następnie kolejno usuwa się obwodową tackę pomocniczą z PDMS. Należy zwrócić uwagę, aby producent upewnił się, że metanol dobrze przeniknął w szczeliny, co zapewni czyste usunięcie. Następnie tacka pomocnicza z PDMS zostaje oddzielona od płyty aluminiowej; przed odklejeniem tacki pomocniczej łatwiej jest dociąć jej krawędzie.Na koniec usuwamy kuleczki z podtacki PDMS. Przed ich usunięciem rozciągamy i wyginamy podtackę przez pewien czas, aby poluzować wiązania między kuleczkami a podtacką PDMS. Samo usuwanie kuleczek jest bardzo proste i można je przeprowadzić za pomocą dużego magnesu.Proces wytwarzania wklęsłych mikrootworów został zakończony i mikrootwory są gotowe do hodowli komórkowej. Aby sprawdzić, czy nasza platforma PDMS nadaje się do hodowli komórek, przeprowadziliśmy następujące procedury. Najpierw użyliśmy wycinaka do biopsji o średnicy 14 mm, aby wyciąć podkładkę PDMS z wzorem wklęsłych mikrootworów.Po wysterylizowaniu podkładki PDMS umieszczamy ją w płytce 24-dołkowej. Następnie całą podkładkę PDMS pokrywamy 4% roztworem Pluronic F-127 przez noc, aby zapobiec przyleganiu komórek do powierzchni mikrodółek. Podczas procesu powlekania należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w mikrodółkach, stosując pipetowanie lub myjkę ultradźwiękową.Po upewnieniu się, że nie pozostały pęcherzyki powietrza, nanosimy jeden mililitr roztworu pożywki komórkowej, zawierającego około dwóch milionów komórek, na podkładkę PDMS. Następnie odsysamy pożywkę za pomocą pipety 1000 µL, aby usunąć nadmiar komórek, które nie zostały uwięzione w mikroskrutkach; po tym kroku komórki są gotowe do umieszczenia w inkubatorze. Pomyślnie wykonano wypukłą formę z wzorem mikroskrutków, a komercyjne stalowe kuleczki zostały uwięzione w macierzy 30 na 30 otworów przelotowych.Kuleczki były ściśle dopasowane, bez pęcherzyków gazu pomiędzy kuleczkami a odpowiadającymi im otworami przelotowymi. Kształt wykonanego wklęsłego mikrodobka jest wklęsło-półkulisty o średnicy 600 mikronów, co odpowiada średnicy stalowej kuleczki. Przekrój poprzeczny wklęsłego mikrodobka wykazuje, że odległość od sąsiedniego mikrodobka wynosiła jeden milimetr, co było zgodne z rozstawem otworów przelotowych.Komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego hodowano w wklęsłych mikrosdołkach. Na matrycę wklęsłych mikrosdołków o średnicy 14 milimetrów wysiano dwa miliony komórek. Po 24 godzinach komórki zagregowały w sferoidy.Średnica sferoidów utworzonych w matrycy mikrowell wynosiła średnio 185,68 mikrona. W trzecim dniu komórki uległy silniejszej agregacji, a średnia średnica sferoidów spadła do 147 mikronów. Zgodnie z tą procedurą, przy użyciu naszej kosztowo efektywnej i stosunkowo prostej metody, można wytworzyć 100 wklęsłych sferycznych mikrowell.

a-paired-bead-magnet-array-for-molding-microwells-with-variable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowano metodę litografii mikroperforacyjnej w celu wytwarzania wzorów mikro- i submikronowych na powierzchniach górnych, bocznych i dolnych podłoży polimerowych. Pozwala ona pokonać trudności związane z nanoszeniem wzorów na polimery przewodzące oraz tworzeniem wzorów na ściankach bocznych. Metoda ta umożliwia szybkie wytwarzanie wielu elementów i nie wymaga zastosowania agresywnych odczynników chemicznych.

Litografia mikropunczowania w celu generowania wzorów mikro- i submikronowych na podłożach polimerowych

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Przedstawiono procedury używane do generowania mikrostrukturalnych wklęsłych koralików polidimetylosiloksanowych. Szczególnie podkreślono wpływ stężenia elektrolitu i tożsamości w fazie wodnej.

Wytwarzanie mikropęcherzyków wklęsłych kulek PDMS o porowatości

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorców komórkowych bez tuszu, bez etykiet, niezależną od podłoża, opartą na efekcie magnetycznym Archimedesa.

Wzorcowanie komórek przy użyciu strategii magnetyczno-archimedesowej

Przedstawiamy dynamiczną i odwracalną platformę do testowania sztywności wykonaną z ultramiękkiego silikonowego elastomeru (polidimetylosiloksan, PDMS) z osadzonymi cząstkami żelaza. Ten nowatorski test nadaje się do badania pojawiających się czasowo zależnych zmian fizycznych w fenotypach komórek, w tym naprowadzania kontaktowego. Tutaj mierzymy wyrównanie kardiomiocytów noworodków szczurów po usztywnieniu macierzy za pomocą magnetyki.

Mikrowzorowane elastomery magneto-reologiczne do wywoływania zmian w ustawieniu kardiomiocytów

Niniejszy artykuł przedstawia unikalną metodę wytwarzania form głównych z otworem wentylacyjnym, który zapobiega uwięzieniu powietrza podczas odlewania lepkiego polimeru, umożliwiając wytwarzanie mikroigieł żelatynowych z ostrymi końcówkami. Zmniejszając objętość odlewania żelatyny o wysokiej lepkości, można było również wytwarzać cienkościenne, puste piramidalne mikroigły.

Wykonanie głównej formy do mikroigieł z otworem wentylacyjnym o wielkości mikrona

Poznaj metodę wytwarzania mikrostudzienek wklęsłych z wykorzystaniem siły magnetycznej i kulek stalowych w podłożu PDMS. Technika ta umożliwia tworzenie setek mikrostudzienek do trójwymiarowych kultur komórkowych.

Sparowany układ ściegów i magnesów do formowania mikrostudzienek o zmiennej geometrii wklęsłej

Przeglądaj więcej filmów