Name: Test 5-mC Dot Blot określający ilościowo poziom metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę 5-mC dot blot do ilościowego oznaczania metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro. Technika ta umożliwia szybką i niezawodną ocenę fenotypu komórek chrzęstnych w leczeniu ubytków chrząstki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące granty: Chińska Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81572198; Nr 81260161; Nr 81000460); Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong, Chiny (nr 2015A030313772); Projekt finansowany przez Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (nr 2013M530385); Fundacja Badań Medycznych Prowincji Guangdong, Chiny (nr A2016314); Projekty naukowo-technologiczne w Shenzhen (nr JCYJ20160301111338144; Nie. JSGG20151030140325149; Nie. JSGG20140519105550503; Nr GJHZ20130412153906739; Nie. JCYJ20140414170821160; Nr JCYJ20140414170821200).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Człowieka Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen.
1. Pobieranie tkanki chrząstki stawowej człowieka i hodowla chondrocytów
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną. Przygotuj 1 mg/ml kolagenazy II, 0,25% trypsyny-EDTA, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i sitko do komórek (nylon 40 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie tkanki chrząstki stawowej człowieka
	<ol>
		<li>Izolować chrząstkę stawową ze stawów kolanowych pacjentów dawców po urazie. Uzyskaj świadomą zgodę od wszystkich uczestników.</li>
		<li>Chrząstkę pokroić w kostkę na1-2 mm 3 kawałki za pomocą sterylnego skalpela i trawić chondrocyty z mielonej chrząstki za pomocą 1 mg/ml kolagenazy II w DMEM w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.</li>
		<li>Przefiltrować powstałą zawiesinę komórek przez sitko do komórek (40 μm) i przemyć dwukrotnie PBS.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i nasion o gęstości 20 000-30 000 komórek/cm2 w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
		<li>Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednowarstwowa ekspansja chondrocytów
	<ol>
		<li>Zbierz sub-konfluentne komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i ponownie płytkuj z gęstością 6,600 komórek/cm2. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Hoduj chondrocyty w monowarstwach przez maksymalnie sześć pasaży i oceniaj w pasażach 1, 2, 3, 4 i 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja genomowego DNA (gDNA)
<ol>
	<li>Zebrać komórki i ponownie zawiesić w 500 μl buforu do lizy (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg/ml RNazy A) na 10 milionów komórek. Zawiesić komórki przez pipetowanie i szybkie odwrócenie, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać proteinazę K o stężeniu 160 μg/ml lizatu komórkowego i energicznie odwrócić mieszaninę. Inkubować 6 godzin w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Dodać jedną objętość Tris pH 7,9 nasyconego fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) do próbki. Dokładnie wstrząsnąć lub wstrząsnąć próbkę ręcznie przez około 20 sekund.</li>
	<li>Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy stężeniu 13 000 × g. Usunąć górną fazę wodną i przenieść warstwę do świeżej probówki.</li>
	<li>Ekstrahować z równą objętością chloroformu w celu usunięcia fenolu i przeniesienia górnej fazy wodnej do świeżej probówki.</li>
	<li>Wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości próbki 3 M octanu sodu o pH 8,0 i 2 objętości 100% etanolu.</li>
	<li>Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C przez noc w celu wytrącenia gDNA.</li>
	<li>Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 16 000 x g w celu osadzenia gDNA.</li>
	<li>Przemyć próbkę trzykrotnie 70% etanolem i odwirować w temperaturze 4 °C przez 2 minuty przy 13 000 x g.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, a następnie wysuszyć na powietrzu. Ponownie zawiesić DNA w 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.</li>
</ol>
3. Profilowanie metylacji DNA
<ol>
	<li>Użyj zestawu do metylacji DNA, aby przeprowadzić reakcję konwersji wodorosiarczynu, używając łącznie 500 ng genomowego DNA, zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 10 μl buforu elucyjnego (50 ng/μl).</li>
	<li>Wykonaj profilowanie metylacji DNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
4. Analiza plam punktowych
<ol>
	<li>Denaturować wyizolowany DNA (1 mg na próbkę) w 0,1 M NaOH przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Zneutralizować DNA za pomocą 1 M NH4OAc na lodzie, a następnie rozcieńczyć dwukrotnie. Umieścić 2 μl seryjnie rozcieńczonego genomowego DNA na błonie N+.</li>
	<li>Osuszyć membranę w temperaturze 80 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał poprzez namoczenie błony N+ w 5% BSA w TBS-T przez 1 godzinę. Użyj 10 cm szalki Petriego jako komory reakcyjnej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po trzykrotnym przemyciu 5 minut w TBST, inkubować błonę z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-5-metylocytozyny (5-mC) (1:1,000) w TBS-T w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemyć błonę przez 5 minut trzykrotnie w TBS-T, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym, sprzężoną z HRP owczą immunoglobuliną przeciw-mysią G (IgG) (1:5 000) w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę przez 5 minut trzykrotnie w TBS-T.</li>
	<li>Dodaj substrat enzymatyczny do błony i inkubuj przez 5-10 minut. Zwizualizuj sygnał przeciwciał drugorzędowych za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation%3A+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li>
<li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).</li>
<li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li>
<li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li>
<li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li>
<li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li>
<li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li>
<li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states%2C+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li>
<li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dedyferencjacja chondrocytów in vitro poważnie pogarsza wynik ACI w leczeniu naprawy ubytków chrząstki11,12. Aby zoptymalizować wyniki ACI, ważne jest, aby unikać stosowania niezróżnicowanych chondrocytów13. Badania sugerują, że ogólny poziom metylacji DNA jest związany z zakresem dedyferencjacji chondrocytów 4,6. Dlatego konieczne jest opracowanie niezawodnej i szybkiej m...

