Name: Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i analizy metabolitów Staphylococcus aureus przy użyciu tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Technika ta pozwala badać metabolizm bakteryjny i jego związek z patogennością podczas infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH Pathway to Independence Award (grant GM 099893) oraz fundusze na rozpoczęcie nauki przez wydział SRB, a także grant na projekt badawczy (grant GM 042219). Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

1. Przygotowanie roztworów buforowych
<ol>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; pH 7,4) rozcieńczając roztwór podstawowy 10x PBS do końcowego stężenia 1x ultraczystą (destylowaną i dejonizowaną) wodą.</li>
	<li>Przygotować roztwór hartowniczy, łącząc 2 ml acetonitrylu, 2 ml metanolu, 1 ml ultraczystegoH2Oi 19 μl (0,1 mM stężenia końcowego) kwasu mrówkowego.</li>
	<li>Przygotować rozpuszczalnik LC-MS A, dodając kwas mrówkowy (0,2% [v/v] stężenie końcowe) do wody ultraczystej.</li>
	<li>Przygotować rozpuszczalnik LC-MS B, dodając kwas mrówkowy (0,2% [v/v] stężenie końcowe) do acetonitrylu. 
	UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być przygotowywane przy użyciu odczynników o najwyższej dostępnej czystości (zazwyczaj klasy wysokosprawnej chromatografii cieczowej). Roztwory powinny być przygotowywane świeże przed każdym eksperymentem i przechowywane na lodzie przed użyciem.</li>
</ol>
2. Ustanowienie S. aureus w stanie ustalonym Wzrost
<ol>
	<li>Szczepy Streak S. aureus będące przedmiotem zainteresowania do izolacji na agarze sojowym tryptycznym (TSA) z zamrożonego glicerolu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-24 godziny.</li>
	<li>Zaszczepić 4 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) lub innego odpowiedniego podłoża w sterylnych szklanych probówkach inkubacyjnych pojedynczymi koloniami każdego szczepu. Inkubacja nachylona (kąt ~70°) z obrotem z prędkością 60 obrotów na minutę (rpm) w temperaturze 37 °C przez 16-20 h. 
	UWAGA: Hodowle nocne są podatne na gradienty tlenu przy użyciu standardowych metod, w tym tych opisanych w kroku 2.2, które wpływają na fizjologię komórkową. W związku z tym stosujemy strategię wielokrotnego rozcieńczania wstecznego, aby zapewnić biologiczny stan stabilny (patrz kroki 2.4-3.2 poniżej).</li>
	<li>Użyć spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną kultur z kroku 2.2 przy długości fali 600 nm (średnica zewnętrzna600). Użyj sterylnego podłoża jako odniesienia optycznego (ślepego namiaru). Rozcieńczyć te komórki do OD600 0,05 w 50 ml sterylnego podłoża TSB (wstępnie podgrzanego do 37 °C) w oddzielnych kolbach DeLonga o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z wytrząsaniem przy 280 obr./min.</li>
	<li>Co 30 minut należy wykonać pomiary OD600; wraz ze wzrostem gęstości optycznej może okazać się konieczne rozcieńczenie kultur za pomocą TSB, tak aby pozostały w liniowym zakresie absorbancji spektrofotometru.</li>
	<li>Gdy kultury z kroku 2.5 osiągną OD600 ~0,8-1,0, zahoduj je do 50 ml 37 °C TSB do OD600 0,01-0,05 i powtórz kroki 2.4 i 2.5.</li>
</ol>
3. Konfiguracja pobierania próbek
<ol>
	<li>Przygotuj warstwę pokruszonego suchego lodu w odpowiednim naczyniu (np. szklanym naczyniu, wiaderku na lód lub chłodziarce).</li>
	<li>Gdy gęstości optyczne kultur zbliżają się do pożądanego punktu zbioru, dodać 1 ml roztworu hartowniczego do nieobrobionej szalki Petriego o średnicy 35 mm i wstępnie schłodzić na suchym lodzie przez ≥5 min. 
