Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca²⁺ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie jednoczesnej wizualizacji aktywności neuronalnej w wielu warstwach neuronów korowych za pomocą wskaźników wapniowych u swobodnie zachowującej się myszy oraz zrozumienie funkcjonowania obwodów nerwowych za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego montowanego na głowie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki systemowej, takie jak, w jaki sposób propagator informacji w wielu warstwach kory mózgowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na niezawodną wizualizację dużych populacji genetycznie kodowanych neuronów w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie zachowujących się zwierząt, w miarę upływu czasu.

Aby uwidocznić genetycznie zakodowane neurony z wielu warstw kory mózgowej u swobodnie zachowującego się zwierzęcia, należy wykonać następujące procedury, a protokół ten podkreśla implantację sondy pryzmatycznej, instalację płytki bazowej i obrazowanie in vivo u swobodnie zachowującej się myszy. Aby rozpocząć tę procedurę, od jednego do dwóch tygodni po wstrzyknięciu wirusa, umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym i przygotuj się do operacji wszczepienia implantu sondy pryzmatycznej, dezynfekując je w 70% etanolu i czyszcząc papierem do soczewek. Następnie otwórz okrągłą kraniotomię za pomocą mikrowiertła z 0,5 milimetrowym zadziorem.

Upewnij się, że średnica kraniotomii jest tylko większa niż średnica pryzmatu. Następnie ustaw kraniotomię w taki sposób, aby po wprowadzeniu pryzmatu do kory jego płaska krawędź była skierowana w stronę miejsca wstrzyknięcia wirusa i znajdowała się w promieniu od 150 do 200 mikronów. Następnie usuń oponę twardą za pomocą drobnych kleszczyków.

Zawsze utrzymuj tkankę wilgotną sterylną solą fizjologiczną, gdy tkanka mózgowa zostanie odsłonięta. To również utrzyma nacisk na tkankę. Aby zmniejszyć ciśnienie w tkance mózgowej podczas wprowadzania sondy pryzmatycznej, należy utworzyć drogę wprowadzającą, mocując nóż do preparowania o prostych krawędziach do ramienia uchwytu elektrody aparatu stereotaktycznego.

Zamontuj go pod kątem, tak aby płytka noża była prostopadła do krzywizny czaszki i w płaszczyźnie równoległej do kolumny iniekcyjnej wirusa. Ostrożnie umieść nóż nad kraniotomią, wzdłuż jej wewnętrznej krawędzi podłoża i około 200 mikronów w bok od miejsca wstrzyknięcia wirusa, z krawędzią tnącą skierowaną do tyłu. Wyzeruj oś Z, gdy końcówka noża dotknie pia.

Następnie stopniowo obniżaj go na głębokość, na którą zostanie włożona sonda pryzmatyczna. Następnie przesuń nóż o jeden milimetr do tyłu, aby utworzyć ścieżkę dla krawędzi natarcia pryzmatu. Powoli nóż za pomocą stereotaktycznego mikromanipulatora ramienia w odstępach co 10 mikronów na sekundę i umieść kawałek gąbki z pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną na nacięciu.

Następnie przymocuj uchwyt obiektywu do ramienia manipulatora stereotaktycznego pod tym samym kątem, co nóż w poprzednim kroku. Ustaw pryzmat tak, aby płaska strona pryzmatu znajdowała się powyżej nacięcia i równolegle do kolumny do wstrzykiwania wirusa. Gdy pryzmat znajdzie się pod odpowiednim kątem, stopniowo opuszczaj go do mózgu w krokach co 10 mikronów, aż do końcowego poziomu Z wynoszącego 1,1 milimetra od powierzchni mózgu, dla tej sondy.

Przykryj odsłoniętą tkankę wokół pryzmatu podczas kraniotomii bardzo cienkim ochronnym poziomem kleju elastomerowego, używając igły o rozmiarze 25. Aby zapobiec przesuwaniu się soczewki wewnątrz kraniotomii, po utwardzeniu kleju elastomerowego użyj igły o rozmiarze 25, aby nałożyć trochę kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować szkło soczewki pryzmatycznej do sąsiedniej czaszki nad warstwą kleju elastomerowego. Po utwardzeniu kleju cyjanoakrylowego odkręć uchwyt obiektywu i ostrożnie wyjmij mikroskop.

Następnie powoli cofnij ramię manipulatora stereotaktycznego, aby sonda pryzmatyczna była bezpiecznie wszczepiona. Nałóż warstwę akrylowego kleju dentystycznego lub kleju cyjanoakrylowego wokół implantu, aby pokryć odsłoniętą powierzchnię czaszki bez dotykania otaczającej cofniętej tkanki mięśniowej. Pokrycie dużego obszaru czaszki tą czapeczką czaszki pomoże później w mocowaniu płyty podstawy.

