Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną
13 czerwca 2017
Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie jednoczesnej wizualizacji aktywności neuronalnej w wielu warstwach neuronów korowych przy użyciu wskaźników wapnia u swobodnie poruszającej się myszy oraz zrozumienie funkcjonowania obwodów neuronalnych za pomocą zminiaturyzowanego fluorescencyjnego mikroskopu montowanego na głowie. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki systemowej, takie jak sposób propagacji informacji pomiędzy wieloma warstwami kory mózgowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na niezawodną w czasie wizualizację dużych populacji genetycznie kodowanych neuronów w wielu warstwach kory u zwierząt zachowujących swobodną aktywność.
Aby zwizualizować genetycznie kodowane neurony z wielu warstw kory u zwierzęcia w stanie swobodnego zachowania, należy przeprowadzić następujące procedury; niniejszy protokół przedstawia implantację sondy pryzmatycznej, instalację płyty podstawowej oraz obrazowanie in vivo u myszy w stanie swobodnego zachowania. Aby rozpocząć tę procedurę, jeden do dwóch tygodni po wstrzyknięciu wirusa, umieść zwierzę w aparacie stereotaksycznym i przygotuj się do operacyjnego wszczepienia sondy pryzmatycznej, dezynfekując ją 70% etanolem i czyszcząc papierem do soczewek. Następnie wykonaj okrągłą kraniotomię, używając mikrowiertarki z wiertłem o średnicy 0,5 mm.
Należy upewnić się, że średnica otworu trepanacyjnego jest nieco większa od średnicy pryzmatu. Następnie należy tak umieścić otwór trepanacyjny, aby po wprowadzeniu pryzmatu do kory jego płaska krawędź była skierowana w stronę miejsca wstrzyknięcia wirusa i znajdowała się w promieniu od 150 do 200 micronów. Po tym zabiegu należy usunąć oponę twardą za pomocą precyzyjnej pęsety.
Po odsłonięciu tkanki mózgowej należy stale utrzymywać jej wilgotność za pomocą sterylnej soli fizjologicznej. Pozwoli to również zachować odpowiedni nacisk na tkankę. Aby zmniejszyć ucisk w tkance mózgowej podczas wprowadzania sondy pryzmatycznej, należy utworzyć kanał wprowadzający, mocując nóż do sekcji o prostym ostrzu do ramienia uchwytu elektrod w aparaturze stereotaktycznej.
Zamocuj go pod kątem tak, aby płytka noża była prostopadła do krzywizny czaszki i znajdowała się w płaszczyźnie równoległej do kolumny wstrzykiwania wirusa. Ostrożnie ustaw nóż nad otworem trepanacyjnym, wzdłuż jego przyśrodkowej krawędzi wewnętrznej i około 200 mikronów bocznie od miejsca wstrzyknięcia wirusa, z krawędzią tnącą skierowaną ku tyłowi. Wyzeruj oś Z w momencie, gdy końcówka noża dotknie omiaki.
Następnie stopniowo obniż go do głębokości, na którą zostanie wprowadzona sonda pryzmatyczna. Następnie przesuń nóż o jeden milimetr do tyłu, aby stworzyć przejście dla przedniej krawędzi pryzmatu. Powoli wycofaj nóż, korzystając z mikromanipulatora ramienia stereotaktycznego w przyrostach 10 micron na sekundę, a nad nacięciem umieść kawałek gąbki z pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną.
Następnie przymocuj uchwyt soczewki do ramienia manipulatora stereotaktycznego pod tym samym kątem, co nóż w poprzednim kroku. Ustaw pryzmat tak, aby jego płaska strona znajdowała się nad nacięciem i równolegle do kolumny iniekcji wirusa. Gdy pryzmat znajdzie się pod odpowiednim kątem, stopniowo opuszczaj go do mózgu w krokach co 10 micron, aż do końcowego poziomu Z wynoszącego 1,1 millimeter od powierzchni mózgu, dla tej sondy.
Przykryj każdą odsłoniętą tkankę wokół pryzmatu w otworze trepanacyjnym bardzo cienką ochronną warstwą kleju elastomerowego, używając igły 25G. Aby zapobiec przesuwaniu się soczewki wewnątrz otworu trepanacyjnego, po utwardzeniu kleju elastomerowego użyj igły 25G, aby nanieść klej cyjanoakrylanowy i przytwierdzić szkło soczewki pryzmatu do przyległej czaszki na warstwie kleju elastomerowego. Po utwardzeniu kleju cyjanoakrylanowego odkręć uchwyt soczewki i ostrożnie usuń mikroskop.