Autologiczna implantacja chondrocytów (ACI) jest stosunkowo nową, najnowocześniejszą procedurą leczenia wad chrząstki stawowej1,2. Jednym z kluczowych etapów ACI jest amplifikacja chondrocytów za pomocą monowarstwowej hodowli in vitro. Podczas amplifikacji chondrocyty szkliste łatwo tracą swój fenotyp i ulegają odróżnicowaniu, co jest niepożądane w leczeniu ACI3,4. Aby zoptymalizować wyniki leczenia ACI, przed replantacją należy określić stopień odróżnicowania chondrocytów. Konieczne jest ustanowienie ekonomicznego i szybkiego sposobu określania statusu chondrocytów. Ostatnio wiele uwagi przyciągnął związek między metylacją DNA a dedyferencjacją chondrocytów4,5,6. Metylacja DNA to proces, w którym grupy metylowe są dodawane do DNA, w wyniku czego dochodzi do konwersji reszt cytozyny do 5-metylocytozyny (5-mC).
Aby wyjaśnić biologię metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów, pierwszym krokiem jest ocena poziomu metylacji DNA chondrocytów, co do tej pory okazało się wyzwaniem. Sekwencjonowanie genomu wodorosiarczynu jest najczęściej stosowaną techniką analizy metylacji DNA7,8. W tym teście konwersja wodorosiarczynu powoduje degradację DNA, a zatem do testu należy dostarczyć znaczną ilość próbki. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) została również wykorzystana do ilościowego określenia globalnych poziomów metylacji DNA9,10. Jednak analiza HPLC wymaga trawienia genomowego DNA. Ponadto potrzebne są zaawansowane i drogie instrumenty eksperymentalne. Dlatego oprócz wysokich kosztów te procedury eksperymentalne są czasochłonne. Przeciwciała anty-5-mC stały się obecnie dostępne na rynku, co stworzyło możliwość immunologicznego oczyszczenia genomowego DNA zawierającego 5-mC ze złożonych genomów.
W tym raporcie wyodrębniliśmy genomowe DNA z chondrocytów hodowanych w serii kultur jednowarstwowych. Zastosowaliśmy test dot blot do oceny zawartości 5-mC w ludzkich chondrocytach o różnej liczbie pasaży. Odkryliśmy, że zawartość 5-mC była zwiększona w wysoce odróżnicowanych chondrocytach w porównaniu z chondrocytami z dedyferencjacją o niskim stopniu nasilenia. Dodatkowo zidentyfikowaliśmy związek między stanem odróżnicowania a poziomami 5-mC. Na koniec poinformowaliśmy, że zmiany w zawartości 5-mC były związane z fenotypem chondrocytów. Dlatego test 5-mC dot blot jest niezawodną, prostą i szybką metodą wykrywania poziomu metylacji DNA w chondrocytach.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Inc.</td><td>11965&ndash; 092</td><td>Ciepły w 37 & deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>D-PBS, wolne od Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1% Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Mallinckrodt</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Sigma</td><td>I-3643</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Gibco BRL</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Gibco BRL</td><td>24568-2</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE&nbsp;</td><td>Bio Whittaker</td><td>16-011V</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Gibco BRL</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Biosharp Inc.</td><td>BL514A</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Biotoppped Inc.</td><td></td><td></td>C58H114O26</tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant Inc.</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td></td></tr><tr><td>Talerz Falcon 100 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>TPP AG</td><td>91050</td> Wirówka szybkoobrotowa <td>sterylizowana promieniami gamma</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>MIULAB</td><td>MTH-100</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator komórek dwutlenku węgla</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>System analizy chemicznej</td><td>UVITEC Cambridge</td><td>ALLIANCE</td><td></td></tr></tbody></table>

