Name: Test wiązania kazey in vitro, który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Poznaj metodę szybkiej dializy równowagowej RED do badania wiązania leków z kazeum w zmianach gruźliczych. Technika ta pozwala przewidywać penetrację leków bez użycia modeli zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X i Trius Therapeutics za dostarczenie odpowiednio bedakiliny, PA-824 (pretomanidu), AZD5847, radezolidu i tedyzolidu. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li i Danielle Weiner zapewnili wsparcie w analizie MALDI, metodach bioanalitycznych, przygotowaniu surogatu kazeum, syntezie chemicznej i izolacji kazeum królika. Praca ta została przeprowadzona dzięki finansowaniu z Fundacji Billa i Melindy Gatesów, nagrodzie # OPP1044966 i OPP1024050 dla V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, a także wspólnemu finansowaniu z Fundacji Billa i Melindy Gatesów oraz Wellcome Trust dla Centrum Doskonałości w zakresie Optymalizacji Ołowiu dla Chorób Krajów Rozwijających się dla P. Wyatta.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) za zgodą Instytutional Animal Care and Use Committee NIAID (NIH) w Bethesda, MD. Wszystkie badania z wykorzystaniem M. tuberculosis przeprowadzono w laboratorium z trzecim poziomem bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3).
1. Model zakażenia królików i pobieranie caseum
<ol>
	<li>Zainfekuj nowozelandzkie króliki białym szczepem M. tuberculosis, wykorzystując system ekspozycji aerozolowej wyłącznie przez nos, zgodnie z wcześniejszym opisem.12,13 Pozostaw infekcję do rozwoju przez 12–16 tygodni. Podaj królikom dożylnie środki uspokajające: ketaminę w dawce 35 mg/kg oraz ksylazynę w dawce 5 mg/kg, a następnie przeprowadź eutanazję przy użyciu 0,22 mL/kg pentobarbitalu sodowego i fenytoiny sodowej podawanych dożylnie i przystąp do sekcji zwłok.</li>
	<li>Za pomocą pęsety i skalpela wyjmij płuca z jamy klatki piersiowej. Z każdego płata płuca wyseparuj skalpelem poszczególne jamy oraz duże nekrotyczne ziarniniaki. Ostrożnie zeskrob caseum ze ścian jam i ziarniniaków. Zważ, zapisz i przechowuj próbki w probówkach z nakrętką o pojemności 2 mL w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Próbki zakaźnego caseum poddaj irradiacji gamma dawką 3 MegaRad na suchym lodzie, aby wyeliminować zakaźność i umożliwić bezpieczne użytkowanie w laboratorium klasy BSL-2.</li>
</ol>
2. Generowanie substytutu caseum in vitro z komórek THP-1
<ol>
	<li>Hodować monocyty THP-1 w medium RPMI 1640 (2 mM L-glutaminy i 10% płodowej surowicy bydlęcej) w kolbach do hodowli komórkowej T175 (80 mL/kolba). Inkubować kolby w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 3-4 dni.</li>
	<li>Odwirować kulturę z kolby T175 w dwóch stożkowych probówkach 50 mL przy 150 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 10 mL medium RPMI 1640.</li>
	<li>Napiperować 5 µL tej kultury do probówki 1,5 mL zawierającej 45 µL błękitu trypanu. Dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie. Przenieść 10 µL do hemocytometru i policzyć liczbę żywych monocytów THP-1 (niebarwionych) za pomocą mikroskopu świetlnego (powiększenie 10X). Obliczyć liczbę żywych komórek na 1 mL kultury. Rozcieńczyć ją medium RPMI do końcowej gęstości 1,25 x 106 komórek/mL.</li>
	<li>Nanieść 40 mL kultury na dużą płytkę do hodowli komórkowej (50 x 106 komórek/płytkę). Dodać 40 µL 100 µM PMA (fosforbul mirystonian 13-octan, przygotowany w etanolu) i pozwolić komórkom przywrzeć przez noc w inkubatorze. 