Następnie powoli wycofaj ramię manipulatora stereotaktycznego, pozostawiając sondę pryzmatyczną bezpiecznie implantowaną. Nałóż warstwę akrylu dentystycznego lub kleju cyjanoakrylowego wokół implantu, aby zakryć odsłoniętą powierzchnię czaszki, nie dotykając przy tym otaczającej, odsuniętej tkanki mięśniowej. Pokrycie w ten sposób dużego obszaru czaszki tzw. czapką kranialną ułatwi późniejsze przymocowanie płyty podstawy.
Następnie wymieszaj katalizator i bazę z silikonowej strzykawki z klejem i nanieś kroplę elastomeru do wnętrza osłonki sondy pryzmatycznej, aby pokryć górną część soczewki sondy w celu zapobiegania uszkodzeniom i osadzaniu się kurzu. Od jednego tygodnia do 10 dni po implantacji sondy pryzmatycznej sprawdź ekspresję wirusa w tkance za pomocą wszczepionej sondy. W tym celu usuń silikonową nasadkę z kleju z powierzchni soczewki implantowanej sondy pryzmatycznej.
Należy zbadać powierzchnię soczewki sondy i delikatnie oczyścić ją z wszelkich zanieczyszczeń za pomocą papieru do soczewek i 70% etanolu, aby upewnić się, że powierzchnia obrazująca jest czysta. Następnie do mikroskopu należy przymocować płytkę podstawową i dokręcić śrubę mocującą płytkę, aby utrzymać ją w pozycji. Następnie należy zamocować mikroskop w uchwycie mikroskopowym na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora.
Przymocuj chwytak do pręta, który można zamontować na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora. Następnie, używając ramienia stereotaktycznego mikromanipulatora, ustaw mikroskop nad soczewką sondy pryzmatycznej. Sprawdź wizualnie orientację, oglądając soczewkę pryzmatyczną z boku i z tyłu stołu zwierzęcego.
Należy wyrównać osie optyczne obiektywu mikroskopu oraz sondy pryzmatycznej. Następnie należy uruchomić oprogramowanie do akwizycji, wybrać projekt i włączyć diodę LED mikroskopu za pomocą oprogramowania. Jakość wyrównania mikroskopu należy ocenić w oprogramowaniu do akwizycji, ustawiając ostrość na górnej fazie soczewki wszczepionej sondy pryzmatycznej poprzez przesuwanie ramienia manipulatora stereotaktycznego.
Po prawidłowym ustawieniu krawędzie soczewki sondy pryzmatycznej powinny być wyraźne. Dostosuj fizyczny dystans mikroskopu nad wszczepioną sondą pryzmatyczną, korzystając z ramienia manipulatora stereotaktycznego, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę ogniskowania wewnątrz tkanki. Następnie użyj akrylu dentystycznego lub cyjanoakrylanu, aby na stałe przymocować płytkę podstawową do akrylowej nasadki w celu wypełnienia przerwy.
Kluczowe jest, aby nie nakładać kleju na żadną część korpusu mikroskopu ani na śrubę dociskową podczas przyklejania płytki podstawy do głowy zwierzęcia. Teraz zwolnij mikroskop z chwytaka i wycofaj chwytak z mikroskopu. Jeśli użyto cyjanoakrylanu lub innego przezroczystego kleju, należy pokryć go czarnym lakierem do paznokci lub warstwą czarnego cementu dentystycznego, aby zapobiec przedostawaniu się światła otoczenia do nasadki głowy, co mogłoby zanieczyścić obrazy pozyskane podczas przyszłych eksperymentów.
Następnie zabezpiecz implantowaną sondę pryzmatyczną osłoną płyty podstawowej. W tej procedurze podłącz mikroskop do modułu akwizycji danych połączonego z komputerem i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Następnie zdejmij osłonę płyty podstawowej, odkręcając śrubę ustalającą płyty podstawowej w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyjmując osłonę.
Ustaw mikroskop na płytce podstawy zwierzęcia. Mikroskop powinien wskoczyć na miejsce dzięki magnesom znajdującym się na płytce podstawy. Następnie dokręć śrubę regulacyjną płytki podstawy, aż poczujesz lekki opór.
Następnie wybierz ustawienia akwizycji do zbierania danych, w tym częstotliwość próbkowania klatek. Podczas wybierania ustawień sprawdź histogram obrazu, aby upewnić się, że stosunek sygnału do szumu jest odpowiedni. Następnie rozpocznij zbieranie danych.
