Name: Zastosowanie centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych w mysim modelu choroby krytycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj model mysiej sepsy z centralną linią żylną do podawania płynów i leków. Technika CLP pozwala badać zmiany metaboliczne i endokrynologiczne w ciężkich chorobach, wspierając badania nad intensywną terapią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GVdB, za pośrednictwem Uniwersytetu w Leuven (KU Leuven), otrzymuje długoterminowe wsparcie badań strukturalnych z programu Methusalem finansowanego przez rząd flamandzki (METH08/07) i posiada Advanced Grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych AdvG-2012-321670 z programu Ideas siódmego programu ramowego Unii Europejskiej. SET otrzymał stypendium Research Foundation-Flanders (FWO) Research Assistant Fellowship.

Protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu w Leuven.
1. Przygotowanie linii żylnej
<ol>
	<li>Przygotować końcówkę cewnika żylnego poprzez szybkie zanurzenie środkowej części 60 cm rurki z mikrorenathanu (MRE) w gorącym (&gt; 20 °C) oleju sezamowym. Następnie rozciągnąć środkową część rurki, aby uzyskać wąską średnicę (średnica zewnętrzna (OD) &lt; 0.5 mm), delikatnie oddalając od siebie końce rurki.</li>
	<li>Używając ostrza skalpela, przeciąć rurkę na dwie części po 30 cm każda (patrz Rycina 1, Tabela 1).</li>
	<li>Połączyć rurkę MRE z rurką polietylenową PE10 za pomocą łącznika polietylenowego PE50, a następnie połączyć tę rurkę PE10 z dolną częścią obrotniqy. Górną część obrotnicy połączyć z rurką PE10, a tę z igłą typu Luer stub za pomocą rurki z łącznikiem PE50, zgodnie z Rycina 1.</li>
	<li>Nanieść silny, szybko utwardzający się klej do wszystkich połączeń i sprawdzić szczelność cewnika, przepłukując go powietrzem. Przed użyciem cewnik poddać sterylizacji gazowej.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu kateteryzacji przedstawiający cewnik, drut prowadzący, wprowadzacz i porty przyłączeniowe." src="/files/ftp_upload/55553/55553fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Konstrukcja linii żylnej. Linie żylne przygotowuje się poprzez rozciąganie rurek MRE do uzyskania niewielkiej średnicy, a następnie ich połączenie. poprzez przewód polietylenowy do urządzenia obrotowego dla gryzoni. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania instrukcji dotyczących długości poszczególnych części. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55553/55553fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Legenda</td>
			<td>Długość</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1) Igła z przyłączem Luer 2 G</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) PE50 – polietylen 0,023" x 0,038"</td>
			<td>5 cm</td>
			<td>13 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3) PE10 – polietylen .01" x .024” </td>
			<td>50 cm</td>
			<td>30 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4) Obrotówka dla gryzoni 20 G</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5) PE-10 </td>
			<td>15 cm</td>
			<td>9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6) PE-50 (łącznik)</td>
			<td>5 cm</td>
			<td>13 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7) MRE025 Końcówka z rozciągniętego mikropoliuretanu 0,025" x 0,012"</td>
			<td>30 cm</td>
			<td>27 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma całkowita</td>
			<td>105 cm</td>
			<td>92 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Konstrukcja linii żylnej.Niniejsza tabela stanowi legendę do Rysunku 1.
2. Znieczulenie i przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Użyć 24-tygodniowych samców myszy C57BL/6J (27 - 32 g). 
	UWAGA: Stosujemy myszy w wieku 24 tygodni (dojrzałe osobniki), ponieważ wiek ten lepiej odpowiada średniemu wiekowi pacjentów oddziałów intensywnej terapii. Używamy wyłącznie samców, aby uniknąć cyklicznego wpływu estrogenów. Technikę tę można stosować również u młodszych zwierząt (przetestowano u myszy 16-tygodniowych) oraz u samic, jeśli jest to preferowane.</li>
	<li>Przed użyciem wysterylizować wszystkie instrumenty chirurgiczne. Przepłukać sterylny, wykonany samodzielnie kaniulę żylną solą fizjologiczną, aby usunąć pęcherzyki powietrza oraz sprawdzić drożność i ewentualne nieszczelności.</li>
	<li>Odciąć metalowy drut (średnica 0,8 mm) o długości 80 cm, złożyć go na pół, tworząc pętlę. Nawlec 3 koraliki na podwojony drut w kierunku pętli. Przymocować kaniulę do metalowego drutu, przesuwając końcówkę kaniuli przez 3 koraliki. 
	UWAGA: Metalowy drut mocujący jest niezbędny do rotacji obrotnicy, do której podłączona jest kaniula. Dzięki temu mysz może poruszać się swobodnie, bez blokowania linii żylnej.</li>
	<li>Zznieczulić mysz poprzez doszprycytowe (IP) wstrzyknięcie mieszaniny 0,03 mL ketaminy (10 mg/kg) i 0,02 mL ksylazyny (13 mg/kg). Upewnić się, że znieczulenie jest odpowiednie, sprawdzając brak odruchów. Delikatnie wyciągnąć język myszy pęsetą, aby zapobiec uduszeniu przez zapadnięcie języka. 
	UWAGA: Jeśli po 10 min mysz nadal próbuje wycofać kończyny, podać dodatkową ketaminę w bolusie 0,01 mL.</li>
	<li>Ogolić obszar operacyjny, w tym brzuch, przednią część szyi (trójkąt między brodą, mostkiem a obojczykiem) oraz obszar między łopatkami u podstawy głowy.</li>
	<li>Umieścić mysz w pozycji brzusznej na wstępnie podgrzanej macie grzewczej, zdezynfekować skórę 70% etanolem i nałożyć niewielką ilość lubrykantu okulistycznego, aby chronić oczy przed wysychaniem. Przeprowadzić infiltrację miejsc operacyjnych (brzuch, przód i tył szyi) 0,2 mL ropiwakaínu (0,67 mg/kg).</li>
