Name: Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania S100A12 w celu badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej przeciwko H. pylori. Protokół zapewnia wysokie wydajności stabilnego dimerycznego białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Departament ds. Weteranów Nagroda Rozwoju Kariery 1IK2BX001701, UL1TR000445 z nagrodą CTSA od National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 i 1400969, oraz grant NIH GM05551. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Center for Advancing Translational Sciences lub National Institutes of Health.

1. Wyrażenie S100A12
<ol>
	<li>Przekształć kompetentne komórki BL21 DE3 za pomocą plazmidu pGEMEX-S100a12 przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego18. Dodaj 1 do 5 μl plazmidu do 50 μl bakterii w probówce mikrowirówkowej na lodzie. Inkubować przez 20 minut.</li>
	<li>Szok termiczny ogniw w temperaturze 42 °C przez 30 s.</li>
	<li>Inkubować komórki na lodzie przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodaj 500 μl pożywki SOC do komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Płytka 150 μL reakcji przemiany na pożywce LB-agar (uzupełniona 100 μg/ml ampicyliny). Inkubować przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz jedną kolonię. Zaszczepić 2 ml LB (uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny).</li>
	<li>Inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej (300 obr./min). OD600 powinien wskazywać od 1 do 3 jednostek absorbancji.</li>
	<li>Dodaj 500 μl kultury starterowej do 50 ml pożywki do autoindukcji ZYM-5052 26 uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny. Aby uzyskać najlepsze napowietrzenie i maksymalną ekspresję, należy użyć kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml z przegrodą. Wstrząsać (300 obr./min) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę bakteryjną do probówki wirówkowej. Granulować komórki przez odwirowanie (4 000 x g, 10 min) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować pożywkę, zarejestrować próbkę i przechowywać pastę komórkową w temperaturze -80 °C. Próbka jest stabilna przez lata.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie S100A12 za pomocą chromatografii niskociśnieniowej
<ol>
	<li>Zawieś komórki w 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0.</li>
	<li>Sonizuj zawiesinę na lodzie w celu lizy komórek. Użyj mocy wyjściowej ~20 W, 5 s cyklu włączania i 5 s wyłączania przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieś roztwór do probówek wirówkowych o dużej prędkości. Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie, 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i przenieść do czystej zlewki polipropylenowej o pojemności 100 ml. Schłodzić roztwór, umieszczając zlewkę na lodzie. Dodaj mieszadło i powoli dodawaj 11,20 g siarczanu amonu. Pozostaw roztwór do mieszania na lodzie przez dodatkowe 1 godzinę. W ten sposób powstanie 60% roztwór siarczanu amonu i wytrąci się większość endogennych białek E. coli. S100A12 pozostaną rozpuszczalne.</li>
	<li>Odwirować roztwór w temperaturze 4 °C, 20 000 x g przez 20 minut w celu osadzenia wytrąconego białka.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i przenieść do rurki dializacyjnej (MWCO 3 500 kDa). Dializować w stosunku do 1 l 20 mM Tris, pH 8,0 w 4 °C. Zmienić dwukrotnie bufor dializacyjny. Odczekaj 4 godziny między zmianami.</li>
	<li>Chromatografia anionitowa
	<ol>
		<li>Przeprowadzić chromatografię w układzie niskociśnieniowym. Typowe natężenie przepływu wynosi 1 ml/min.</li>
		<li>Zrównoważyć 5 ml sefarozy z 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0.</li>
		<li>Załadować ~40 ml roztworu S100A12 za pomocą pompy do próbki (zebrać przepływ).</li>
		<li>Przemyć kolumnę 10 ml 20 mM Tris, pH 8.</li>
		<li>Rozwiń kolumnę z gradientem 0-30% (bufor B to 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) w 19 objętościach kolumny (CV, 95 mL). Zbierz 5 ml frakcji.</li>
		<li>Pobrać 10 μl podwielokrotności każdej frakcji i przeanalizować za pomocą MES SDS PAGE z barwieniem Coomassie. Uruchamiać żel przy stałym napięciu (20 V/cm) przez 30 minut.</li>
		<li>Frakcje zbiorcze zawierające S100A12. S100A12 działa przy białku ~10 kDa na żelu denaturującym.</li>
		<li>Zagęścić frakcje do 5 ml za pomocą urządzenia do ultrafiltracji (MWCO 10 kDa). Wirować przy 3.000 x g przez ~8 min. Weź górną frakcję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia wykluczania wielkości
	<ol>
		<li>Zrównoważyć kolumnę S75 z 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.</li>
		<li>Wstrzyknąć < 5 ml skoncentrowanych frakcji S100A12 (z chromatografii jonowymiennej).</li>
		<li>Rozwiń kolumnę przy natężeniu przepływu 1 ml/m na 120 ml. Zbierz 5 ml frakcji.</li>
		<li>Pobrać 10 μl podwielokrotności każdej frakcji i przeanalizować za pomocą SDS PAGE z barwieniem Coomassie. Zweryfikuj tożsamość białka za pomocą western blot lub spektrometrii mas (obliczona masa cząsteczkowa podjednostki monomerycznej 10 575,0 Da, mierzona 10575,4 Da).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Frakcje puli
	<ol>
		<li>Zmierzyć absorbancję białka A280 za pomocą spektrofotometru. Użyj bufora SEC jako pustego miejsca. Obliczony współczynnik ekstynkcji dla S100A12 homodimeru wynosi 5960 M-1 cm-1, 
		UWAGA: Typowe plony to 35-45 mg S100A12 na 50 ml kultury.</li>
		<li>Podwielokrotność porcji S100A12 do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (1 mg/probówkę), błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej
<ol>
	<li>Smuga H. pylori odcedzić G27 na tryptycznych płytkach sojowych uzupełnionych 5% krwią owczą (płytki z agarem z krwią). Rośnie 2-3 dni w temperaturze 37 °C w powietrzu wypełnionym 5% dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Zaszczep H. pylori w bulionie z brucelozy uzupełnionym 1x cholesterolem. Hodowla przez noc wytrząsanie (250 obr./min) w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Rozcieńczyć H. pylori w stosunku 1:10 w 50% bulionie Brucella, 50% buforze kalprotektyny plus 1x cholesterol i kulturę w samym pożywce lub uzupełnioną 100 μM chlorku plus 0, 100 lub 1,000 μg/ml oczyszczonej S100A12. Hodowla przez noc wytrząsanie (250 obr./min) w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Następnego dnia wykonaj seryjne rozcieńczenia i płytkę na płytkach z agarem z krwią. Pozostawić kolonie bakteryjne do wzrostu przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla. Wylicz jednostki tworzące kolonie, aby obliczyć wzrost bakterii w obecności lub braku S100A12 i/lub egzogennego.</li>
</ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Immunity%3A+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li>
<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
<li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li>
<li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastric+precancerous+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dig+Dis%22%5BJournal%5D)">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
<li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense%2C+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li>
<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiono skuteczny protokół zarówno do odciągania, jak i oczyszczania S100A12 ludzkiego. System ekspresji E. coli jest najpowszechniejszym narzędziem wykorzystywanym do produkcji białek rekombinowanych, szczególnie gdy do badań biochemicznych i biofizycznych wymagane są ilości mg. Kluczowym ulepszeniem opisanej tutaj procedury jest zastosowanie pożywki autoindukcyjnej26, która zwiększa wydajność oczyszczonego białka prawie trzydziestokrotnie w porównaniu z ekspresją za pomocą standardowej pożywki bulionowej...