Po zakończeniu nagrywania poluzuj śrubę mocującą płytę podstawy i odłącz mikroskop od płyty, delikatnie go podnosząc. Następnie załóż osłonę płyty podstawy i delikatnie dokręć śrubę mocującą. Poniżej znajduje się demonstracja zwierzęcia z zamontowanym mikroskopem, swobodnie wchodzącego w interakcje z obiektami w arenie behawioralnej.
Podczas obrazowania zachowania zwierząt w stanie czuwania z wykorzystaniem systemu, rejestrowano aktywność neuronów kory somatosensorycznej, gdy mysz była wystawiona na trzy różne środowiska: otwarte pole w pierwszym dniu, zapoznanie z obiektem od drugiego do czwartego dnia oraz nowy obiekt w piątym dniu. Po ekstrakcji komórek za pomocą oprogramowania do analizy danych obrazowania wapniowego, filtry przestrzenne odpowiadające lokalizacjom komórek nałożono na projekcję średniej intensywności fluorescencji danych z rejestracji mikroskopowej.
Biała przerywana linia oddziela komórki z warstwy drugiej, trzeciej i piątej. Odpowiednie zapisy poziomu wapnia z pięciu komórek z każdej z warstw pokazują wzorzec aktywności komórek w dwóch różnych kontekstach behawioralnych: zapoznanie z obiektem oraz ekspozycja na nowy obiekt. Komórki z warstwy drugiej i trzeciej były bardziej aktywne w porównaniu z komórkami z warstwy piątej w dniu, w którym mysz została poddana działaniu nowego obiektu.
Poniżej przedstawiono pozostałe wykresy aktywności komórek z powierzchniowych jednostek badawczych, zarejestrowane podczas przebywania zwierzęcia w otwartym polu, procesu zapoznawania z obiektem oraz eksploracji nowego obiektu. Po opanowaniu każdej z tych technik, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu godziny. Opracowana metoda otwiera drogę badaczom neuronauk systemowych do analizy specyficznych typów komórek w różnych obszarach mózgu, z wykorzystaniem różnych paradygmatów behawioralnych w droningach oraz innych modelach neurofizjologii chorób.
Dzięki temu protokołowi należy uzyskać pełną wiedzę na temat tego, jak znakować wiele warstw kory somatosensorycznej, implantować sondę pryzmatyczną oraz mocować miniaturowy mikroskop montowany na głowie.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia procedurę wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory u myszy swobodnie poruszających się. Metoda ta umożliwia jednoczesną obserwację setek aktywnych komórek przy użyciu zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z implantowaną sondą pryzmatyczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Techniki obrazowania
- Funkcjonowanie obwodów neuronalnych
Wprowadzenie
- Zrozumienie aktywności neuronalnej w poszczególnych warstwach kory mózgowej ma kluczowe znaczenie dla neuronauki systemowej.
- Wskaźniki wapnia są wykorzystywane do wizualizacji aktywności neuronalnej u zwierząt w stanie swobodnego zachowania.
- Technika ta umożliwia badanie propagacji informacji w korze mózgowej.
- Zminiaturyzowane narzędzia obrazowania zwiększają możliwość monitorowania dużych populacji neuronów.
Cel badania
- Wizualizacja aktywności neuronalnej w wielu warstwach kory u myszy w stanie swobodnego zachowania.
- Zrozumienie funkcjonowania obwodów neuronalnych przy użyciu zaawansowanych technik obrazowania.
- Zapewnienie niezawodnej metody długoterminowej obserwacji neuronów z genetycznie zakodowanymi markerami.
Zastosowane metody
- Implantacja sondy pryzmatycznej i instalacja płytki bazowej.
- Obrazowanie aktywności neuronalnej in vivo u myszy w warunkach swobodnego zachowania.
- Wykorzystanie aparatu stereotaksycznego do precyzyjnych procedur chirurgicznych.
- Ocena ekspresji wirusa za pomocą implantowanej sondy pryzmatycznej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja dużych populacji neuronów w obrębie warstw korowych.
- Wykazana niezawodność metody w czasie.
- Uzyskanie wglądu w dynamikę funkcjonowania obwodów neuronalnych.
- Opracowanie protokołu dla przyszłych badań w dziedzinie neuronauki systemowej.
Wnioski
- Technika ta pozwala na kompleksową analizę aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się myszy.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w zakresie zrozumienia przetwarzania informacji w korze mózgowej.