	<li>Gdy mysz wciąż znajduje się w pozycji brzusznej, wykonać niewielkie nacięcie skalpelem lub nożyczkami u podstawy grzbietowej strony głowy. Odsłonić tylne mięśnie szyi i przywiązać mięsień do pętli drutu mocującego nicią nylonową 3.0, przeprowadzając nić pod mięśniem.</li>
	<li>Położyć mysz na prawym boku. Wykonać niewielkie pionowe nacięcie skóry na brzusznej stronie szyi skalpelem lub nożyczkami. Pod kontrolą wizualną wprowadzić igłę 18G podskórnie przez to nacięcie brzuszne w kierunku wcześniej wykonanego nacięcia na grzbiecie i przeciągnąć kaniulę przez igłę, aby wyprowadzić ją na stronę brzuszną.</li>
	<li>Położyć mysz na grzbiecie. Przeciągnąć nić nylonową 3.0 za górnymi siekaczami myszy i przymocować ją taśmą do maty grzewczej. Zabezpieczyć głowę w masce tlenowej do podawania tlenu (2 L/min). Unieruchomić mysz w pozycji wyprostowanej, przyklejając taśmą ogon oraz dwie przednie kończyny. 
	UWAGA: Jeśli samo znieczulenie ketaminą i ksylazyną jest niewystarczające, podczas operacji można podawać wziewnie izofluran (0,5 - 1,5%).</li>
</ol>
3. Umieszczenie chronicznego cewnika indwelacyjnego
<ol>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem stereotypowym. W wykonanym wcześniej nacięciu na brzusznej stronie szyi delikatnie odsuń pęsetą tkankę tłuszczową i gruczoły, aż do momentu uwidocznienia żyły szyjnej.</li>
	<li>Przeprowadź tępe rozczłonkowanie, aby uwolnić żyłę szyjną z tkanki łącznej i podskórnej znajdującej się powyżej i wokół naczynia; w tym celu umieść końcówkę pęsety między żyłą a tkanką łączną i wielokrotnie otwieraj pęsetę równolegle do żyły. Dzięki temu uniknie się uszkodzenia naczynia.</li>
	<li>Izoluj żyłę szyjną, umieszczając pod nią tępą pęsetę. Przełóż pod żyłą trzy fragmenty nici jedwabnej 3.0; jeden fragment umieść proksymalnie w stosunku do rozwidlenia żyły szyjnej (podwiązanie kranialne), a drugi blisko mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowatego (podwiązanie kaudalne). Zaciśnij podwiązanie kranialne i kaudalne, aby napiąć żyłę i zapobiec nadmiernemu krwawieniu podczas wprowadzania cewnika. Wykonaj luźne podwiązanie środkową nicią, aby zapewnić łatwe zabezpieczenie cewnika w późniejszym etapie.</li>
	<li>Za pomocą mikronożyczek wykonaj wzdłuż żyły nacięcie między podwiązaniem kranialnym a kaudalnym, wystarczająco duże, aby móc wprowadzić cewnik. Chwyć cewnik pęsetą i wprowadź go na 1 mm do wnętrza żyły. Luźno zabezpiecz cewnik, zawiązując podwiązanie środkowe i potwierdź prawidłowe umiejscowienie, delikatnie przepłukując cewnik sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Zabezpiecz cewnik, mocno zawiązując podwiązanie środkowe i kaudalne wokół naczynia i cewnika. Zwiąż końce podwiązania kaudalnego i środkowego, aby trwale ustabilizować cewnik. Upewniając się, że węzły nie zamykają światła żyły, przepłukuj cewnik po każdym zawiązanym węźle. Na koniec zawiąż podwiązania kaudalne i kranialne. Zamknij nacięcie szwami z nici jedwabnej 5.0.</li>
</ol>
4. Podwiązanie i nakłucie kąbnicy
<ol>
	<li>Wykonać 1-cm nacięcie w linii środkowej przez skórę dolnej połowy brzucha za pomocą skalpela lub nożyczek; należy uważać, aby nie przebić się do jamy otrzewnej.</li>
	<li>Zidentyfikować linea alba mięśni brzucha i wykonać nacięcie międzymięśniowe, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. Zlokalizować kątnicę, a następnie za pomocą tępych kleszczy anatomicznych wyizolować ją i wyciągnąć na zewnątrz.</li>
	<li>Przewiązać kątnicę w połowie jej długości za pomocą szwów jedwabnych 3.0. Należy upewnić się, że zastawka kicienszowa nie została podwiązana, aby zachować ciągłość jelita.</li>
	<li>Perforować kątnicę igłą 18G za pomocą pojedynczego nakłucia na wylot w połowie odległości między miejscem podwiązania a końcem kątnicy. Po wyjęciu igły należy usunąć niewielką ilość kału przez otwór, aby zapewnić jego drożność.</li>
	<li>Wprowadzić jelito z powrotem do jamy brzusznej, a następnie zamknąć otrzewną i skórę szwami jedwabnymi 5.0. 
	UWAGA: Średnio nowy stażysta potrzebuje od 10 do 15 zwierząt, aby móc sprawnie wprowadzić cewnik żylny i przeprowadzić procedurę CLP w ciągu 45 min. Po okresie szkolenia można spodziewać się 10% śmiertelności związanej z anestezją/operacją.</li>
</ol>
5. Leczenie pooperacyjne i płynoterapia
<ol>
	<li>Umieść mysz w pozycji grzbietowej i przymocuj kaniulę do drutu mocującego za pomocą taśmy. Przenieś mysz do osobnej klatki. Użyj statywu z regulowanym zaciskiem, aby utrzymać urządzenie obrotowe (swivel) 25 cm nad myszą, a następnie mocno przyklej wolną część metalowego drutu mocującego do punktu obrotowego urządzenia.</li>
	<li>Podłącz do linii żylnej strzykawkę zawierającą mieszaninę koloidów i krystaloidów zrównoważonych (1:4), aby rozpocząć resuscytację płynową.</li>
	<li>Umieść klatkę w szafie dla zwierząt z kontrolowaną temperaturą (27 °C) i 12-godzinnym cyklem światła i ciemności, a następnie rozpocznij dożylną resuscytację płynową (10 mL/kg/h) za pomocą precyzyjnej pompy infuzyjnej sterowanej strzykawką. Zapewnij wzbogacenie środowiska klatki, np. materiał do gniazdowania i drewniany klocek.</li>
</ol>
6. Intensywna terapia
<ol>
	<li>6 h po operacji podać podskórnie leki przeciwbólowe i antybiotyki (0,3 mL buprenorfiny (0,15 mg/kg) oraz 0,2 mL imipenemu (16,67 mg/kg)). UWAGA: Zgodnie ze standardową praktyką medycyny zwierząt laboratoryjnych, pierwszą dawkę leków przeciwbólowych podaje się przed pierwszym nacięciem chirurgicznym, a następnie zgodnie z wytycznymi weterynaryjnymi danej instytucji. Iniekcje podskórne należy wykonywać ostrożnie w przestrzeń podskórną.</li>