	UWAGA: "Pożądany punkt zbioru" będzie się różnić w zależności od celów eksperymentalnych. Na przykład, jeśli ktoś miałby badać metabolity podczas wzrostu tlenowego, kluczowymi wskaźnikami tego stanu są wydalanie octanu i ponowna asymilacja octanu podczas fazy wzrostu po wykładniczym wzroście32,33. Ogólnie rzecz biorąc, punkt ten powinien znajdować się w określonej fazie wzrostu (np. fazie wykładniczej). Specyficzne wartości OD600 związane z tym etapem mogą się różnić w zależności od różnych szczepów bakterii i pożywek wzrostowych.</li>
	<li>Umieścić frytę filtracyjną ze stali nierdzewnej (wstępnie schłodzoną do temperatury -20 °C) w gumowym korku i umieścić ją na kolbie próżniowej podłączonej do domowej pompy próżniowej lub pompy próżniowej.</li>
	<li>Zastosuj próżnię i umieść na wierzchu membranę z mieszanego estru celulozy (wielkość porów 0,22 μm). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć filtra o średnicy równej średnicy frytki i odpowiednio wyśrodkować ten filtr, aby zapewnić, że próbka jest wciągana przez filtr, a nie przez krawędź. Zwilżenie membrany lodowatym, sterylnymH2Omoże pomóc w ustawieniu membrany.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Przy średnicy zewnętrznej600 ~0,4-0,5 użyj pipety serologicznej, aby usunąć 13 ml kultury z kolby i nałożyć próbkę na filtr.</li>
	<li>Po przefiltrowaniu całej próbki należy natychmiast przemyć filtr ≥5 ml lodowatego PBS w celu wypłukania metabolitów związanych z pożywką.</li>
	<li>Odłącz odkurzacz i użyj sterylnej pęsety, aby wyjąć filtr z fryty. Odwróć filtr (komórką do dołu) do wstępnie schłodzonego roztworu hartującego. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wykonać powyższe kroki szybko (tj. w ciągu kilku sekund) i zaraz po usunięciu płynu, aby zapewnić szybkie wygaszenie komórek, zatrzymując aktywność metaboliczną.</li>
	<li>Inkubować filtr w roztworze hartowniczym na suchym lodzie przez ≥20 min.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety odwróć filtr (komórką do góry) na szalce Petriego i za pomocą mikropipety spłucz komórki z membrany do roztworu hartującego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w roztworze hartującym, a następnie przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki odpornej na uderzenia o pojemności 2 ml zawierającej ~100 μl kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm. Przechowywać na suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja metabolitów
<ol>
	<li>Rozmrażaj próbki na mokrym lodzie i rozbijaj komórki w homogenizatorze z czterema 30-sekundowymi seriami przy 6 000 obr./min, z 2-minutowymi okresami chłodzenia na suchym lodzie między cyklami.</li>
	<li>Klarować lizaty przez 15 minut w wstępnie schłodzonej, schłodzonej mikrowirówce z maksymalną prędkością (tj. 18,213 x g w temperaturze ≤4 °C).</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety przenieść niewielką porcję próbki do probówki mikrowirówkowej w celu ilościowego określenia pozostałej zawartości peptydów w kroku 6; pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Objętość zarezerwowanej próbki różni się w zależności od testu BCA użytego w kroku 6.1. Próbka ta powinna być przechowywana na mokrym lodzie do natychmiastowej analizy lub zamrożona w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Test kwasu bicunchoninowego (BCA)
<ol>
	<li>Wykonaj test BCA zgodnie z zaleceniami producenta zestawu, używając próbek z kroku 5.4 w celu określenia resztkowego stężenia peptydów dla każdej próbki.</li>
</ol>
7. LC-MS
<ol>
	<li>Zmieszać 75 μl ekstraktu z S. aureus z 75 μl rozpuszczalnika LC-MS B, przygotowanego w kroku 1.4.</li>
	<li>Wiruj, aby wymieszać i wirować z prędkością 13 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Umieścić 100 μl supernatantu w fiolce z chromatografią cieczową (LC) i zamknąć ją. Upewnij się, że w próbce nie są uwięzione żadne pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Załaduj fiolki LC do automatycznego podajnika próbek LC-MS i edytuj listę uruchomioną w oprogramowaniu "Offline Worklist Editor".