	UWAGA: Końcowe stężenie PMA wynosi 100 nM.</li>
	<li>Rozcieńczyć czysty kwas oleinowy (OA) (0,89 g/mL) w etanolu do stężenia 0,1 M (t.j. 31,7 µL OA w 968,3 µL etanolu). Rozcieńczyć ten roztwór w świeżym, uprzednio ogrzanym medium RMPI do stężenia 10 mM. Rozcieńczyć tę zawiesinę OA do 0,4 mM (końcowe stężenie robocze) w medium RPMI uprzednio ogrzanym do 37 °C.</li>
	<li>Usunąć istniejące medium i nieprzywierające komórki z płytek do hodowli komórkowej i delikatnie dodać 40 mL 0,4 mM OA do makrofagów THP-1 (THP-M). Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez noc.</li>
	<li>Użyć mikroskopu świetlnego z 40-krotnym powiększeniem, aby wizualnie potwierdzić obecność licznych wtręć ciał lipidowych w każdym THP-M. Usunąć całe medium RPMI z płytek do hodowli komórkowej i delikatnie przemyć przywierające komórki dwukrotnie roztworem buforu fosforanowego (PBS), używając pipety serologicznej 50 mL. 
	UWAGA: Ciała lipidowe pojawiają się jako małe, przejrzyste, sferyczne struktury w cytoplazmie THP-M.</li>
	<li>Dodać 40 mL 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS do każdej płytki. Inkubować przez 15 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Oddzielić makrofagi pianowate (FM) poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół nad powierzchnią całej płytki za pomocą pipety serologicznej 10-mL. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 50-mL i odwirować przy 150 x g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 10 mL PBS (trzecie przemycie PBS) i przenieść do wcześniej zważonych stożkowych probówek 15-mL. Odwirować ponownie przy 150 x g przez 5 min. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej i odrzucić.</li>
	<li>Poddać osady FM 3 cyklom zamrażania i rozmrażania w celu lizy komórek i inkubować je w temperaturze 75 °C przez 20-30 min, aby zdenaturować białka w macierzy. Przechowywać osady w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Test szybkiej dializy równowagowej (RED)
<ol>
	<li>Przygotować roztwory zapasowe wszystkich badanych związków o stężeniu 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO). Przed każdym badaniem rozcieńczyć je do roztworów roboczych o stężeniu 500 µM w DMSO.</li>
	<li>Zważyć probówkę zawierającą pellet substytutu caseum. Odjąć masę pustej probówki, aby uzyskać masę samego pelletu. Do każdej probówki dodać 2-3 metalowe kulki i za pomocą homogenizatora tkankowego przy 1 200 pociągnięciach/min przez 1 min rozbić caseum lub macierz substytutu w PBS (1:9 m/v), aby uzyskać 10-krotnie rozcieńczoną zawiesinę każdej macierzy.</li>
	<li>Do 643,5 µL homogenatu dodać 6,5 µL roztworu badanego związku o stężeniu 500 µM, aby uzyskać stężenie końcowe 5 µM (≤1% DMSO), a następnie wymieszać w wortexie.</li>
	<li>Umieścić wkłady RED w płycie podstawowej. Do komory donora (czerwony pierścień) każdego wkładu RED dodać 200 µL macierzy z dodatkiem leku, a do każdej komory odbiorczej 350 µL PBS. Przygotować 3 wkłady dla każdego badanego związku (próbki w trzech powtórzeniach). Uszczelnić płytę za pomocą przylepnej folii uszczelniającej i inkubować w 37 °C na termomikserze przy 200 rpm (1 x g) przez 4 h.</li>
	<li>Po inkubacji delikatnie wymieszać zawartość komór donora i odbiorczej, pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Odpiwetować 20 µL aliquotów homogenatu z komór donora i dodać do 20 µL czystego PBS w probówce 1,5 mL (1:1). Podobnie odpikwetować 20 µL aliquotów próbek PBS z komór odbiorczych i dodać do 20 µL czystego homogenatu (dopasowanie macierzy).8 
	UWAGA: Dopasowanie macierzy eliminuje konieczność sporządzania dwóch oddzielnych krzywych kalibracyjnych (w homogenacie i w PBS) do analizy ilościowej. Zawartość komory donora może z czasem osiadać. Przed pobraniem aliquotów delikatnie wymieszać zawartość poprzez pipetowanie.</li>
</ol>
4. Ilościowe oznaczanie LC-MS i analiza danych
<ol>
	<li>Do każdej probówki dodać 160 µL mieszaniny metanolu z acetonitrylem w stosunku 1:1 zawierającej 500 ng/mL diklofenaku lub 10 ng/mL werapamilu (standard wewnętrzny), a następnie wymieszać na wirówce wortex, aby wytrącić białka. Wir Likes w 10,000 x g przez 5 min w celu osadzenia wytrąconego materiału i przenieść nadsączniki do głębokich płytek 96-dołkowych do analizy metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas (LCMS).7</li>