	<li>Po 20–24 h resuscytacji płynowej zastąpić krystaloidy/koloidy całkowitym żywieniem pozajelitowym (6,67 mL/kg/h). 
	UWAGA: Podawane całkowite żywienie pozajelitowe (5,8 kcal/24 h) pokrywa około 40% dziennego zapotrzebowania kalorycznego myszy, co odpowiada wczesnemu spożyciu kalorii u pacjentów na oddziale intensywnej terapii.</li>
	<li>Podawać podskórnie leki przeciwbólowe i antybiotyki (0,6 mL buprenorfiny (0,3 mg/kg) oraz 0,2 mL imipenemu (16,67 mg/kg)) co 12 h przez cały okres choroby krytycznej.</li>
	<li>Kontrolować zwierzęta co najmniej co 3 h w ciągu dnia. Oceniać cierpienie, przypisując punktację bólową w oparciu o zwalidowaną skalę grymasów u myszy1. Zintensyfikować monitorowanie zwierząt z wysoką punktacją bólową.</li>
</ol>
7. Zakończenie eksperymentu
UWAGA: Zatwierdzenie oraz rekomendacje dotyczące stopnia dotkliwości modelu, a także wytyczne i zasady dotyczące punktów końcowych dla ludzi powinny zostać uzgodnione z lokalną Instytucjonalną Komisją Etyczną ds. Badań na Zwierzętach.
UWAGA: W przypadku niedrożności linii żylnej, takiej jak zablokowany cewnik, przemieszczenie cewnika lub problemy z pompą strzykawkową, zwierzę zostaje wykluczone z badania i poddane eutanazji.
<ol>
	<li>Po zakończeniu okresu eksperymentalnego podaj myszy głęboką narkozę, stosując mieszaninę 0,03 mL ketaminy (10 mg/kg) i 0,02 mL ksylazyny (13 mg/kg). Uśmierć zwierzę poprzez pobranie krwi metodą punkcji serca. Próbki wybranych tkanek zamroź błyskawicznie i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Angus, D. C., van der Poll, T. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1208623">Severe sepsis and septic shock.</a> N Engl J Med. 369 (9), 840-851 (2013).</li>
<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+mortality+and+inflammatory+response+of+two+models+of+sepsis%3A+lipopolysaccharide+vs.+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Comparison of the mortality and inflammatory response of two models of sepsis: lipopolysaccharide vs. cecal ligation and puncture.</a> Shock. 13 (2), 110-116 (2000).</li>
<li>Copeland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammatory+response+to+endotoxin+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (1), 60-67 (2005).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nat Protoc. 4 (1), 31-36 (2009).</li>
<li>Zolfaghari, P. S., Pinto, B. B., Dyson, A., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+phenotype+of+rodent+sepsis%3A+cause+for+concern%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med+Exp%22%5BJournal%5D)">The metabolic phenotype of rodent sepsis: cause for concern.</a> Intensive Care Med Exp. 1 (1), 25(2013).</li>
<li>Radermacher, P., Haouzi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26266795">A mouse is not a rat is not a man: species-specific metabolic responses to sepsis - a nail in the coffin of murine models for critical care research.</a> Intensive Care Med Exp. 1 (1), 26(2013).</li>
<li>Dyson, A., Singer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%3A+why+does+preclinical+efficacy+fail+to+translate+to+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis: why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting.</a> Crit Care Med. 37 (1 Suppl), S30-S37 (2009).</li>
<li>Osuchowski, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abandon+the+mouse+research+ship%3F+Not+just+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Abandon the mouse research ship? Not just yet.</a> Shock. 41 (6), 463-475 (2014).</li>
<li>Langford DJ1, B. A., Chanda, M. L., Clarke, S. E., Drummond, T. E., Echols, S., Glick, S., Ingrao, J., Klassen-Ross, T., Lacroix-Fralish, M. L., Matsumiya, L., Sorge, R. E., Sotocinal, S. G., Tabaka, J. M., Wong, D., van den Maagdenberg, A. M., Ferrari, M. D., Craig, K. D., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+facial+expressions+of+pain+in+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse.</a> Nat Methods. 7, (2010).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+hyperdynamic+murine+model+of+resuscitated+sepsis+using+echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of a hyperdynamic murine model of resuscitated sepsis using echocardiography.</a> Am J Respir Crit Care Med. 164 (5), 891-895 (2001).</li>
<li>Heuer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture+with+total+parenteral+nutrition%3A+a+clinically+relevant+model+of+the+metabolic%2C+hormonal%2C+and+inflammatory+dysfunction+associated+with+critical+illness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness.</a> J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).</li>
<li>Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+and+quality+of+life+of+elderly+patients+after+intensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Med+Wkly%22%5BJournal%5D)">Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care.</a> Swiss Med Wkly. 142, (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy bardziej istotny klinicznie mysi model krytycznej choroby, łącząc metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia w celu wywołania sepsy za pomocą centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych. Ten układ eksperymentalny jest powtarzalny, pozwala na badanie przedłużonej fazy krytycznej choroby i skutkuje stabilnym wskaźnikiem śmiertelności, naśladując w ten sposób sytuację kliniczną u ludzi1.
Podwiązanie i nakłucie jelita ślepego z...