test 5-mc dot blot określający ilościowo poziom metylacji dna w dedyferencjacji chondrocytów in vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Dedyferencjacja chondrocytów szklistych na chondrocyty fibroblastyczne często towarzyszy jednowarstwowej ekspansji chondrocytów in vitro. Globalny poziom metylacji DNA chondrocytów jest uważany za odpowiedni biomarker utraty fenotypu chondrocytów. Jednak wyniki oparte na różnych metodach eksperymentalnych mogą być niespójne. Dlatego ważne jest, aby ustalić precyzyjną, prostą i szybką metodę ilościowego określania globalnych poziomów metylacji DNA podczas dedyferencjacji chondrocytów.
Obecne techniki analizy metylacji całego genomu w dużej mierze opierają się na sekwencjonowaniu genomu wodorosiarczynowego. Ze względu na degradację DNA podczas konwersji wodorosiarczynu, metody te zazwyczaj wymagają dużej objętości próbki. Inne metody stosowane do ilościowego określania globalnych poziomów metylacji DNA obejmują wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Jednak HPLC wymaga całkowitego trawienia genomowego DNA. Ponadto zbyt wysoki koszt urządzeń HPLC ogranicza szersze zastosowanie HPLC.
W tym badaniu, genomowe DNA (gDNA) zostało wyekstrahowane z ludzkich chondrocytów hodowanych z różną liczbą pasaży. Poziom metylacji gDNA wykryto za pomocą testu dot blot specyficznego dla metylacji. W tym podejściu dot blot mieszanina gDNA zawierająca metylowane DNA, które miało zostać wykryte, została zauważona bezpośrednio na błonie N+ jako kropka wewnątrz wcześniej narysowanego okrągłego wzoru matrycy. W porównaniu z innymi metodami blottingu opartymi na elektroforezie żelowej i innymi złożonymi procedurami blottingu, metoda dot blot pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu. Ponadto dot blot może wykrywać ogólny poziom metylacji DNA za pomocą dostępnego na rynku przeciwciała 5-mC. Odkryliśmy, że poziom metylacji DNA różnił się między subkulturami jednowarstwowymi, a zatem może odgrywać kluczową rolę w dedyferencjacji chondrocytów. Plama punktowa 5 mC jest niezawodną, prostą i szybką metodą wykrywania ogólnego poziomu metylacji DNA w celu oceny fenotypu chondrocytów.

Chondrocyty hodowano w monowarstwie do 6. pasażu (P6). Chondrocyty wykazywały postępujące zmiany fenotypowe wraz z kolejnymi pasażami hodowli monowarstwowej. Morfologia chondrocytów w pasażu P0 była okrągła, natomiast wraz z kolejnymi pasażami aż do P6 komórki stawały się silnie ściśnięte i spłaszczone (Rysunek 1). Ta zmiana morfologii jest typowa dla procesu dedyferencjacji chondrocytów. Jednocześnie wyniki mapy ciepła wskazały, że ogólny poziom metylacji miejsc CpG wzró...

Przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania metylacji DNA na podstawie plamy punktowej 5-metylocytozyny (5-mC). Określiliśmy poziomy 5-mC podczas dedyferencjacji chondrocytów. Ta prosta technika może być wykorzystana do szybkiego określenia fenotypu chondrocytów w leczeniu ACI.