	<ol>
		<li>Wypełnij kolumny "Nazwa próbki" (np. typ dziki-1), "Pozycja próbki" (np. P1-A1), "Metoda" (np. metoda ujemna w kwasie mrówkowym) i "Plik danych" (np. typ dziki 1). Kliknij przycisk "Zapisz listę roboczą". Otwórz oprogramowanie "Stacja robocza akwizycji danych spektrometrii mas" i wprowadź wcześniej zapisaną listę roboczą. Kliknij przycisk "Rozpocznij uruchamianie listy roboczej", aby rozpocząć ciągły pomiar LC-MS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddziel próbki na kolumnie, połącz kolumnę ze spektrometrem czasu przelotu (TOF) i sprzęgnij spektrometr TOF z systemem LC. Użyj gradientu fazy ruchomej w następujący sposób: 0-2 min, 85% rozpuszczalnik B; 3-5 min, 80% rozpuszczalnik B; 6-7 min, 75% rozpuszczalnik B; 8-9 min, 70% rozpuszczalnik B; 10-11,1 min, 50% rozpuszczalnik B; 11,1-14 min, 20% rozpuszczalnik B; i 14,1-24 min, 5% rozpuszczalnik B; zakończyć 10-minutowym okresem rebalansowania przy 85% rozpuszczalniku B i natężeniu przepływu 0,4 ml min-1.</li>
	<li>Za pomocą pompy izokratycznej wlej roztwór masy referencyjnej z przebiegiem, aby umożliwić jednoczesną kalibrację osi masy. 
	UWAGA: Ten krok jest oparty na standardowej instrukcji spektrometru TOF.
	<ol>
		<li>Do przeprowadzenia kalibracji w czasie rzeczywistym należy użyć mieszaniny kwasu octowego D4 i fosfazyny heksakisu (1H,1H,3H-tetrafluoropropoksy) jako roztworu masy odniesienia. Do infuzji należy użyć pompy izokratycznej o natężeniu przepływu 2,5 ml min-1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Korekta wsadowa liczby jonów
<ol>
	<li>Oznaczyć dowolną próbkę, która ma służyć jako próbka referencyjna do korekty partii (np. typu dzikiego, powtórzenie 1).</li>
	<li>Obliczyć sumę liczby jonów dla wszystkich metabolitów w próbce odniesienia. Powtórzyć to obliczenie dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Podzielić całkowitą liczbę jonów w każdej próbce przez całkowitą liczbę jonów w próbce referencyjnej, aby uzyskać stosunek.</li>
	<li>Podzielić liczbę jonów dla każdego metabolitu w próbce przez stosunek próbka/odniesienie, aby uzyskać skorygowaną o partię liczbę jonów dla każdego metabolitu.</li>
</ol>
9. Normalizacja peptydów
<ol>
	<li>Podzielić skorygowane o partię wartości liczby jonów dla każdej próbki otrzymanej w kroku 8 przez stężenie peptydu oznaczone testem BCA w kroku 6, aby uzyskać znormalizowaną wartość dla każdego metabolitu. 
	UWAGA: Znormalizowana, skorygowana o partię liczba jonów dla każdego metabolitu uzyskana w kroku 9.1 może być bezpośrednio porównana między szczepami i poddana analizie statystycznej (np. Test U Manna-Whitneya). Alternatywnie, metabolit, o którym wiadomo, że nie zmienił się ani w wyniku poddania działaniu substancji, ani w wyniku działania genów, może być stosowany jako normalizator do wykrywania zmian spowodowanych rozkładem metabolitów. Włączenie znanej ilości L-norwaliny lub kwasu glurarowego do buforu ekstrakcyjnego może być wykorzystane do skorygowania strat podczas przetwarzania próbki34.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wszystkie metabolity małocząsteczkowe są ze sobą połączone poprzez wspólne pochodzenie z centralnych szlaków metabolicznych. Podczas wykładniczego wzrostu komórki bakteryjne znajdują się w biologicznym i metabolicznym stanie równowagi, zapewniając migawkę stanu fizjologicznego w określonych warunkach. CodY monitoruje wystarczalność składników odżywczych, reagując na ILV i GTP. Wraz ze spadkiem puli ILV i GTP, aktywność CodY jest prawdopodobnie stopniowo zmniejszana, dostosowując ekspresję docelowych genów do przystosowan...