Białka S100 to klasa z rodziny białek wiążących wapń EF-hand o zróżnicowanym wachlarzu funkcji1. Są one wyrażane w sposób specyficzny dla tkanki i komórki oraz regulują szerokie spektrum funkcji komórkowych2,3. Unikalne dla białek wiążących wapń, białka S100 wykazują zarówno funkcje wewnątrzkomórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe4,5. W komórce wiązanie Ca2+ indukuje zmianę konformacyjną, która odsłania hydrofobową powierzchnię, która jest specyficznie ukierunkowana na partnerów wiążących białka6. Ten wewnątrzkomórkowy mechanizm reguluje ważne procesy, takie jak proliferacja komórek, różnicowanie i metabolizm energetyczny. W środowisku zewnątrzkomórkowym białka S100 pełnią dwie funkcje7. W jednym z nich działają jako białka wzorca molekularnego związanego z uszkodzeniem (DAMP) i inicjują prozapalną odpowiedź immunologiczną poprzez interakcję z receptorami rozpoznawania wzorców8,9. Ponadto kilku członków klasy białek S100 sekwestruje metale przejściowe, funkcję, która służy do głodzenia patogenów mikrobiologicznych w procesie zwanym odpornością odżywczą10,11.
S100A12 (znany również jako kalgranulina C i EN-RAGE) ulega silnej ekspresji w makrofagach i neutrofilach i został zidentyfikowany jako potencjalny biomarker chorób zapalnych12,13. Oprócz wiązania wapnia w miejscach EF-Hand, S100A12 ma dwa miejsca wiązania metali przejściowych o wysokim powinowactwie zlokalizowane na przeciwległych końcach interfejsu dimerów14,15. Każde miejsce wiązania składa się z trzech reszt histydyny i jednej reszty kwasu asparaginowego i może chelatować lub miedź16,17. Niedawno informowaliśmy, że zależny od S100A12 głód jest ważny w regulacji wzrostu Helicobacter pylori i aktywności prozapalnych czynników wirulencji18.
H. pylori infekuje żołądek około połowy światowej populacji ludzkiej, co czyni go prawdopodobnie jednym z najbardziej skutecznych patogenów bakteryjnych19. Zakażenie H. pylori może prowadzić do poważnych skutków chorób żołądka, w tym zapalenia błony śluzowej żołądka, wrzodu trawiennego i dwunastnicy, chłoniaka tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową (MALT) i inwazyjnego gruczolakoraka żołądka (rak żołądka). Rak żołądka jest główną przyczyną zgonów niezwiązanych z rakiem włóknistego na świecie, a największym pojedynczym czynnikiem ryzyka raka żołądka jest zakażenie H. pylori.
H. pylori utrzymuje się w niszy żołądkowej pomimo silnej odpowiedzi immunologicznej na patogen, podkreślając potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmów immunologicznych kontroli tej infekcji bakteryjnej20,21,22,23. Zapalenie związane z H. pylori charakteryzuje się głębokim naciekaniem komórek wielojądrzastych lub neutrofili, które w miejscu infekcji odkładają repertuar białek przeciwdrobnoustrojowych, w tym S100A12, w miejscu infekcji18,24,25. Starając się zrozumieć złożony dialog między gospodarzem a patogenem, staraliśmy się udoskonalić technikę oczyszczania S100A12 i wykorzystać ją do badania wpływu przeciwdrobnoustrojowego, jaki wywiera na ten istotny z medycznego punktu widzenia patogen. Poniższy protokół przedstawia ulepszoną technikę oczyszczania S100A12 w stanie biologicznie aktywnym; Zdolny do wiązania metali odżywczych o wysokim powinowactwie i chelatowania ich przed inwazyjnymi mikroorganizmami. Co więcej, poniższe metody podkreślają użyteczność tego białka jako krytycznego odczynnika do badania mechanizmu, za pomocą którego wrodzone cząsteczki przeciwdrobnoustrojowe ograniczają wzrost patogenów bakteryjnych.