	<li>Sporządzić krzywe kalibracyjne w zakresie 1-1,000 nM dla każdego badanego związku, zachowując taki sam skład macierzy jak w powyższych próbkach. Ilościowo oznaczyć stężenie badanego związku w próbkach z komór dawczej i odbiorczej przy użyciu metody LC-MS.</li>
	<li>Obliczyć frakcję nie związaną (fu) leku w rozcieńczonej macierzy, korzystając z równania 1. Obliczyć fu w nierozcieńczonej macierzy, korzystając z równania 2 (D = czynnik rozcieńczenia wynoszący 10).14 
	<img alt="Równanie dla współczynnika przepuszczalności leku, przedstawiające stosunek stężeń w komorze odbiorczej do komory dawczej." src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	<img alt="równanie nierozcieńczonego fu, wzór na korektę stężenia leku, analiza farmakologiczna" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Sprawdzić odzysk (bilans masy) każdego związku za pomocą równania 3, aby zidentyfikować związki z problemami dotyczącymi stabilności, metabolizmu lub niespecyficznego wiązania. 
	UWAGA: Odzysk zazwyczaj mieści się w przedziale od 70% do 130%.15 
	<img alt="Równanie do obliczania odzysku w eksperymencie transportu masy; wzór: Odzysk = (stosunki mas) × 100%." src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
</ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

Nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Martwicze zmiany i jamy płuc u pacjentów zakażonych gruźlicą zawierają subpopulacje bakterii, które są oporne na leczenie farmakologiczne. Jądra tych struktur są szczególnie odpowiedzialne za utrzymywanie tych przetrwałych w środowisku zewnątrzkomórkowym. 16 Uważa się, że korzystne rozmieszczenie środków przeciwbakteryjnych w tych odległych miejscach jest ważnym czynnikiem decydującym o skuteczności leków przeciwgruźliczych. Przed walidacją tego protokołu nie było dostępnych technik in vitro</...

Leczenie gruźlicy płuc wymaga skutecznego rozprowadzania leków na różne rodzaje zmian. Martwicze zmiany i jamy zawierają jądrowate centra, w których znajdują się subpopulacje bakterii tolerujących leki lub "trwałych". 1,2 Choroba jamowa wiąże się z gorszym wskaźnikiem wyleczalności i złym rokowaniem. 3,4 Poprzednie badania wykazały, przy użyciu technik ilościowych i obrazowania, że zdolność do penetracji kazeum różni się znacznie w zależności od klasy leków. 5,6 Metody te wymagają jednak użycia modeli infekcji zwierzęcych, które są powolne i żmudne. Zaprojektowano test in vitro, który mierzy wiązanie leku z kazeum ex vivo. Stwierdzono, że wiązanie to jest odwrotnie skorelowane z penetracją leku w ziarniniakach casesowatych, a zatem jest stosowane jako narzędzie predykcyjne. 7
Dializa równowagowa jest uważana za złoty standard w badaniach nad wiązaniem białek osocza. Urządzenie do szybkiej dializy równowagowej (RED) zapewnia szybki, łatwy w użyciu i niezawodny system do wykonywania takich testów. 8 Urządzenie składa się z dwóch elementów: jednorazowych, jednorazowych wkładów składających się z 2 komór oddzielonych pionowym cylindrem z półprzepuszczalnej membrany; oraz płyty bazowe wielokrotnego użytku, które mogą pomieścić do 48 wkładek jednocześnie. Membrana dializy ma wartość odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącą 8 kDa, która jest idealna do badań wiązania lek-makrocząsteczka. Wysoki stosunek powierzchni do objętości komory membranowej umożliwia szybką dializę i równowagę. Zarówno wkładki, jak i płyta podstawy zostały zatwierdzone pod kątem minimalnego niespecyficznego wiązania. Połączenie urządzenia RED z technikami bioanalitycznymi zapewnia dokładne oszacowanie niezwiązanych frakcji leków w osoczu. 8,9
Chociaż pierwotnie zaprojektowane do pomiaru wiązania białek osocza, urządzenie RED było używane w kilku badaniach nad wiązaniem tkanek przy użyciu homogenatów. 10,11 W tym protokole mierzymy wiązanie leku z caseum, martwiczymi pozostałościami usuniętymi z martwiczych zmian i jam królików zakażonych gruźlicą. Bezkomórkowy i nienaczyniowy charakter materiału caseous ułatwia homogenizację do jednorodnej zawiesiny, która jest zgodna z testem.