Patogeny bakteryjne muszą zmagać się z wieloma wyzwaniami w środowisku gospodarza. Oprócz bezpośredniego ataku komórek odpornościowych, gospodarz sekwestruje również składniki odżywcze niezbędne do przetrwania i replikacji bakterii, generując odporność odżywczą1,2. Aby przetrwać w tych nieprzyjaznych środowiskach, patogeny bakteryjne wykorzystują czynniki wirulencji. Niektóre z tych czynników pozwalają bakteriom uniknąć odpowiedzi immunologicznej; Inne czynniki obejmują wydzielane enzymy trawienne, takie jak hialuronidaza, termonukleaza i lipaza, które mogą umożliwić bakteriom uzupełnienie brakujących składników odżywczych poprzez spożywanie składników pochodzenia tkankowego3,4,5. Rzeczywiście, bakterie wykształciły systemy regulacyjne, które wiążą fizjologiczny stan komórki z produkcją czynników wirulencji6,7,8,9,10.
Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że CodY jest krytycznym regulatorem łączącym metabolizm i zjadliwość. Chociaż po raz pierwszy odkryto go u Bacillus subtilis jako represor genu permeazy dipeptydowej (dpp)11, obecnie wiadomo, że CodY jest wytwarzany przez prawie wszystkie bakterie Gram-dodatnie o niskim G+C12,13 i reguluje dziesiątki genów biorących udział w metabolizmie węgla i azotu14,15,16,17,18,19. U gatunków chorobotwórczych CodY kontroluje również ekspresję niektórych z najważniejszych genów wirulencji20,21,22,23,24,25,26,27. Dorsz jest aktywowany jako białko wiążące DNA przez dwie klasy ligandów: aminokwasy rozgałęzione (BCAA; izoleucyna, leucyna i walina [ILV]) i GTP. Kiedy te składniki odżywcze są obfite, CodY hamuje (lub w niektórych przypadkach stymuluje) transkrypcję. W miarę jak te składniki odżywcze stają się ograniczone, aktywność CodY jest stopniowo zmniejszana, co skutkuje stopniowaną odpowiedzią transkrypcyjną, która przekierowuje prekursory przez różne szlaki metaboliczne połączone z metabolizmem centralnym28,29,30. 
Tandemowa chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) to potężna technika, która może dokładnie identyfikować i określać ilościowo małocząsteczkowe metabolity wewnątrzkomórkowe31. W połączeniu z analizą transkryptomu (np. RNA-Seq), ten analityczny przepływ pracy może zapewnić wgląd w zmiany fizjologiczne, które zachodzą w odpowiedzi na stres środowiskowy lub żywieniowy. W tym miejscu przedstawiamy metodę ekstrakcji metabolitów z komórek Staphylococcus aureus i późniejszą analizę za pomocą LC-MS. Podejście to zostało wykorzystane do wykazania plejotropowego wpływu CodY na fizjologię S. aureus.