Białka z rodziny S100A zyskały uznanie jako ważna grupa wrodzonych cząsteczek układu odpornościowego, które uczestniczą w sygnalizacji immunologicznej, jak również w obronie gospodarza27. Najlepiej zbadaną z nich jest kalprotektyna (MRP-8/14, kalgranulina A/B, S100A8/A9)28,29,30. Kalprotektyna jest białkiem związanym z neutrofilami, które tworzy heterodimer podjednostek S100A8 i S100A9, który wiąże metale przejściowe na granicy dimerów31. Wykazano, że kalprotektyna posiada dwa miejsca wiązania metali: Miejsce 1 może wiązać Zn2+, Mn2+ lub Fe2+, a Miejsce 2 może wiązać Zn2+ 31,32. Liczne doniesienia wykazały, że kalprotektyna ma działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko różnym patogenom, w tym Staphylococcus aureus, Candida albicans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli i H. pylori, oraz że działanie hamujące wynika z aktywności chelatacji metalu calprotectin25,28,29.
Poprzednia praca wykazała, że kalprotektyna wywiera liczne działania na H. pylori, w tym zmienia strukturę lipidu A w błonie zewnętrznej, hamuje system wydzielania cag-Type IV (który jest głównym prozapalnym czynnikiem wirulencji w H. pylori), indukuje tworzenie biofilmu oraz hamuje wzrost i żywotność H. pylori w sposób zależny od dawki25,33. Co więcej, testy genetyczne i biochemiczne wykazały, że działanie przeciwbakteryjne kalprotektyny przeciwko H. pylori wynikało w dużej mierze z jej zdolności do wiązania składników odżywczych25. H. pylori wymaga, jak stwierdzono w poprzednich badaniach, w których wykorzystano chemicznie zdefiniowane podłoże w celu ustalenia zapotrzebowania na mikroelementy dla tego patogenu do wzrostu i namnażania się34. Ponadto kalprotektyna była bardzo obfita w tkankach zakażonych H. pylori i była związana z naciekami neutrofilowymi, co wskazuje, że gospodarz może stosować kalprotektynę jako strategię przeciwdrobnoustrojową podczas infekcji i późniejszego stanu zapalnego25,35.
Ostatnie dowody z bezstronnych technik przesiewowych proteomiki sugerują, że w warunkach, w których reaktywne formy tlenu są obfite, kalprotektyna ulega modyfikacjom potranslacyjnym, które zmieniają miejsce wiązania heksa-histydyny, hamując tym samym aktywność wiązania metali przez białko36. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że inne białka z rodziny S100A spośród szerokiego repertuaru tych cząsteczek mogą potencjalnie działać jako pomocnicze chelatory metali. Wybraliśmy S100A12 do dalszych badań, ponieważ nie został zidentyfikowany we wspomnianym wcześniej badaniu przesiewowym pod kątem modyfikacji potranslacyjnej, ma zdolność wiązania i występuje bardzo obficie w tkankach ludzkich pochodzących od osób zakażonych H. pylori.
Nasza praca wskazuje, że S100A12 może hamować wzrost i żywotność H. pylori w sposób zależny od dawki w szczepie G27 H. pylori, oraz że aktywność przeciwbakteryjna tego białka może być odwrócona przez dodanie nadmiaru odżywczego. Praca ta uzupełnia nasze wcześniejsze prace wskazujące S100A12 wywierają aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko szczepom PMSS1 i 7.13 H. pylori, wykazując jej szeroką aktywność przeciwbakteryjną przeciwko licznym izolatom klinicznym i laboratoryjnie przystosowanym szczepom H. pylori18. Łącznie wyniki te potwierdzają znaczenie S100A12 jako mechanizmu kontrolującego wzrost i namnażanie się bakterii poprzez odporność żywieniową. Przyszłe badania nad tą ważną interakcją gospodarz-bakteria mogą obejmować wykorzystanie aktywności S100A12 w celu zmniejszenia obciążenia bakteryjnego w tkankach gospodarza lub określenie udziału tego białka w sygnalizacji immunologicznej w kontekście zakażenia H. pylori.