Choroba krytyczna to stan chorobowy, w którym funkcja jednego lub więcej układów narządów jest utrudniona do tego stopnia, że pacjent umrze, chyba że zostanie udzielone intensywne wsparcie medyczne. Podczas gdy początkowa przyczyna przyjęcia na oddział intensywnej terapii (OIOM) może być różna, począwszy od urazu, skomplikowanej operacji, oparzeń, zaostrzeń choroby po sepsę, wszyscy pacjenci w stanie krytycznym cierpią na uszkodzenie komórek, spowodowane między innymi hipoperfuzją, niedotlenieniem i nadmiernym stanem zapalnym, co prowadzi do niewydolności narządów. Większość pacjentów przeżywa ostrą urazę, ale znaczna część pacjentów nie wraca natychmiast do zdrowia i wymaga długotrwałej intensywnej terapii. Są oni narażeni na wysokie ryzyko zgonu z powodu nieustąpienia niewydolności wielonarządowej. Co więcej, przedłużająca się faza krytycznej choroby charakteryzuje się głębokim osłabieniem mięśni oraz zmianami endokrynologicznymi i metabolicznymi, których patogeneza nie jest obecnie w pełni poznana.
Kilka modeli gryzoni jest używanych w warunkach intensywnej terapii. Dwa najczęściej stosowane modele to egzogenne podawanie lipopolisacharydu (LPS) oraz podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP). Oba modele zostały opracowane w celu naśladowania ostrej fazy sepsy, zdefiniowanej jako zagrażająca życiu dysfunkcja narządu spowodowana rozregulowaną odpowiedzią gospodarza na zakażenie i jeden z głównych powodów przyjęcia na OIOM na całym świecie1,2. Model LPS ma kilka wad, ponieważ tylko przejściowo wpływa na uwalnianie cytokin i stan hemodynamiczny zwierzęcia3. W przeciwieństwie do ludzi, gryzonie są również szczególnie odporne na endotoksyny, a stosowanie "wysokich dawek" endotoksyny jest konieczne do wywołania niedociśnienia i śmiertelności, co dodatkowo budzi obawy co do ważności tej metody4,5. Drugi model, model podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP), obejmuje podwiązanie części jelita ślepego, a następnie nakłucie igły na wskroś. Zabieg ten powoduje wielobakteryjną infekcję jamy brzusznej z uszkodzeniem tkanek, a następnie translokację bakterii do komory krwi. Spowoduje to ogólnoustrojową reakcję zapalną i rozwój sepsy. Model CLP został szeroko uznany za zwierzęcy model ostrej choroby krytycznej, który odtwarza główne cechy sepsy: hiperzapalenie, rozszerzenie naczyń krwionośnych, niedociśnienie i zwiększony rzut serca6,7. Jednak model ten nie pozwala na badanie nieustępującej niewydolności wielonarządowej, zaniku mięśni oraz zmian endokrynologicznych i metabolicznych, które są typowe dla przedłużonej fazy krytycznej choroby. Co więcej, ostatnio zakwestionowano wiarygodność modeli mysich w odniesieniu do chorób krytycznych, ponieważ wyniki badań na modelach mysich nie zawsze mogą być przełożone na środowisko ludzkie8,9,10. Możliwym wyjaśnieniem może być to, że opieka wspomagająca, która jest zapewniana krytycznie chorym pacjentom, różni się znacznie od opieki zapewnianej krytycznie chorym myszom.
Dlatego, aby bardziej upodobnić się do ludzkiego otoczenia i umożliwić badanie przedłużonej fazy krytycznej choroby, opracowaliśmy model myszy, który naśladuje intensywną terapię ostrą stosowaną u ludzi, taką jak intensywne podawanie płynów dożylnie i antybiotykoterapię, i który pozwala na stosowanie leczenia wspomagającego w celu przetrwania przedłużonej fazy krytycznej choroby, takich jak wsparcie żywieniowe. W tym celu zaadaptowaliśmy mysi model sepsy wywołanej przez CLP, będący złotym standardem dla sepsy i umieściliśmy centralną linię żylną, która umożliwia podawanie płynów, składników odżywczych i leków.