<table><tbody><tr><td>Materiał/Sprzęta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Kolba hodowlana (250 ml)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>Kolba boczna, 500 ml</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>3-otworowy gumowy korek, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt filtra ze stali nierdzewnej/fryta</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Nie poddana działaniu kultur tkankowych</td></tr><tr><td>Błona z mieszanego estru celulozy, 0,22 &mu; m wielkość porów</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki odporne na uderzenia, 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>Kulki krzemionkowe, 0,1 mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Precellys 24</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Cogent Diamond Hydride typu C</td><td>Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Dokładny czas przelotu (TOF) LC-MS, pompa Quat Agilent</td><td></td><td>G6230B</td><td></td>serii 6200</tr><tr><td>, seria 1290</td><td>Agilent</td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa pojemnika, seria 1290</td><td>Agilent</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Napęd zaworu, seria 1290</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa izokratyczna Agilent serii 1290</td><td></td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, Seria 1290</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Próbnik <td>Agilent</td><td>G4226A&nbsp</td> <td>serii 1290</td><td></td></tr><tr><td>Termostat, seria 1290</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chemical</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Bulion</td><td>Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, Granulowany</td><td>Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>Stałe podłoże zawiera 1,5% [w/v] agar</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (pH 7,4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Rozcieńczyć na świeżo do 1x ultra czystą wodą</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; toksyczny</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>Do spektrometrii mas, 98%</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td>Szczep bakteryjny</ silny></td><td><silny>Gatunek</silny></td><td><silny>Szczep</silny></td><td><silny>Genotyp</silny></td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>typ dziki</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&Delta; codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">aWymienione chemikalia i materiały są specyficzne dla opisanej metody i nie obejmują standardowych chemikaliów laboratoryjnych ani materiałów eksploatacyjnych.</td></tr></tbody></table>

podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów staphylococcus aureus

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Aby udaremnić patogeny bakteryjne, gospodarze często ograniczają dostępność składników odżywczych w miejscu infekcji. To ograniczenie może zmienić obfitość kluczowych metabolitów, na które reagują czynniki regulacyjne, dostosowując metabolizm komórkowy. W ostatnich latach wiele białek i RNA stało się ważnymi regulatorami ekspresji genów wirulencji. Na przykład białko CodY reaguje na poziomy aminokwasów rozgałęzionych i GTP i jest szeroko konserwowane w bakteriach Gram-dodatnich o niskiej zawartości G + C. Jako globalny regulator Staphylococcus aureus, CodY kontroluje ekspresję dziesiątek genów wirulencji i metabolicznych. Stawiamy hipotezę, że S. aureus wykorzystuje CodY częściowo do zmiany swojego stanu metabolicznego w celu przystosowania się do warunków ograniczających składniki odżywcze, które mogą wystąpić w środowisku gospodarza. Manuskrypt ten opisuje metodę ekstrakcji i analizy metabolitów z S. aureus przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas, protokołu, który został opracowany w celu sprawdzenia tej hipotezy. Metoda podkreśla również najlepsze praktyki, które zapewnią rygor i odtwarzalność, takie jak utrzymanie biologicznego stanu równowagi i stałe napowietrzanie bez stosowania ciągłych kultur chemostatów. W porównaniu ze szczepem rodzicielskim USA200 wrażliwym na metycylinę izolatu S. aureus UAMS-1, izogeniczny mutant dorsza wykazywał znaczny wzrost aminokwasów pochodzących z asparaginianu (np. treoniny i izoleucyny) oraz spadek ich prekursorów (np. asparaginianu i O-acetylohomoseryny). Odkrycia te dobrze korelują z danymi transkrypcyjnymi uzyskanymi za pomocą analizy sekwencyjnej RNA: geny w tych szlakach były regulowane w górę od 10 do 800 razy w mutancie zerowym dorsza. Sprzężenie globalnych analiz transkryptomu i metabolomu może ujawnić, w jaki sposób bakterie zmieniają swój metabolizm w obliczu stresu środowiskowego lub żywieniowego, dostarczając potencjalnego wglądu w zmiany fizjologiczne związane z niedoborem składników odżywczych występującym podczas infekcji. Takie odkrycia mogą utorować drogę do opracowania nowych leków przeciwinfekcyjnych i terapeutycznych.

Przeanalizowaliśmy wewnątrzkomórkowe pule metabolitów w S. aureus podczas wzrostu in vitro w bogatym, złożonym medium. W ramach dowodu koncepcji porównaliśmy profile metabolitów między izolatem zapalenia szpiku S. aureus UAMS-1 wrażliwym na metycylinę (typ dziki [WT]) a izogenicznym szczepem pozbawionym globalnego regulatora transkrypcyjnego CodY (ΔcodY)26. Kultury WT i szczepów codY w stanie stacjonarnym w fazie wykładn...