Test 5-mC Dot Blot określający ilościowo poziom metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oznaczenie poziomu 5-metylocytozyny podczas dedyferencjacji chondrocytów. Przedstawiona metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące leczenia ubytków chrząstki opartych na komórkach, takich jak autologiczna implantacja chondrocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona wiarygodną, prostą i szybką metodę wykrywania ogólnego poziomu metylacji DNA w celu oceny fenotypu chondrocytów.Zastosowanie tej technologii jest kluczowe dla naszej pracy nad autologiczną implantacją chondrocytów, ponieważ metylacja DNA podczas dedyferencjacji chondrocytów stanowi główną przeszkodę w leczeniu ubytków chrząstki za pomocą tej metody. Choć technika ta pozwala na analizę poziomu metylacji DNA w procesie dedyferencjacji chondrocytów, może ona zostać zastosowana również w innych badaniach nad chorobami, takimi jak zwyrodnienie stawów. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas analizy protokołów metody dot blot opisanych w literaturze przedmiotu.Zaprezentowanie tej metody jest kluczowe, ponieważ określenie stanów w technice dot blot jest trudne. DNA genomiczne należy zdenaturować, a następnie poddać rozcieńczeniom seryjnym. Następnie należy je nanieść na dodatnio naładowaną membranę nylonową.Procedury zaprezentuje Zhaofeng Jia, doktorant z naszego laboratorium. Tkanki chrząstki stawowej wykorzystane w niniejszym badaniu zostały wyizolowane ze stawów kolanowych pacjentów-dawców po urazie. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój chrząstkę na kawałki o wymiarach od 1 do 2 mm³.Następnie do posiekanej chrząstki należy dodać kolagenazę II w stężeniu 1 mg/mL oraz DMEM. Próbkę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 12 do 16 godzin w celu strawienia chondrocytów. Następnego dnia otrzymaną zawiesinę komórkową filtruje się przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm.Odwiruj komórki. Odlej nadsącz, dodaj PBS i ponownie odwiruj. Policz komórki za pomocą hemocytometru.Następnie wysiać komórki z gęstością od 20 000 do 30 000 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Zebrać subkonfluentne komórki, używając 0,25% trypsyny EDTA.Następnie wysiać komórki ponownie z gęstością 6 600 komórek na centymetr kwadratowy. Hodować chondrocyty w monowarstwach do sześciu pasaży i przeprowadzić ocenę w pasażach pierwszym, drugim, trzecim, czwartym i piątym. Aby rozpocząć tę procedurę, zebrać komórki poprzez trypsynizację i wirowanie.Następnie resuspendować komórki w 500 µL buforu do lizy na 10 milionów komórek, pipetując i szybko odwracając naczynie. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Dodać proteinazę K w stężeniu 160 µg/mL lizatu komórkowego i energicznie wymieszać przez odwracanie.Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 55 °C. Do każdej próbki dodać taką samą objętość nasyconego fenolu w chloroformie i alkoholu izoamylowym w buforze Tris pH 7.9. Próbkę dokładnie wstrząsnąć ręcznie przez około 20 sekund.Wirować próbki w temperaturze pokojowej przy 13 000 ×g przez pięć minut. Odpić górną fazę wodną i przenieść ją do nowej probówki. Aby usunąć fenol, dodać do każdej probówki taką samą objętość chloroformu.Wstrząsnąć ręcznie, a następnie odwirować. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. Dodać 0,1 objętości próbki octanu sodu 3 M o pH 8 oraz dwie objętości 100% etanolu.Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C przez noc, aby wytrącić genomowe DNA. Następnego dnia odwirować próbki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 ×g w celu osadzenia genomowego DNA. Przemyć próbki 70% etanolem.Następnie odwiruj w temperaturze 4 °C przez dwie minuty przy 13 000 ×g. Ostrożnie usuń nadsącz i wysusz osad DNA na powietrzu. Rozpuść DNA w 10 mM Tris pH 8,0 oraz 0,1 mM EDTA. Rozpocznij tę procedurę od denaturacji wyizolowanego DNA w 0,1 M wodorotlenku sodu przez 10 minut w temperaturze 95 °C.Zneutralizuj DNA za pomocą jednomolowego octanu amonu w lodzie. Następnie rozcieńcz próbkę dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną. Najbardziej krytycznym etapem w analizie