<table><tbody><tr><td>Buprenorfina</td><td>Ecuphar</td><td></td><td>Vetergesic 0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>Janvier labs</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>koloidy</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Volulyte 6%</td></tr> <tr><td>krystaloidy</td><td>Baxter</td><td></td><td>Plasmalyte i viaflo</td></tr><tr><td>Ethilon 3.0</td><td>Ethicon</td><td>F3211</td><td></td></tr><tr><td>Imipenem</td><td>MSD</td><td></td><td>Tienam 500&nbsp; mg proszek do wstrzykiwań płynu</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Iso-vet</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Nimatek 100 mg/ml</td></tr><tr><td>LocTite Super glue3 wszystkie tworzywa sztuczne&nbsp;</td><td>Rectavit</td><td>119818</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3.0</td><td>Ethicon</td><td>L192</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 5.0</td><td>Ethicon</td><td>F682</td><td></td></tr><tr><td>Microrenathane .025" O.D. x .012" I.D.</td><td>Bioseb</td><td>MRE-025</td><td></td></tr><tr><td>olimel N7E</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polietylen .011" x .024"&nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 rurka .023" x.038"</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>krętlik gryzoni 20 G</td><td>Bioseb</td><td>RS-20G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ropivaca&iuml; przez</td><td>Astrazenica</td><td></td><td>Naropin 2&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>VMD</td><td></td><td>Chlorowodorek ksylazyny 2%</td></tr></tbody></table>