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Ogólnym celem tej metody pobierania próbek jest pozyskanie próbek metabolitów ze Staphylococcus aureus w celu ich późniejszego oznaczenia ilościowego za pomocą tandemowej chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas. Nasze laboratorium koncentruje się na badaniu powiązań między metabolizmem a patogenezą bakterii istotnych dla zdrowia ludzi. Obecnie jako organizm modelowy wykorzystujemy ludzki patogen oportunistyczny Staphylococcus aureus.Jednym z kluczowych pytań, na które chcemy odpowiedzieć, jest to, w jaki sposób bakterie dostosowują swoją fizjologię i patogenność w obliczu wyczerpania składników odżywczych podczas infekcji gospodarza. Technika ta jest korzystna, ponieważ pozwala na uzyskanie obrazu rozkładu konkretnych metabolitów w wielu szlakach metabolicznych w aktywnie rosnących komórkach, przy minimalnym zakłóceniu ich stanu fizjologicznego. Na początek należy wykonać posiew kreśkowy wybranych szczepów S.aureus z mrożonych stoków glicerolowych na agar sojowy z tryptonem w celu ich izolacji.Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 16-24 godziny. Następnego dnia zaszczep 4 mL bulionu sojowego z tryptonem (TSB) w sterylnych szklanych probówkach inkubacyjnych pojedynczymi koloniami każdego szczepu. Inkubuj kultury, ustawione pod kątem z rotacją, w temperaturze 37°C przez 16-20 godzin.Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną kultur przy 600 nanometrach, w skrócie OD600. Na podstawie tego pomiaru rozcieńcz komórki do OD600 wynoszącej 0,05 w 50 mL sterylnego medium TSB, w kolbach Delonga o pojemności 250 mL. Inkubuj kultury w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z wytrząsaniem przy 280 rpm.Co 30 minut wykonuj pomiary OD600. Wraz ze wzrostem gęstości optycznej może stać się konieczne rozcieńczenie kultur pożywką TSB, aby pozostały one w liniowym zakresie absorbancji spektrofotometru. Podczas wzrostu komórek przygotuj świeże roztwory buforu do ekstrakcji, używając odczynników o najwyższej dostępnej czystości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Gdy kultury osiągną OD600 w zakresie od 0,8 do 1,0, należy poddać je subkulturacji w 50 mL świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki TSB do poziomu OD600 od 0,01 do 0,05, a następnie powtórzyć etapy inkubacji i pomiaru. Przygotować warstwę kruszonego suchego lodu w odpowiednim naczyniu, takim jak szalka szklana, wiaderko do lodu lub lodówka turystyczna. Gdy gęstość optyczna kultur będzie zbliżać się do pożądanego punktu zbioru, należy dodać 1 mL roztworu quenchingowego do niepoddaną obróbce szalki Petriego o średnicy 35 mm i schłodzić ją na suchym lodzie przez co najmniej 5 minut.W naszym przypadku pożądanym momentem zbioru jest gęstość optyczna wynosząca około 0,4 do 0,5. Wartość ta może być jednak zmieniana w zależności od celów eksperymentu. Następnie należy umieścić stalową płytkę filtracyjną w gumowym korku i zamocować go w kolbie ssawnej podłączonej do instalacji próżniowej lub pompy próżniowej.Włącz próżnię i umieść na górze mieszaną membranę z octanu celulozy. Należy użyć filtra o tej samej średnicy co frit, aby zapewnić zebranie wszystkich komórek. Kluczowe jest jak najszybsze zebranie komórek i zatrzymanie aktywności metabolicznej, aby uzyskać obraz zawartości metabolitów w określonych warunkach.Nawet niewielkie opóźnienia mogą wpłynąć na fizjologię komórek w stanie stacjonarnym. Przy OD600 w zakresie od 0,4 do 0,5, należy użyć pipety serologicznej, aby pobrać 13 mL kultury z kolby. Próbkę należy natychmiast nanieść na filtr.Po przefiltrowaniu całej próbki należy niezwłocznie przemyć filtr nie więcej niż 5 mL lodowatego PBS, aby usunąć metabolity związane z pożywką. Następnie należy odłączyć próżnię i za pomocą sterylnej pęsety wyjąć filtr z frity. Przenieść filtr do schłodzonego wcześniej roztworu quenchującego.Inkubować filtr w roztworze gaszącym na suchym lodzie przez co najmniej 20 minut. Za pomocą sterylnej pęsety