<table><tbody><tr><td><silny>S100A12 Ekspresja</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Komórki ekspresji</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) kompetentne komórki</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Składniki</td><td></td><td></td><td></td>pożywki autoindukcyjnej</tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Research</td><td>Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>laktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>Agent selekcyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>S100A12 System chromatografii </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop lite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe z krwią</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Bulion z brucelli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa s100a12

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Białka kalgranuliny są ważnymi mediatorami odporności wrodzonej i należą do klasy S100 rodziny białek wiążących wapń EF-hand. Niektóre białka S100 mają zdolność wiązania metali przejściowych o wysokim powinowactwie i skutecznego sekwestrowania ich przed atakującymi patogenami drobnoustrojów w procesie, który określa się mianem "odporności odżywczej". S100A12 (EN-RAGE) wiąże zarówno, jak i miedź i występuje w dużych ilościach we wrodzonych komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi i neutrofile. Przedstawiamy udoskonaloną metodę ekspresji, wzbogacania i oczyszczania S100A12 w jej aktywnej, wiążącej metale konfiguracji. Wykorzystanie tego białka w analizach wzrostu i żywotności bakterii ujawnia, że ma S100A12 działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko patogenowi bakteryjnemu, Helicobacter pylori. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa opiera się na aktywności wiążącej przez S100A12, która chelatuje jako składnik odżywczy, pozbawiając w ten sposób H. pylori, który potrzebuje do wzrostu i namnażania.

Ekspresja i oczyszczanie S100A12
Trzystopniowe oczyszczanie pozwoliło na uzyskanie ~40 mg rekombinowanego białka S100A12 z 50 mL kultury bakteryjnej. Pierwszym etapem było wytrącanie endogennych białek E. coli za pomocą siarczanu amonu. Następnie przeprowadzono chromatografię wymiany anionowej (Rycina1A). Obecność białka monitorowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem Coomassie...