zastosowanie centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych w mysim modelu choroby krytycznej

Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

Ten protokół opisuje centralnie cewnikowany mysi model długotrwałej choroby krytycznej. Łączymy metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia w celu wywołania sepsy z wykorzystaniem centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych, aby naśladować warunki kliniczne człowieka. Pacjenci w stanie krytycznym wymagają intensywnej pomocy medycznej, aby przeżyć. Podczas gdy większość pacjentów wraca do zdrowia w ciągu kilku dni, około jedna czwarta pacjentów wymaga długotrwałej intensywnej terapii i jest narażona na wysokie ryzyko zgonu z powodu nierozwiązanej niewydolności wielonarządowej. Co więcej, przedłużająca się faza krytycznej choroby charakteryzuje się głębokim osłabieniem mięśni oraz zmianami endokrynologicznymi i metabolicznymi, których patogeneza nie jest obecnie w pełni poznana. Najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym w badaniach na oddziale intensywnej terapii jest model podwiązania i nakłucia jelita ślepego w celu wywołania sepsy. Jest to bardzo powtarzalny model, z ostrymi zmianami zapalnymi i hemodynamicznymi podobnymi do ludzkiej sepsy, który ma na celu badanie ostrej fazy krytycznej choroby. Jednak model ten charakteryzuje się wysoką śmiertelnością, która różni się od klinicznej sytuacji człowieka i nie jest rozwijany do badania przedłużonej fazy krytycznej choroby. W związku z tym dostosowaliśmy tę technikę, umieszczając centralny cewnik żylny w żyle szyjnej, co pozwoliło nam na zapewnienie klinicznie istotnej opieki wspomagającej, aby lepiej naśladować ludzką sytuację kliniczną w stanie krytycznym. Ten mysi model wymaga rozległego zabiegu chirurgicznego i codziennej intensywnej opieki nad zwierzętami, ale skutkuje uzyskaniem odpowiedniego modelu ostrej i przedłużającej się fazy krytycznej choroby.