odwrócić filtr w szalce Petriego i użyć mikropipety, aby spłukać komórki z membrany do roztworu gaszącego. Resuspendować komórki w roztworze gaszącym, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej, odpornej na uderzenia probówki o pojemności 2 mL zawierającej około 100 microliters kulek krzemionkowych 0.1 mm.Przechowywać w suchym lodzie lub w temperaturze -80°C. Aby rozpocząć ekstrakcję metabolitów, najpierw rozmrozić próbki w lodzie kruszonym. Następnie zhomogenizować komórki w homogenizatorze, wykonując cztery 30-sekundowe cykle przy 6000 rpm, z dwuminutowymi przerwami na chłodzenie w suchym lodzie pomiędzy cyklami.Wiruj lizaty przez 15 minut w schłodzonej probówce do mikrocentryfugi w temperaturze 4°C z maksymalną prędkością. Po wirowaniu przenieś nadsącz do czystej probówki do mikrocentryfugi. Za pomocą mikropipety przenieś niewielką część próbki do probówki do mikrocentryfugi w celu oznaczenia ilości pozostałego peptydu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Pozostałą część próbki przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu analizy metabolitów za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas należy odnieść się do protokołu tekstowego. Mutant null CodY został wykorzystany do zbadania wyczerpania aminokwasów rozgałęzionych, ponieważ białko CodY reguluje ekspresję kilkudziesięciu genów w odpowiedzi na spadek stężenia tych składników odżywczych.Mutacja codY ma niewielki wpływ na tempo wzrostu komórek S.aureus. Spadek gęstości optycznej w 3. godzinie wskazuje na etap rozcieńczenia wstecznego, który zwiększa liczbę podwojeń komórek przed zbiorem i usuwa poprzez rozcieńczenie różne cząsteczki gromadzące się podczas wzrostu nocnego. Analiza sekwencji RNA transkryptomów obu szczepów wykazuje istotne zmiany w ekspresji genów zaangażowanych w syntezę aminokwasów z rodziny asparaginianu.Poniżej nazw genów liczby wskazują krotność zmiany ekspresji u mutanta null codY w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Po ilościowym oznaczeniu wyekstrahowanych metabolitów metodą LC-MS porównano ich zawartość w obu szczepach. Analizując wybrane związki związane z rodziną aminokwasów asparaginianowych, stwierdzono, że zawartość prekursorów, takich jak asparaginian oraz O-acetylhomoseryna, jest zmniejszona u mutanta codY.Z kolei produkty końcowe, takie jak treonina i izoleucyna, ulegają zwiększeniu. Tutaj linia przerywana wskazuje próg zmian w obfitości dla tego eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać metabolity z Staphylococcus aureus w celu ich ilościowego oznaczenia za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas.Niniejszy protokół, po odpowiedniej modyfikacji, nadaje się również do pozyskiwania metabolitów z innych gatunków bakterii. Ponieważ bakterie reagują na dynamiczne środowisko, ważne jest, aby etapy filtrowania i płukania przeprowadzać szybko, aby zminimalizować potencjalne zmiany fizjologiczne wywołane pobieraniem próbek. Zmiany te można również ograniczyć, utrzymując frit i PBS w niskiej temperaturze podczas pobierania próbek.

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Źródło: Samuels, D. J. i in. Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do analizy metabolitów gronkowca aureus. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do identyfikacji i ilościowej identyfikacji metabolitów wewnątrzkomórkowych S. aureus. Przedstawia etapy związane z ekstracją metabolitów, normalizacją peptydów, chromatografią cieczową oraz analizą spektrometriczną mas.

Podejście oparte na chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do analizy metabolitów S. aureus

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Poznaj metodę ekstrakcji i analizy metabolitów Staphylococcus aureus przy użyciu tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Technika ta pozwala badać metabolizm bakteryjny i jego związek z patogennością podczas infekcji.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Przeglądaj więcej filmów