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ułatwienie izolacji i oczyszczania białka S100A12 w jego aktywnej formie, aby mogło ono zostać wykorzystane w testach przeciwdrobnoustrojowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, takie jak rola S100A12 – peptydy przeciwdrobnoustrojowego wytwarzanego w odpowiedzi na zakażenie bakteriami patogennymi. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że nasz zoptymalizowany protokół zapewnia wysoką wydajność otrzymywania stabilnego, czystego dimeru S100A12, który posiada zdolność wiązania i sekwestracji metali odżywczych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ w określonych warunkach S100A12 tworzy oligomery o różnych rozmiarach, a oligomery te wykazują obniżoną aktywność przeciwdrobnoustrojową in vitro. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas oczyszczania i badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej pokrewnego białka z rodziny S100A, zwanego kalprotektyną. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa dla etapów frakcjonowania według wielkości oraz końcowego oczyszczania na kolumnie.Testy przeciwdrobnoustrojowe są istotne dla powodzenia tego procesu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić transformację kompetentnych komórek BL21 DE3 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie do 50 µL bakterii w probówce do mikrowirówki na lodzie należy dodać od 1 do 5 µL plazmidu.Inkubować przez 20 minut. Następnie poddać komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 30 sekund. Inkubować na lodzie przez dwie minuty.Następnie należy dodać 500 µL pożywki SOC. Inkubować w temperaturze 37 °C na inkubatorze orbitalnym przy prędkości 250 rpm przez jedną godzinę. Następnie 150 µL mieszaniny transformacyjnej należy wysiać na pożywkę LB agar z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny.Inkubować od 12 do 16 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji pobrać pojedynczą kolonię i zaszczepić ją do 2 mL pożywki LB z dodatkiem ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37°C na wytrząsarku orbitalnej przy 300 rpm przez cztery do sześciu godzin.Następnie należy dodać 500 µL kultury startowej do 50 mL pożywki autoindukcyjnej ZYM 5052 uzupełnionej o ampicylinę. Inkubować przy wytrząsaniu z prędkością 300 rpm przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przenieść zawiesinę bakteryjną do probówki wirówkowej.Wiruj w temperaturze 4 °C przy 4 000 ×g przez 10 minut. Po wirowaniu odlej pożywkę, zarejestruj próbkę i przechowuj osad komórkowy w temperaturze -80 °C. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 30 ml 20 mM Tris o pH 8,0. Dalej, poddaj zawiesinę sonikacji na lodzie przy mocy 20 W, stosując cykl 5 sekund pracy i 5 sekund przerwy przez 5 minut, aby zlizować komórki.Przenieś sonikowany roztwór do wysokiej jakości probówek do wirowania. Wirować z prędkością 20,000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut w celu sklarowania lizatu komórkowego. Następnie zlej nadosad do czystego, 100 mililitrowego zlewka z polipropylenu.Umieść zlewkę w lodzie, aby schłodzić roztwór. Włóż mieszadło magnetyczne i powoli dodaj 11,20 g siarczanu amonu. Mieszaj roztwór w lodzie przez jedną godzinę.Następnie przenieść roztwór do probówek do wirowania i wirować z prędkością 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby wytrącić białko w formie osadu. Odlać nadsącz do membrany dializacyjnej. Prowadzić dializę przeciwko jednemu litrowi 20 mM Tris w temperaturze 4 °C i pH 8,0. Bufor dializacyjny należy wymienić dwukrotnie w odstępach czterogodzinnych.Następnie wyrównaj kolumnę sepharose o pojemności 5 ml za pomocą 10 ml 20 mM Tris. Używając pompy do próbek, nałóż około 40 ml roztworu S100A12. Zbierz frakcję przepływową.Następnie wypłucz kolumnę roztworem TRIS o stężeniu 20 mM. Przeprowadź elucję z kolumny, stosując gradient od 0 do 30% w ciągu 19 objętości kolumny. Zbieraj frakcje o objętości 5 ml.Użyj elektroforezy żelowej MES SDS z barwieniem Coomassie, aby przeanalizować 10 µL aliquoty każdej frakcji. Następnie wyodrębnij frakcje zawierające