dot blot jest nakładanie próbek; należy to robić powoli i ostrożnie.Należy dążyć do tego, aby każda naniesiona plamka miała średnicę od trzech do czterech milimetrów. Używając końcówki do pipety o wąskim wylocie, ostrożnie nanieść 2 µL seryjnie rozcieńczonego DNA genomowego na dodatnio naładowaną membranę nylonową w centrum siatki. Membranę należy poddać transferowi (blottingowi) w temperaturze 80 °C przez 30 minut.Następnie zablokuj nieswoiste miejsca wiązania przeciwciał, zanurzając membranę w 5% BSA w TBST w 10-centymetrowej szalce Petriego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu. Po godzinie przemyj membranę trzy razy w TBST po pięć minut za każdym razem. Inkubuj membranę z mysim monoklonalnym przeciwciałem anty-5-metylocytozynie w TBST w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia membranę należy przemyć trzykrotnie w TBST po pięć minut za każdym razem. Następnie inkubuje się ją z przeciwciałem wtórnym – owczym przeciwciałem przeciwko immunoglobulinie G mysiej sprzężonym z peroksydazą chrzanową w TBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po ponownym przemyciu membrany w TBST, należy nanieść na nią substrat enzymatyczny i inkubować od pięciu do 10 minut.Na koniec należy zwizualizować sygnał przeciwciała wtórnego, korzystając z zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Chondrocyty hodowane w monowarstwie do szóstego pasażu wykazywały postępujące zmiany fenotypowe, stając się silnie ściśnięte i spłaszczone w kolejnych pasażach. Taka zmiana morfologii jest typowa dla procesu dedyferencjacji chondrocytów.DNA genomicowy wyizolowano z chondrocytów po różnej liczbie pasaży, a poziomy metylacji DNA oceniono za pomocą specyficznego testu dot blot na 5-metylocytozynę. Intensywność plamek przeanalizowano następnie za pomocą programu Image J. Obserwowano stopniowy wzrost poziomu 5-metylocytozyny wraz z wydłużeniem czasu subkultury, co sugeruje powiązanie między ogólnym wzrostem poziomu metylacji a dedyferencjacją chondrocytów. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w ciągu 24 godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zmaksymalizować stężenie i czystość genomowego DNA. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak profilowanie metylacji genomowego DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące dedyferencjacji chondrocytów w monokulturze. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie autologicznego przeszczepiania chondrocytów do oceny metylacji DNA chondrocytów i określenia fenotypu chondrocytów w leczeniu ubytków chrząstki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania metody dot blot dla 5-metylocytozyny do wykrywania zdegenerowanych mechanizmów dźwigni w celu oceny fenotypu chondrocytów. Należy pamiętać, że praca z fenolem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy nosić rękawice.

a-5-mc-dot-blot-assay-quantifying-dna-methylation-level-chondrocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Ten film opisuje technikę dot-blot do określania poziomu metylacji DNA w ludzkich chondrocytach in vitro poprzez plamienie próbek DNA na nylonowej membranie i późniejszą wizualizację za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Pomaga to określić fenotyp chondrocytów na różnych etapach hodowli.

5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Opisano metodę fluorescencyjnego barwienia utrwalonego materiału biologicznego za pomocą specyficznej etykiety DNA o nazwie metylowej. Zieleń metylowa jest stosowana w rozcieńczonym roztworze wodnym i jest bardzo odporna na fotowybielanie. Jego daloka-czerwona emisja pozwala na głębokie obrazowanie próbek, dzięki czemu jest szczególnie odpowiedni dla całych zarodków.

Zastosowanie specyficznego dla DNA barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków

Poznaj metodę 5-mC dot blot do ilościowego oznaczania metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro. Technika ta umożliwia szybką i niezawodną ocenę fenotypu komórek chrzęstnych w leczeniu ubytków chrząstki.

Test 5-mC Dot Blot określający ilościowo poziom metylacji DNA w dedyferencjacji chondrocytów in vitro

Przeglądaj więcej filmów