Biorąc pod uwagę, że caseum jest żmudne w produkcji i trudne do zdobycia, protokół został również zatwierdzony do użycia z matrycą zastępczą, która jest przygotowana z pienistych makrofagów. Makrofagi pochodzące z monocytów THP-1 są indukowane kwasem oleinowym w celu zgromadzenia wielu ciał lipidowych, które nadają im "pienisty" wygląd. Te naładowane lipidami komórki są zbierane i przetwarzane w celu wytworzenia matrycy, której używamy jako substytutu kazeum. Badanie to wykazało, że wiązanie leku z tą macierzyą zastępczą dobrze koreluje z wiązaniem z kazeum, skutecznie naśladując proces in vivo, który utrudnia penetrację leku w jądrowym rdzeniu ziarniniaków i jam.

<table><tbody><tr><td>Nowozelandzkie białe króliki</td><td></td><td></td> Covance-HN878 <td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamina) 100 mg/ml C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Ksylazyna) 100 mg/ml</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodowa) Roztwór&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>monocytowa linia komórkowa THP-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; Kolba z powłoką TC (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 podłoże bez glutaminy</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyklonowa płodowa surowica bydlęca, napromieniowana promieniami gamma&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclon L-glutamina, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC naczynie, 145 mm x 20 mm, wentylowana</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific ICN15178101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Płyta bazowa wielokrotnego użytku</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do urządzenia Pierce RED, 50 sztuk w opakowaniu</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do usuwania wkładek Pierce RED&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka samoprzylepna</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma 472301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek werapamilu</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa diklofenaku</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Akcesoria do homogenizatora młynka do koralików, metalowe kulki luzem</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Naświetlacz</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; Jednorazowe hemacytometry C-Chip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła pionowego</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binarny system chromatografii cieczowej</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

test wiązania kazey in vitro, który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Wyeliminowanie gruźlicy wymaga schematów leczenia, które mogą przenikać przez wiele warstw skomplikowanych zmian w płucach. Dystrybucja leku w jądrzastych rdzeniach jam i zmian chorobowych jest szczególnie istotna, ponieważ są one siedliskiem subpopulacji bakterii tolerujących leki, powszechnie określanych również jako trwałe. Istniejące metody pomiaru przenikania leków do zmian gruźliczych wymagają kosztownych i czasochłonnych badań farmakokinetycznych in vivo w połączeniu z technikami bioanalitycznymi lub obrazowania. Pomiar in vitro wiązania leku z makrocząsteczkami kazeum został zaproponowany jako alternatywa dla takich technik, ponieważ wiązanie to utrudnia bierną dyfuzję cząsteczek leku przez kazeum. Dializa równowagowa szybka to szybki i niezawodny system do wykonywania badań wiązania białek osocza i tkanek. W tym protokole użyliśmy urządzenia do szybkiej dializy równowagi (RED) do pomiaru wiązania leku z homogenatami kazeum, które są wycinane ze zmian i jam królików zakażonych gruźlicą. Protokół opisuje również, w jaki sposób wygenerować macierz zastępczą z makrofagów THP-1 obciążonych lipidami, które można zastosować zamiast kazeum. Ten test wiązania kazeum/surogatu jest ważnym narzędziem w odkrywaniu leków na gruźlicę i może być dostosowany do badania dystrybucji leku w zmianach lub ropniach spowodowanych innymi chorobami.