Myszy C57BL/6 wprowadzono w stan krytyczny zgodnie z powyższym opisem. Przeprowadzono dwa eksperymenty w celu oceny przeżywalności po CLP do dwóch punktów czasowych: przeżywalności do 5. dnia (n = 15) oraz przeżywalności do 7. dnia (n = 2) po CLP. Krzywe przeżywalności w obu eksperymentach nie różniły się istotnie (porównanie do 5. dnia), co wskazuje na powtarzalność schematu doświadczalnego. Zwierzęta, które nie przeżyły, znaleziono martwe lub poddano im eutanazji po osiągnięciu punktów ...

Ten protokół opisuje centralnie cewnikowany mysi model przedłużającej się choroby krytycznej. Łączymy metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia w celu wywołania sepsy z wykorzystaniem centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych, aby naśladować warunki kliniczne człowieka.

Zastosowanie centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych w mysim modelu choroby krytycznej

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

Ogólnym celem tej centralnie skategoryzowanej metody ligacji i perforacji kątnicy (CLP) u myszy jest stworzenie powtarzalnego modelu przedłużonego stanu krytycznego z zastosowaniem środków intensywnej terapii, aby odzwierciedlić ludzkie warunki kliniczne. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu medycyny intensywnej terapii dotyczące patogenezy zmian endokrynologicznych i metabolicznych podczas ostrych i przedłużających się stanów krytycznych.Główną zaletą tej techniki jest połączenie dobrze zestandaryzowanej metody CLP z zastosowaniem centralnego wkłucia żylnego do podawania płynów, leków i składników odżywczych. Procedurę zaprezentuje Thomas Dufour, technik z naszego laboratorium. Aby przygotować końcówkę linii żylnej, należy szybko zanurzyć środkową sekcję 60 centymetrów rurki micro-renathane w oleju sezamowym o temperaturze 220 °C lub wyższej.Delikatnie pociągnij za końce rurki, aby rozciągnąć jej środkową część, uzyskując wąską średnicę centralną, a następnie za pomocą ostrza skalpela przetnij rurkę na dwa równe odcinki o długości 30 centymetrów. Teraz połącz rurkę z konektorem polietylenowym PE 50, obrotnicą oraz igłą z końcówką typu Luer, aby skonstruować cewnik zgodnie z demonstracją, i nałóż silny, szybko utwardzający się klej do wszystkich połączeń. Po utwardzeniu kleju przedmuchaj cewnik powietrzem, aby sprawdzić szczelność; następnie odetnij kawałek drutu metalowego o średnicy 0,8 milimetra i długości 80 centymetrów, a drut zegnij, tworząc pętlę.Przesuń trzy koraliki po podwojonym drucie pętli, a następnie wprowadź końcówkę sterylnego cewnika przez trzy koraliki, aby przymocować cewnik do drutu. Zastosuj znieczulenie u samca myszy szczepu C57BL/6 w wieku 24 tygodni i o masie od 27 do 32 g; potwierdź sedację brakiem reakcji na uciśnięcie palca u stopy. Używając pęsety, delikatnie wysuń język z pyska, aby zapobiec jego połknięciu.Następnie należy ogolić obszar operacyjny, a potem umieścić mysz w pozycji brzusznej na uprzednio rozgrzanym podkładzie grzewczym. Zdezynfekować odsłoniętą skórę 70% etanolem i nałożyć niewielką ilość lubrykantu okulistycznego. Wprowadzić lek przeciwbólowy w miejsca operacyjne i wykonać niewielkie nacięcie u podstawy grzbietowej strony głowy.Odsłoń tylne mięśnie szyi i przełóż fragment nici nylonowej 3.0 pod mięśnie, aby przywiązać pętlę drutu mocującego do mięśnia. Następnie, kładąc mysz na prawym boku, wykonaj niewielkie pionowe nacięcie skóry na brzusznej stronie szyi. Przełóż igłę o rozmiarze 18 G podskórnie przez to brzuszne nacięcie w kierunku nacięcia na grzbiecie, a następnie przeprowadź cewnik przez igłę, aby wyprowadzić go na stronę brzuszną.Kładąc mysz na grzbiecie, przełóż nylonową nitkę o grubości 3/0 za górnymi siekaczami i przyklej nylon do podkładki grzewczej. Następnie unieruchom ogon i przednie kończyny w pozycji rozciągniętej. Teraz ustaw ostrość mikroskopu operacyjnego i za pomocą pęsety delikatnie odsuń tkankę tłuszczową oraz gruczoły w nacięciu brzusznym, aż do momentu uwidocznienia żyły szyjnej.Umieść końcówkę pęsety pomiędzy żyłą a tkanką łączną, a następnie wielokrotnie rozwieraj pęsetę równolegle do żyły, aby tępo odseparować żyłę szyjną z otaczającej naczynie tkanki łącznej i podskórnej. Po wyizolowaniu naczynia umieść pęsetę tępą pod żyłą szyjną i wprowadź dwa kawałki nici jedwabnej 3-0 pod żyłę. Jeden kawałek umieść proksymalnie względem rozwidlenia żyły szyjnej dla podwiązania kranialnego, a drugi w pobliżu mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego dla podwiązania kaudalnego.Zaciśnij podwiązania głowowe i ogonowe, aby naciągnąć żyłę i zapobiec nadmiernemu krwawieniu podczas wprowadzania cewnika. Użyj trzeciej nici do wykonania luźnego podwiązania, a następnie, za pomocą mikronozycyc, wykonaj wzdłuż żyły nacięcie między podwiązaniem głowowym a ogonowym, wystarczająco duże, aby wprowadzić cewnik. Za pomocą pęsety wprowadź cewnik na 11 milimetrów do żyły i luźno zabezpiecz go środkowym podwiązaniem.Delikatnie przepłucz cewnik sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby potwierdzić jego prawidłowe umieszczenie. Następnie mocno zaciśnij podwiązkę ogonową i środkową. Zwiąż końce podwiązek ogonowej i środkowej, aby zabezpieczyć cewnik.Należy potwierdzić, że żyła nie została zamknięta przez węzły, przepłukując cewnik po każdym zawiązaniu. Na koniec należy podwiązać również wiązadło czaszkowe. Następnie zamknąć nacięcie szwami jedwabnymi 5/0.W celu przeprowadzenia ligacji i perforacji kątnicy należy wykonać nacięcie skóry o długości jednego centymetra w linii średniej w dolnej połowie brzucha, uważając, aby nie uszkodzić jamny otrzewnej. Po zidentyfikowaniu białej linii (linea alba) mięśni brzucha, należy wykonać nacięcie międzymięśniowe, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.Za pomocą tępych pęsety anatomicznej wyizoluj i wyewaguj kątnicę. Podwiąż kątnicę na 50% jej długości za pomocą szwu jedwabnego 3-0, uważając, aby nie zacisnąć zastawki kętniczo-żołązkowej, tak aby zachować ciągłość jelita. Następnie, używając igły o rozmiarze 18 G, wykonaj pojedynczą perforację kątnicy na wylot w połowie odległości między miejscem podwiązania a końcem kątnicy, wypychając niewielką ilość kału przez otwór, aby upewnić się, że jest on drożny po wyjęciu igły.Umieść jelita z powrotem w jamie brzusznej, a następnie zamknij otrzewną i skórę, używając szwów jedwabnych 5-0. Gdy mysz znajduje się w pozycji grzbietowej, przymocuj cewnik do drutu mocującego za pomocą taśmy. Następnie umieść mysz w indywidualnej klatce z materiałem do budowy gniazda i drewnianym blokiem.Używając statywu z regulowanym zaciskiem, umieść urządzenie obrotowe w zacisku i mocno przymocuj taśmą wolny koniec metalnego drutu mocującego do punktu obrotu urządzenia. Następnie umieść klatkę w inkubatorze dla zwierząt z kontrolowaną temperaturą 27 °C oraz 12-godzinnym cyklem światła i ciemności. Podłącz strzykawkę zawierającą odpowiednią mieszaninę koloidów i krystaloidów zbilansowanych do linii żylnej i użyj precyzyjnej pompy infuzyjnej sterowanej strzykawką, aby rozpocząć resuscytację płynową z prędkością 0,3 mm/h.Po sześciu godzinach należy podać leki przeciwbólowe i antybiotyki. Analiza krzywych przeżywalności w jednym pięciodniowym i jednym siedmiodniowym eksperymencie z podwiązywaniem i perforacją kątnicy wykazała, że wskaźniki przeżywalności nie różniły się znacząco między obiema badaniami do piątego dnia, co podkreśla powtarzalność układu eksperymentalnego. Podwiązanie 50% kątnicy w połączeniu z antybiotykoterapią, płynoterapią i całkowitym żywieniem pozajelitowym poprzez cewnik żylny w vena jugularis skutkuje 13% śmiertelnością po jednym dniu stanu krytycznego.24% śmiertelności po trzech dniach stanu krytycznego, od 27% do 31% śmiertelności po pięciu dniach stanu krytycznego oraz 36% śmiertelności po siedmiu dniach stanu krytycznego. Jednakże u zdrowych myszy z grupy kontrolnej, u których ograniczono podaż kalorii do poziomu spożycia składników odżywczych przez myszy w stanie krytycznym, nie odnotowano żadnych zgonów w żadnym z eksperymentów. Po przećwiczeniu techniki na 10 do 15 zwierzętach, cewnik może zostać wprowadzony, a zabieg CLP wykonany w czasie 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedur.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym wprowadzeniu cewnika do żyły. Wprowadzenie cewnika zbyt głęboko, aż do serca, może wywołać arytmię serca. Z kolei zbyt płytkie wprowadzenie może doprowadzić do łatwego wysunięcia się cewnika.Zawsze upewnij się, że cewnik został umieszczony w świetle naczynia. Jeśli cewnik zostanie umieszczony między warstwami ściany naczynia, płyny będą wyciekać do okolicznych tkanek. Ten model może wymagać rozległego zabiegu chirurgicznego oraz codziennej intensywnej opieki nad zwierzęciem.Dzięki temu powstaje stabilny i powtarzalny model, który pozwala na badanie wielu aspektów ostrych i przedłużających się stanów krytycznych.

use-central-venous-line-for-fluids-drugs-nutrient-administration

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Paradygmat dożylnej samopodaży (IVSA) jest uważany za złoty standard w badaniu właściwości wzmacniających substancji psychoaktywnych u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne i techniki chirurgiczne niezbędne do uzyskania wiarygodnych danych IVSA. W szczególności podkreślono znaczenie starannego implantowania i utrzymywania cewników.