S100A12. Przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji zagęść frakcje do 5 mL.Następnie przeprowadź równoważenie kolumny S75, używając 120 ml roztworu 20 mM tris i 100 mM chlorku sodu. Wstrzyknij 5 ml próbki z zagęszczonych frakcji. Następnie eluuj kolumnę przy szybkości przepływu 1 ml/min przez 120 ml.Zbierz frakcje o objętości 5 ml. Za pomocą SDS-PAGE z barwieniem Coomassies przeanalizuj 20 µl alikwotu z każdej próbki. Następnie potwierdź tożsamość białka i wyodrębnij frakcje zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W celu rozpoczęcia należy wysiać H.pylori na podłoże brucella broth uzupełnione o 1X cholesterolu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm w atmosferze wzbogaconej o 5% carbon dioxide. Rozcieńczyć H.pylori w stosunku jeden do dziesięciu w mieszaninie 50% brucella broth i 50% buforu kalprotektynowego z dodatkiem 1X cholesterolu.Następnie należy dodać białko S100A12 i/lub egzogenne metale w razie potrzeby. Testy przeciwdrobnoustrojowe stanowią krytyczny punkt procedury. Ważne jest zastosowanie buforu do kalprotektyny, aby zapewnić stabilność dimerów S100A12, oraz wykorzystanie mineralnego medium pozbawionego metali do testów wzrostu bakteriologicznego, tak aby białko nie zostało przytłoczone nadmiarem mikroskładników, które powszechnie występują w bogatych, złożonych mediach bakteriologicznych.Następnego dnia należy wykonać rozcieńczenia seryjne próbek. Następnie wysiać je na płytki z agarem krwi. Pozostawić kolonie bakterii do wzrostu przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 °C w powietrzu wzbogaconym o 5% carbon dioxide.Następnie należy obliczyć wzrost bakterii zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu przedstawiono ulepszoną metodę ekspresji i oczyszczania białka S100A12 w jego aktywnej konfiguracji wiążącej metale. Trójetapowy proces oczyszczania rozpoczyna się od wytrącania endogennych białek E.coli siarczanem amonu, po którym następuje chromatografia wymiany anionowej.Po śledzeniu białka za pomocą SDS-PAGE z barwieniem Coomassie Brilliant Blue, frakcje zawierające S100A12 są wyodrębniane do chromatografii wykluczania cząsteczkowego. S100A12 jest homodimerem z 92 aminokwasami na podjednostkę i posiada całkowitą masę cząsteczkową około 21 kilodaltonów.Następnie zbadano aktywność przeciwdrobnoustrojową S100A12 za pomocą ilościowych technik hodowli mikrobiologicznych. Wyliczenie liczby komórek bakterii wykazało, że ekspozycja na 100 µg/mL S100A12 w obecności lub przy braku egzogennego źródła składników odżywczych w postaci cynku nie zahamowała znacząco żywotności bakterii. Jednakże ekspozycja na 1 000 µg/mL S100A12 w samym medium skutkuje 69-krotnym spadkiem żywotności bakterii.Dodanie egzogennego źródła cynku odwraca ten efekt, co dowodzi, że aktywność przeciwdrobnoustrojowa białka S100A12 zależy od jego zdolności do sekwestracji cynku. Po opanowaniu techniki, ekspresja i oczyszczanie białka mogą zostać przeprowadzone w ciągu trzech do czterech dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po zastosowaniu tej metody można wykorzystać inne techniki, takie jak spektrometria mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania.W jaki sposób sekwestracja metali ogranicza wzrost drobnoustrojów? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny mikrobiologii do zgłębienia odporności żywieniowej H.pylori. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ekspresować, oczyszczać i kwantyfikować aktywność białka przeciwdrobnoustrojowego S100A12.Należy pamiętać, że praca z H.pylori może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w pomieszczeniu z certyfikatem BS2. Zastosowania tej techniki obejmują choroby żołądka, w tym wrzody, zapalenie żołądka oraz inwazyjny rak przydatków.Zrozumienie tych procesów pozwoli nam lepiej opracowywać nowe cząsteczki przeciwdrobnoustrojowe celujące w te mechanizmy. Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w biochemię białek z rodziny S100A, można ją również zastosować do badania ich roli w sygnalizacji immunologicznej oraz w przebiegu licznych chorób, takich jak nowotwory, zapalenie stawów i choroby zakaźne.

