Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Ogólnym celem tej metody pobierania próbek jest pozyskanie próbek metabolitów ze Staphylococcus aureus w celu ich późniejszego oznaczenia ilościowego za pomocą tandemowej chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas. Nasze laboratorium koncentruje się na badaniu powiązań między metabolizmem a patogenezą bakterii istotnych dla zdrowia ludzi. Obecnie jako organizm modelowy wykorzystujemy ludzki patogen oportunistyczny Staphylococcus aureus.

Jednym z kluczowych pytań, na które chcemy odpowiedzieć, jest to, w jaki sposób bakterie dostosowują swoją fizjologię i patogenność w obliczu wyczerpania składników odżywczych podczas infekcji gospodarza. Technika ta jest korzystna, ponieważ pozwala na uzyskanie obrazu rozkładu konkretnych metabolitów w wielu szlakach metabolicznych w aktywnie rosnących komórkach, przy minimalnym zakłóceniu ich stanu fizjologicznego. Na początek należy wykonać posiew kreśkowy wybranych szczepów S.aureus z mrożonych stoków glicerolowych na agar sojowy z tryptonem w celu ich izolacji.

Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 16-24 godziny. Następnego dnia zaszczep 4 mL bulionu sojowego z tryptonem (TSB) w sterylnych szklanych probówkach inkubacyjnych pojedynczymi koloniami każdego szczepu. Inkubuj kultury, ustawione pod kątem z rotacją, w temperaturze 37°C przez 16-20 godzin.

Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną kultur przy 600 nanometrach, w skrócie OD600. Na podstawie tego pomiaru rozcieńcz komórki do OD600 wynoszącej 0,05 w 50 mL sterylnego medium TSB, w kolbach Delonga o pojemności 250 mL. Inkubuj kultury w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z wytrząsaniem przy 280 rpm.

Co 30 minut wykonuj pomiary OD600. Wraz ze wzrostem gęstości optycznej może stać się konieczne rozcieńczenie kultur pożywką TSB, aby pozostały one w liniowym zakresie absorbancji spektrofotometru. Podczas wzrostu komórek przygotuj świeże roztwory buforu do ekstrakcji, używając odczynników o najwyższej dostępnej czystości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Gdy kultury osiągną OD600 w zakresie od 0,8 do 1,0, należy poddać je subkulturacji w 50 mL świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki TSB do poziomu OD600 od 0,01 do 0,05, a następnie powtórzyć etapy inkubacji i pomiaru. Przygotować warstwę kruszonego suchego lodu w odpowiednim naczyniu, takim jak szalka szklana, wiaderko do lodu lub lodówka turystyczna. Gdy gęstość optyczna kultur będzie zbliżać się do pożądanego punktu zbioru, należy dodać 1 mL roztworu quenchingowego do niepoddaną obróbce szalki Petriego o średnicy 35 mm i schłodzić ją na suchym lodzie przez co najmniej 5 minut.

W naszym przypadku pożądanym momentem zbioru jest gęstość optyczna wynosząca około 0,4 do 0,5. Wartość ta może być jednak zmieniana w zależności od celów eksperymentu. Następnie należy umieścić stalową płytkę filtracyjną w gumowym korku i zamocować go w kolbie ssawnej podłączonej do instalacji próżniowej lub pompy próżniowej.

Włącz próżnię i umieść na górze mieszaną membranę z octanu celulozy. Należy użyć filtra o tej samej średnicy co frit, aby zapewnić zebranie wszystkich komórek. Kluczowe jest jak najszybsze zebranie komórek i zatrzymanie aktywności metabolicznej, aby uzyskać obraz zawartości metabolitów w określonych warunkach.

Nawet niewielkie opóźnienia mogą wpłynąć na fizjologię komórek w stanie stacjonarnym. Przy OD600 w zakresie od 0,4 do 0,5, należy użyć pipety serologicznej, aby pobrać 13 mL kultury z kolby. Próbkę należy natychmiast nanieść na filtr.

Po przefiltrowaniu całej próbki należy niezwłocznie przemyć filtr nie więcej niż 5 mL lodowatego PBS, aby usunąć metabolity związane z pożywką. Następnie należy odłączyć próżnię i za pomocą sterylnej pęsety wyjąć filtr z frity. Przenieść filtr do schłodzonego wcześniej roztworu quenchującego.

Inkubować filtr w roztworze gaszącym na suchym lodzie przez co najmniej 20 minut. Za pomocą sterylnej pęsety odwrócić filtr w szalce Petriego i użyć mikropipety, aby spłukać komórki z membrany do roztworu gaszącego. Resuspendować komórki w roztworze gaszącym, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej, odpornej na uderzenia probówki o pojemności 2 mL zawierającej około 100 microliters kulek krzemionkowych 0.1 mm.

Przechowywać w suchym lodzie lub w temperaturze -80°C. Aby rozpocząć ekstrakcję metabolitów, najpierw rozmrozić próbki w lodzie kruszonym. Następnie zhomogenizować komórki w homogenizatorze, wykonując cztery 30-sekundowe cykle przy 6000 rpm, z dwuminutowymi przerwami na chłodzenie w suchym lodzie pomiędzy cyklami.

Wiruj lizaty przez 15 minut w schłodzonej probówce do mikrocentryfugi w temperaturze 4°C z maksymalną prędkością. Po wirowaniu przenieś nadsącz do czystej probówki do mikrocentryfugi. Za pomocą mikropipety przenieś niewielką część próbki do probówki do mikrocentryfugi w celu oznaczenia ilości pozostałego peptydu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Pozostałą część próbki przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu analizy metabolitów za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas należy odnieść się do protokołu tekstowego. Mutant null CodY został wykorzystany do zbadania wyczerpania aminokwasów rozgałęzionych, ponieważ białko CodY reguluje ekspresję kilkudziesięciu genów w odpowiedzi na spadek stężenia tych składników odżywczych.

Mutacja codY ma niewielki wpływ na tempo wzrostu komórek S.aureus. Spadek gęstości optycznej w 3. godzinie wskazuje na etap rozcieńczenia wstecznego, który zwiększa liczbę podwojeń komórek przed zbiorem i usuwa poprzez rozcieńczenie różne cząsteczki gromadzące się podczas wzrostu nocnego. Analiza sekwencji RNA transkryptomów obu szczepów wykazuje istotne zmiany w ekspresji genów zaangażowanych w syntezę aminokwasów z rodziny asparaginianu.

Poniżej nazw genów liczby wskazują krotność zmiany ekspresji u mutanta null codY w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Po ilościowym oznaczeniu wyekstrahowanych metabolitów metodą LC-MS porównano ich zawartość w obu szczepach. Analizując wybrane związki związane z rodziną aminokwasów asparaginianowych, stwierdzono, że zawartość prekursorów, takich jak asparaginian oraz O-acetylhomoseryna, jest zmniejszona u mutanta codY.

Z kolei produkty końcowe, takie jak treonina i izoleucyna, ulegają zwiększeniu. Tutaj linia przerywana wskazuje próg zmian w obfitości dla tego eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać metabolity z Staphylococcus aureus w celu ich ilościowego oznaczenia za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas.

Niniejszy protokół, po odpowiedniej modyfikacji, nadaje się również do pozyskiwania metabolitów z innych gatunków bakterii. Ponieważ bakterie reagują na dynamiczne środowisko, ważne jest, aby etapy filtrowania i płukania przeprowadzać szybko, aby zminimalizować potencjalne zmiany fizjologiczne wywołane pobieraniem próbek. Zmiany te można również ograniczyć, utrzymując frit i PBS w niskiej temperaturze podczas pobierania próbek.