Metody dożylnej samopodaży w modelu mysim

W tym filmie opisujemy metodę wszczepienia cewnika do żyły szyjnej modelu myszy, przez który eksperymentalne środki, takie jak leki i barwniki znacznikowe, mogą być dostarczane dożylnie in vivo. Taki układ po połączeniu z innymi systemami może być również wykorzystywany do monitorowania hemodynamiki i pobierania krwi.

Dożylne wstrzykiwanie środków eksperymentalnych za pomocą cewnika: technika dostarczania środków eksperymentalnych dożylnie przez żyłę szyjną w modelu mysim

Dostęp naczyniowy do pomiaru hemodynamiki, dostarczania płynów i pobierania próbek krwi jest ważny dla każdego badania na małym modelu zwierzęcym. Przedstawiamy technikę wszczepiania cewników do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej wspólnej u znieczulonego szczura w celu podłączenia do systemu w celu przeprowadzenia monitorowania, infuzji i pobierania próbek.

Cewnikowanie tętnicy szyjnej i żyły szyjnej w celu wykonania pomiarów hemodynamicznych, infuzji i pobierania próbek krwi w świadomym modelu szczurzym

Ten film pokazuje, jak nabyć hemodynamikę układu i wątroby u myszy. Całe monitorowanie obejmuje rejestrację parametrów życiowych, ogólnoustrojowego ciśnienia krwi, centralnego ciśnienia żylnego, szybkości przepływu w tętnicy wątrobowej wspólnej i ciśnienia w żyle wrotnej, a także szybkości przepływu wrotnego u myszy.

Monitorowanie parametrów hemodynamicznych układu układowego i wątroby u myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący technikę pozaustrojowego natleniania błony żylno-żylnej (ECMO) u niezaintubowanej, spontanicznie oddychającej myszy. Ten mysi model ECMO może być skutecznie zaimplementowany w badaniach eksperymentalnych nad ostrymi i końcowymi chorobami płuc.

Żylno-żylne pozaustrojowe utlenowanie błony u myszy

Przetoka aortalno-bębenkowa powstała poprzez przebicie mysiej aorty podnerkowej przez obie ściany do żyły głównej dolnej, a następnie powstało zwężenie w jej odpływie poprzez częściowe podwiązanie żyły głównej dolnej. Ten powtarzalny model może być wykorzystany do badania zwężenia żyły centralnej.

Mysi model zwężenia żyły centralnej z wykorzystaniem przetoki aortalno-caval ze zwężeniem odpływu

Ten protokół krok po kroku przeprowadza wielokrotne dożylne podawanie dawki bolusa i inwazyjne monitorowanie hemodynamiczne u myszy. Badacze mogą wykorzystać ten protokół do przyszłych badań przesiewowych związków terapeutycznych w kierunku nadciśnienia tętniczego płucnego.

Wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa i inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu nadciśnienia tętniczego płucnej myszy wywołanego niedotlenieniem

Ten protokół opisuje kolejne wszczepianie pompy osmotycznej w celu wywołania tętniaka aorty brzusznej poprzez uwalnianie angiotensyny II u myszy z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE) oraz portu dostępu naczyniowego z cewnikiem do żyły szyjnej w celu wielokrotnego leczenia farmakologicznego. Monitorowanie rozwoju tętniaka za pomocą ultrasonografii 3D jest skutecznie prowadzone pomimo implantów grzbietowych.

Leczenie farmakologiczne za pomocą cewnika do żyły centralnej w mysim modelu tętniaka aorty brzusznej indukowanego angiotensyną II i monitorowanie za pomocą ultradźwięków 3D

Ten artykuł ma na celu przedstawienie zoptymalizowanej metody oceny zakrzepicy żylnej w modelu raka myszy, przy użyciu klipsów naczyniowych do uzyskania podwiązania żylnego. Optymalizacja minimalizuje zmienność pomiarów związanych z zakrzepicą i zwiększa znaczenie dla zakrzepicy żylnej związanej z rakiem u ludzi.

Test zakrzepicy żylnej w mysim modelu raka

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

Poznaj model mysiej sepsy z centralną linią żylną do podawania płynów i leków. Technika CLP pozwala badać zmiany metaboliczne i endokrynologiczne w ciężkich chorobach, wspierając badania nad intensywną terapią.

Zastosowanie centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych w mysim modelu choroby krytycznej

Przeglądaj więcej filmów