Stosując niniejszy protokół, przetestowaliśmy setki związków opracowywanych jako leki przeciwgruźlicze pod kątem ich przewidywanej wydajności w przenikaniu przez caseum. Rysunek 1 wizualizuje podstawowe założenia analizy RED. Membrana dializacyjna wkładów RED umożliwia dyfuzję niezwiązanych małych cząsteczek z dołka donora do dołka odbiorcy, aż do osiągnięcia stanu równowagi między oboma przedziałami. Małe cząsteczki związane z makrocząsteczkami, takimi jak białka lub lip...

Tutaj opisujemy metodę szybkiej dializy równowagowej (RED) do pomiaru wiązania leku z kazeum ze zmian i jam gruźlicy płuc. Protokół jest również stosowany z pienistą matrycą pochodzącą z makrofagów, która jest skutecznym substytutem kazeum.

Test wiązania kazey in vitro, który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przewidywanie wiązania leków z caseum pochodzącym z zmian gruźliczych. Metoda ta może pomóc w określeniu, jak skutecznie środki przeciwmikrobowe przenikają do rdzenia kazeozowego zmian nekrotycznych bez użycia modeli zwierzęcych i kosztownych technik obrazowania. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy w zakresie bezpośredniego odkrywania leków na gruźlicę, może być ona również zastosowana w innych chorobach charakteryzujących się tworzeniem zmian lub ropni, w których penetracja leku jest ograniczona.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ spójność w wykonaniu protokołu zapewni powtarzalność danych pomiędzy eksperymentami. Dzisiaj zaprezentuję procedurę hodowli komórkowej oraz przygotowanie macierzy zastępczej. Hsin-pin, współpracownik naukowy z naszego laboratorium, zaprezentuje właściwy test.Hodować monocyty THP-1 w kolbach do hodowli komórkowej T-175 zawierających 80 mL pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 2 mM l-glutaminy i 10% płodowej surowicy bydlęcej. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez trzy do czterech dni. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie około 70%, przenieść je do dwóch probówek stożkowych o pojemności 50 mL i odwirować z prędkością 150 ×g przez pięć minut.Po wirowaniu odlej nadsącz i zawieś osad w 10 mL medium RPMI 1640. Przenieś 5 µL tej hodowli do probówki 1,5 mL zawierającej 45 µL błękitu trypanu. Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety.Przenieś 10 µL do hemocytometru. Następnie, korzystając z mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 10x, policz liczbę żywych monocytów THP-1. Po określeniu liczby żywych komórek na mililitr hodowli, rozcieńcz ją w pożywce RPMI do końcowej gęstości 1,25 × 10⁶ komórek na mililitr.Do probówki dodać 40 µL PMA o stężeniu 100 µM. Następnie przenieść hodowlę na płytkę do hodowli komórek o wymiarach 140 × 20 mm. Pozostawić komórki w inkubatorze na noc w celu ich adhezji.Następnie rozcieńcz czysty kwas iliakowy w etanolu do stężenia 0,1 M. W tym celu 31,7 µL kwasu iliakowego rozpuszcza się w 968,3 µL etanolu. Rozcieńcz roztwór w świeżym, uprzednio ogrzanym medium RPMI do stężenia 10 mM.Rozcieńcz zawiesinę kwasu iliacowego do końcowego stężenia roboczego 0,4 mM w pożywce RPMI uprzednio ogrzanej do 37 °C. Rozcieńczenie kwasu iliacowego w ogrzanej pożywce RPMI jest kluczowe, aby zapewnić odpowiednie rozpuszczenie kwasu tłuszczowego w roztworze wodnym. Za pomocą pipety usuń istniejącą pożywkę oraz nieprzylegające komórki z płytki do hodowli komórek zawierającej makrofagi THP-1, a następnie delikatnie dodaj 40 mL 0,1 mM kwasu iliacowego.Inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze przez noc. Następnego dnia, użyć mikroskopu świetlnego z powiększeniem 40x, aby wizualnie potwierdzić obecność licznych inkluzji kropel lipidowych w makrofagach THP. Krople lipidowe widoczne są jako małe, przeźroczyste, sferyczne struktury w cytoplazmie.Usunąć całe pożywkę RPMI z płytki hodowlanej i delikatnie przemyć przylegające komórki dwukrotnie PBS-em, używając pipety serologicznej 50 mL. Dodać do płytki 40 mL 5 milimolarnego EDTA i PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie, aby odseparować makrofagi piankowate, należy użyć pipety serologicznej 10 mL i kilkakrotnie pipetować zawiesinę z całej powierzchni płytki. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 50 mL, a następnie odwirować ją z prędkością 150 ×g przez pięć minut.Po wirowaniu resuspender osad komórkowy w 10 mL PBS i przenieść go do wcześniej zważonej stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Ponownie odwirować z prędkością 150 ×g przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać nadosad za pomocą pipety serologicznej i go usunąć.Poddać pelety makrofagów pienistych trzem cyklom zamrażania i rozmrażania. Naprzemienne inkubowanie w suchym lodzie oraz w temperaturze 37°C na bloku grzewczym w celu lizy komórek. Następnie inkubować je w temperaturze 75°C przez 20 do 30 minut, aby zdenaturować białka w macierzy.Przechowywać palety w temperaturze -20 °C do momentu ich użycia. Test przy użyciu urządzeń do szybkiej równowagi (Rapid Equilibrium Devices, RED), przedstawiony w tej części filmu, można przeprowadzić z wykorzystaniem przygotowanej przez nas macierzy zastępczej lub materiału z uszkodzeń tkanek królika zainfekowanych TB. W tym przypadku zaprezentujemy test wykonany na macierzy zastępczej.Przygotować 10 mM roztwory zapasowe wszystkich badanych związków. W tym przypadku moksifloksacynę przygotowano w DMSO. Przed każdym testem rozcieńczyć je do 500 µM roztworów roboczych w DMSO.Zważ probówkę zawierającą wycięty caseum lub substytut palety. Odejmij wagę pustej probówki, aby uzyskać masę samego caseum lub substytutu palety. Do każdej probówki dodaj dwie do trzech metalowych kulek, a następnie dodaj PBS w stosunku W do V wynoszącym jeden do dziewięciu. Za pomocą wstrząsarki wortex rozbij caseum lub macierz substytutu przez jedną minutę.Dodaj 6,5 µL przygotowanego związku testowego do 643,5 µL homogenatu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 µM, a następnie wymieszaj na wirówce typu vortex. Następnie umieść czerwone wkładki w płytce podstawowej.Przygotować wkłady dla każdego testu, wprowadzając każdy związek w trzech powtórzeniach. Do czerwonej komory donora każdego czerwonego wkładu dodać 200 µL macierzy z dodatkiem leku. Następnie do każdej komory odbiorczej dodać 350 µL PBS.Na płytkę nałożyć uszczelkę samoprzylepną i inkubować w temperaturze 37 °C w mikserze termicznym przy 200 obr./min przez cztery godziny. Po inkubacji delikatnie wymieszać zawartość komór dawcy i biorcy, pipetując ciecz w górę i w dół dwa do trzech razy. Przenieść 20 µL homogenatu z każdej z komór dawcy do 20 µL czystego PBS w probówce 1,5 mL.Podobnie, przenieś 20 µl aliquotów próbek PBS z komór odbiorczych do 20 µl czystego homogenatu. Dopasowanie macierzy eliminuje konieczność sporządzania dwóch oddzielnych krzywych wizji barwnej w homogenacie i PBS do analizy ilościowej. Zawartość komory dawczej z czasem tworzy osad.Przed pobraniem alikwotów delikatnie wymieszać zawartość metodą pipetowania. Do każdej probówki dodać 160 µL mieszaniny metanolu i acetonitrylu w stosunku 1:1, zawierającej 500 ng/mL diklofenaku lub 10 ng/mL werapamilu jako standard wewnętrzny. Wymieszać w wstrząsacu w celu wytrącenia białek.Wiruj próbki przy 10000 x g przez pięć minut, aby osadzić precipitates, a następnie przenieś nadsączniki do płytek głębokich 96-dołkowych w celu analizy metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas, LCMS. Sporządź krzywe kalibracyjne w zakresie od 1 do 1000 nanomolars dla każdego związku testowego, wykonując rozcieńczenia roztworu stokowego związku przy zachowaniu takiego samego składu matrycy jak w próbkach. Oznacz stężenie związku testowego w próbkach z komór