- Metoda ta może znacząco przyczynić się do rozwoju neuronauki systemowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technika ta umożliwia długoterminowe obrazowanie aktywności neuronalnej z rozdzielczością komórkową w obrębie warstw kory u zwierząt w warunkach swobodnego zachowania, wypełniając krytyczną lukę w neuronauce systemowej w zakresie badania dynamiki obwodów neuronalnych w warunkach naturalnych. Dzięki przełamaniu ograniczeń behawioralnych właściwych dla preparatów z unieruchomioną głową, metoda ta wspiera walidację celów i mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie odkrywania leków neuropsychiatrycznych, w których priorytetowo traktuje się fenotypy na poziomie obwodów. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie wzorców aktywności komórkowej ze złożonymi zachowaniami, co poprawia istotność translacyjną w opracowywaniu terapii ukierunkowanych na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez monitorowanie aktywności specyficznej dla danego typu komórek w poszczególnych warstwach kory podczas zadań istotnych z punktu widzenia behawioralnego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, podłużne odczyty zaangażowania obwodów neuronalnych w celu wsparcia procesu minimalizacji ryzyka związanego z celem oraz kampanii przesiewowych fenotypowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, rozdzielone przestrzennie odczyty dynamiki wapnia, które mogą służyć jako funkcjonalne biomarkery wpływu związków na przetwarzanie korowe.
- Wartość operacyjna: Tworzy zestandaryzowaną platformę gotowości do analiz, umożliwiając skalowalny screening czynników farmakologicznych w wielu warstwach kory i paradygmatach behawioralnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne w badaniach nad chorobami poprzez rejestrowanie specyficznej dla warstw dynamiki neuronalnej podczas eksploracji nowego obiektu, co stanowi wskaźnik domen przetwarzania poznawczego i sensorycznego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, pozwalając na wielokrotne sesje obrazowania w ciągu wielu dni w celu oceny przewlekłych efektów leków lub manipulacji genetycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – dostarczając wglądu w mechanizmy przetwarzania informacji w korze mózgowej, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w rozwoju leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy (CNS).
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie jednoczesnej wizualizacji setek neuronów w wielu warstwach podczas zachowania.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników o wysokim stosunku sygnału do szumu, co ułatwia niezawodną ocenę związków i mapowanie zależności struktura-aktywność.
- Analityka: Umożliwia wyodrębnianie filtrów przestrzennych i śladów wapniowych do analizy porównawczej wzorców aktywności neuronalnej w różnych kontekstach behawioralnych i warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez powiązanie wzorców aktywności komórkowej z zachowaniami istotnymi etologicznie, co ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalne rozwiązanie do obrazowania chronicznego w wielu badaniach, co ogranicza konieczność powtarzania przygotowań chirurgicznych i zwiększa spójność między projektami.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w działaniu obwodów korowych oraz umożliwienie analizy specyficznej dla danego typu komórek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki konstrukcji implantów chronicznych oraz systemowi płyty bazowej z magnesem, co pozwala na spójne obrazowanie codzienne.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie fenotypowych danych na poziomie obwodów, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach programów badawczych nad OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie walidacji funkcjonalnej u zwierząt wykazujących określone zachowania, co zwiększa efektywność kapitałową w przedklinicznych potokach badawczych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej, pracy z wektorami wirusowymi oraz mikroskopii in vivo w celu prawidłowego wszczepienia sondy i obrazowania.
- Zależy od zminiaturyzowanych systemów mikroskopii fluorescencyjnej, manipulatorów stereotaktycznych oraz oprogramowania akwizycyjnego w zakresie wyrównania optycznego i gromadzenia danych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w grupach neurobiologii, obrazowania i nauk o zachowaniu, aby zapewnić powtarzalność przygotowania i obsługi.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych obszarów mózgu, gatunków zwierząt i paradygmatów behawioralnych poza korą somatosensoryczną i eksploracją przedmiotów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak czas rekonwalescencji pooperacyjnej, potencjalna odpowiedź tkankowa na implanty chroniczne oraz konieczność codziennej kalibracji w celu utrzymania jakości obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Prism Probe Implant Surgery
9:52
Conclusion
8:33
Results: Calcium Dynamics from Superficial and Deep Layers of Somatosensory Cortex of a Representative Mouse Imaged with the Microscope
4:52
Baseplate Attachment for Miniature Microscope Installation
7:22
Imaging Multiple Cortical Layers in a Freely Moving Mouse
