Test 5-mC Dot Blot określający ilościowo poziom metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie poziomu 5-metylocytozyny podczas dedyferencjacji chondrocytów. Ta metoda pokazuje, że może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w leczeniu ubytków chrząstki na bazie komórek, takie jak autologiczna implantacja chondrocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to niezawodna, prosta i szybka metoda wykrywania ogólnego poziomu metylacji DNA w celu oceny fenotypu chondrocytów.

Implikacje tej technologii są standardowe dla naszego udziału w autologicznej implantacji chondrocytów, ponieważ metylacja DNA podczas dedyferencjacji chondrocytów jest główną przeszkodą w leczeniu autologicznych implantacji chondrocytów w przypadku wad chrząstki. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w poziomy metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów, może być również stosowana w innych badaniach chorób, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeczytaliśmy protokoły w odniesieniach do metody dot blot.

Proszę pokazać, że demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ stany kropki są trudne do nazwania. Genomowe DNA powinno być denaturowane, a następnie seryjnie rozcieńczane. Następnie wsparty na dodatnio naładowanej membranie nylonowej.

Procedury zademonstruje Zhaofeng Jia, doktorant z naszego laboratorium. Tkanki chrząstki stawowej wykorzystane w tym badaniu zostały wyizolowane ze stawów kolanowych pacjentów dawców po urazie. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój chrząstkę w kostkę na jeden do dwóch milimetrowych kawałków.

Następnie dodaj jeden miligram na mililitr kolagenazy II i DMEM do zmielonej chrząstki. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin, aby strawić chondrocyty. Następnego dnia przefiltruj powstałą zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów.

Zakręć komórkami. Odrzucić supernatant, dodać PBS i ponownie odwirować. Policz komórki za pomocą hemocytometru.

I nasiona o gęstości od 20 000 do 30 000 komórek na centymetr kwadratowy i DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliną streptomycyną. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zbierz komórki zlewające się za pomocą 0,25% trypsyny EDTA.

I ponownie platerować z gęstością 6 600 komórek na centymetr kwadratowy. Hoduj chondrocyty w monowarstwach przez maksymalnie sześć pasaży i oceniaj w pasażach pierwszym, drugim, trzecim, czwartym i piątym. Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz komórki przez trypsynizację i odwirowanie.

Następnie ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy na 10 milionów komórek przez pipetowanie i szybką inwersję. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać proteinazę K w stężeniu 160 mikrogramów na mililitr lizatu komórkowego i energicznie odwrócić mieszaninę.

Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Do każdej próbki dodać jedną objętość fenolu nasyconego Tris pH 7,9 do chloroformu i alkoholu izoamylowego. Dokładnie wstrząsnąć próbką ręcznie przez około 20 sekund.

Odwirować próbki w temperaturze pokojowej 13 000 razy G przez pięć minut. Usuń górną fazę wodną i przenieś do świeżej probówki. Aby usunąć fenol, dodaj równą objętość chloroformu do każdej probówki.

Potrząśnij ręką i odkręć. Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki. Dodać 0,1 objętości próbki o trzech molowych octanie sodu o pH ósmym i dwie objętości 100% etanolu.

Przechowuj probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc, aby wytrącić genomowe DNA. Następnego dnia odwiruj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 16 000 razy G, aby uzyskać granulki genomowego DNA. Umyj próbki 70% etanolem.

I wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty w temperaturze 13 000 razy G. Ostrożnie usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu osad DNA. Ponownie zawiesić DNA w 10 milimolowym tris pH ośmiu 0,1 milimolowym EDTA. Rozpocznij tę procedurę od denaturacji wyizolowanego DNA w 0,1-molowym wodorotlenku sodu przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Zneutralizuj DNA za pomocą jednego molowego octanu amonu na lodzie. A następnie rozcieńczyć dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną. Najważniejszym krokiem w testach igłowych jest plamienie próbek i pamiętaj, aby robić to powoli i ostrożnie.

Spróbuj zminimalizować każdą zauważoną tablicę do trzech do czterech milimetrów średnicy. Używając końcówki pipety z wąskimi ustami, ostrożnie umieść dwa mikrolitry seryjnie rozcieńczonego genomowego DNA na dodatnio naładowanej nylonowej membranie w środku siatki. Osusz membranę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał, mocząc membranę w 5% BSA w TBST na 10-centymetrowej szalce Petriego przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Po godzinie umyj membranę trzy razy w TBST przez pięć minut za każdym razem. Inkubować błonę z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-5-metylocytozyny w TBST w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia umyj membranę trzy razy w TBST przez pięć minut za każdym razem. Następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym, peroksydazą chrzanową sprzężoną z owczą immunoglobuliną przeciw mysim G w TBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po umyciu membrany w TBST jak poprzednio, dodać substrat enzymatyczny do membrany i inkubować przez pięć do 10 minut.

Na koniec zwizualizuj sygnał przeciwciała wtórnego za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Chondrocyty hodowane w monowarstwie do pasażu szóstego wykazywały postępujące zmiany fenotypowe, które stawały się mocno ściśnięte i spłaszczone wraz z kolejnymi pasażami. Ta zmiana morfologii jest typowa dla procesu dedyferencjacji chondrocytów.

Genomowe DNA wyizolowano z chondrocytów po różnej liczbie pasaży, a poziomy metylacji DNA oceniano za pomocą testu dot blot specyficznego dla 5-metylocytozyny. Intensywność kropek analizowano następnie za pomocą obrazu J. Stopniowo podwyższone poziomy metylocytozyny zaobserwowano przy przedłużonej subkulturze, co sugeruje związek między ogólnie zwiększonymi poziomami metylacji a dedyferencjacją chondrocytów. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o maksymalizacji stężenia i czystości genomowego DNA. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie machinacji genomowego DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak chondrocyty dedyferencjacji w monokulturze. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się autologiczną implantacją chondrocytów do oceny obróbki DNA chondrocytów i określenia fenotypu chondrocytów w leczeniu wad chrząstki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać plamy punktowej 5-metylocytozyny do wykrywania zdegenerowanej dźwigni machinacji w celu oceny fenotypu chondrocytów. Nie zapominaj, że praca z fenolem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić rękawice.