dawcy i biorcy przy użyciu metody LCMS.Oblicz frakcję nie związaną, lub fu, leku oraz rozcieńczonego matriksu, korzystając z przedstawionego tutaj równania pierwszego. Następnie oblicz fu w nierozcieńczonym matriksie, korzystając z równania drugiego, gdzie D jest równe czynnikowi rozcieńczenia 10. Na koniec sprawdź odzysk lub bilans masy każdego związku, korzystając z przedstawionego tutaj równania trzeciego.W celu zidentyfikowania związków z problemami dotyczącymi stabilności, metabolizmu lub niespecyficznego wiązania. Należy zauważyć, że odzysk zazwyczaj mieści się w przedziale od 70% do 130%. Protokół opisany w tym filmie był stosowany do testowania setek związków rozwijanych jako leki przeciwgruźlicze pod kątem ich przewidywanej wydajności w penetracji caseum.Membrana dializacyjna czerwonych wkładów umożliwia dyfuzję niezwiązanych małych cząsteczek z dołka donora do dołka odbiorcy, aż do osiągnięcia stanu równowagi między obydwoma przedziałami. Małe cząsteczki związane z makrocząsteczkami, takimi jak białka lub lipidy, zostają zatrzymane w dołku donora. Analiza ilościowa próbek z obu przedziałów pozwala na obliczenie frakcji niezwiązanej, fu, każdej małej cząsteczki w caseum lub macierzy zastępczej, jak pokazano tutaj.Im wyższa wartość fu, tym intensywniej lek dyfunduje do caseum. Desorpcja i jonizacja laserowa wspomagana macierzą, czyli obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, została przeprowadzona dla sześciu leków. Przedstawiono mapy jonowe reprezentatywnych zmian w płucach, gdzie intensywność sygnału jest wskazana przez pasek skali po lewej stronie.Poniżej przedstawiono barwienia hematoksyliną i ESN lub HNE sąsiadujących przekrojów. Czarno-białe linie konturowe podkreślają twarogowate centrum każdej zmiany. Dane te są zgodne z hipotezą, że cząsteczki leku dyfundują do zewnętrznej części twarogu z jego styku z warstwami komórkowymi zmiany.Wiązanie z makromolekułami serowatymi sekwestruje lek, zapobiegając jego dalszej dyfuzji do rdzenia serowatego. Jak pokazano tutaj, macierz przygotowana z piankowatych makrofagów pochodzących z linii THP-1 jest skutecznym zamiennikiem prawdziwego seroma. Wiązanie w obu macierzach wykazuje silną korelację ze sobą.Zastosowanie tej procedury pozwala na jednoczesne przetestowanie kilku związków, co pozwala oszczędzić czas i zasoby. Metodę tę nazywamy testowaniem kasetowym. Od momentu opracowania ten test był wykorzystywany w wielu programach optymalizacji wiodących związków w procesie odkrywania leków przeciwgruźliczych.Należy pamiętać, że praca z mikrobakteriami i próbkami tkanek zakażonych gruźlicą może być niezwykle niebezpieczna, dlatego przed manipulowaniem zakażonymi próbkami osłonek w laboratorium BSL2 należy zastosować zwalidowany protokół sterylizacji tkanek z wykorzystaniem promieniowania gamma. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Sarathy, J. P. i wsp. Test wiązania kazeum in vitro , który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia test in vitro do pomiaru wiązania leku z kazeum ze zmian gruźlicy przy użyciu szybkiej dializy równowagowej. Przedstawiono w nim etapy przygotowywania zawiesin kazeum, wykonywania dializy i obliczania niezwiązanej frakcji leku w celu przewidzenia przenikania leku do kazeum.

Pomiar wiązania leku z kazeum ze zmian gruźliczych za pomocą metody szybkiej dializy równowagowej

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie.  CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).

Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Poznaj metodę szybkiej dializy równowagowej RED do badania wiązania leków z kazeum w zmianach gruźliczych. Technika ta pozwala przewidywać penetrację leków bez użycia modeli zwierzęcych.

Test wiązania kazey in vitro, który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych

Przeglądaj więcej filmów