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii anionowo-wymiennej do oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 na podstawie ładunku powierzchniowego netto białka z hodowli Escherichia coli.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

Ten film demonstruje test do badania cytotoksyczności białek wytwarzanych przez Staphylococcus aureus, bakterię chorobotwórcze, na izolowanych ludzkich leukocytach wielojądrzastych (PMN). Wydzielane białka cytotoksyczne tworzą pory na błonie komórkowej PMN, inicjując śmierć komórki. Po barwieniu martwych komórek za pomocą jodku propidyny przeprowadza się cytometrię przepływową w celu ilościowego określenia martwych komórek i oceny cytotoksyczności bakterii.

Test cytotoksyczności PMN za pośrednictwem białek zewnątrzkomórkowych bakterii

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Tutaj opisana jest metoda wykorzystująca system infekcji oparty na wkładce membranowej do badania wpływu Streptolizyny S, wydzielanej toksyny wytwarzanej przez Streptococcus grupy A, na keratynocyty. System ten może być z łatwością zastosowany do badania innych wydzielanych białek bakteryjnych na różnych typach komórek gospodarza podczas infekcji.

Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

Oczyszczanie, dializa i aktywacja znacznika his-tag są stosowane w celu zwiększenia wydajności rozpuszczalnej, aktywnej metaloproteinazy-3 domeny katalitycznej ekspresji białka u bakterii. Frakcje białkowe są analizowane za pomocą żeli SDS-PAGE.

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania S100A12 w celu badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej przeciwko H. pylori. Protokół zapewnia wysokie wydajności stabilnego dimerycznego białka.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Przeglądaj więcej filmów