Następnie wymieszaj końcówkę katalizatora z silikonowej strzykawki z klejem i umieść kroplę elastomeru w mankiecie sondy pryzmatycznej, aby zakryć górną część soczewki sondy, aby zapobiec uszkodzeniom i osadzaniu się kurzu. Od tygodnia do 10 dni po wszczepieniu sondy pryzmatycznej sprawdź ekspresję wirusa w tkance za pomocą wszczepionej sondy pryzmatycznej. W tym celu zdejmij silikonową nasadkę samoprzylepną z powierzchni wszczepionej soczewki sondy pryzmatycznej.

Sprawdź powierzchnię soczewki sondy i delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia papierem do soczewek i 70% etanolem, aby upewnić się, że powierzchnia obrazowania jest czysta. Następnie przymocuj płytkę bazową do mikroskopu i dokręć dociskową płytki podstawy, aby utrzymać ją na miejscu. Następnie przymocuj mikroskop do chwytaka mikroskopu na ramieniu mikromanipulatora stereotaktycznego.

Przymocuj chwytak do pręta, który można zamontować na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora. Następnie umieść mikroskop nad soczewką sondy pryzmatycznej, używając ramienia mikromanipulatora stereotaktycznego. Sprawdź wzrokowo orientację, patrząc na soczewkę pryzmatyczną z boku i z tyłu sceny zwierzęcej.

Oś optyczna zarówno obiektywu mikroskopu, jak i sondy pryzmatycznej musi być wyrównana. Następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji, wybierz projekt i włącz diodę LED mikroskopu za pomocą oprogramowania. Oceń jakość wyrównania mikroskopu, skupiając się na górnej fazie wszczepionej soczewki sondy pryzmatycznej w oprogramowaniu akwizycyjnym, przesuwając ramię manipulatora stereotaktu.

Po prawidłowym ustawieniu krawędzie soczewki sondy pryzmatycznej powinny wydawać się ostre. Dostosuj fizyczną odległość mikroskopu nad wszczepioną sondą pryzmatyczną, używając ramienia manipulatora stereotaktycznego, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę ogniskową wewnątrz tkanki. Następnie użyj akrylu dentystycznego lub cyjanoakrylu, aby na stałe przymocować płytkę podstawy do akrylowej nasadki, aby wypełnić szczelinę.

Bardzo ważne jest, aby nie nakładać kleju na żadną część korpusu mikroskopu ani ustalającą podczas przyklejania płytki podstawy do głowy zwierzęcia. Teraz zwolnij mikroskop z chwytaka i schuj chwytak z mikroskopu. Jeśli użyto cyjanoakrylu lub innego przezroczystego kleju, pokryj go czarnym lakierem do paznokci lub warstwą czarnego cementu dentystycznego, aby zapobiec przedostawaniu się światła otoczenia do nasadki głowy, co może zanieczyścić przyszłe obrazy uzyskane podczas eksperymentów.

Następnie zabezpiecz wszczepioną sondę pryzmatyczną za pomocą pokrywy płyty podstawy. W tej procedurze podłącz mikroskop do skrzynki akwizycji danych podłączonej do komputera i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Następnie zdejmij pokrywę płyty podstawy, obracając dociskową płyty podstawy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i podnosząc pokrywę płyty podstawy.

Umieść mikroskop w płytce podstawy na zwierzęciu. Mikroskop powinien zatrzasnąć się na swoim miejscu za pomocą magnesów na płycie podstawy. Następnie przesuń dociskową płyty podstawy, aż poczujesz lekki opór.

Następnie wybierz ustawienia pozyskiwania, które mają być używane do zbierania danych, w tym liczbę klatek na sekundę do przechwytywania danych. Sprawdź histogram obrazu podczas wybierania ustawień, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu. Następnie rozpocznij pobieranie danych.

Po zakończeniu zapisu poluzuj dociskową płyty podstawy i odłącz mikroskop od płyty podstawy, delikatnie pociągając mikroskop do góry. Następnie załóż pokrywę płyty podstawy i delikatnie dokręć dociskową płyty podstawy. Oto demonstracja zwierzęcia wyposażonego w mikroskop, swobodnie wchodzącego w interakcję z obiektami na arenie zachowań.

Podczas obrazowania zachowania w stanie czuwania za pomocą systemu, aktywność somatosensorycznych neuronów korowych była rejestrowana, gdy mysz była wystawiona na działanie trzech różnych środowisk. Pierwszego dnia na otwartym polu, w drugim do czwartego dnia zapoznanie się z obiektem, a piątego dnia z nowym obiektem. Po ekstrakcji komórek za pomocą oprogramowania do analizy danych obrazu wapnia, filtry przestrzenne odpowiadające lokalizacjom komórek nałożono na projekcję średniej intensywności fluorescencji danych rejestrujących pod mikroskopem.

Biała przerywana linia oddziela warstwy dwie, trzy i pięć komórek. Odpowiednie ślady wapnia z pięciu komórek z każdej z warstw pokazują wzorzec hodowli komórek w dwóch różnych kontekstach behawioralnych: zapoznanie się z obiektem i ekspozycja na nowy obiekt. Warstwy drugiej, trzy komórki były bardziej aktywne w porównaniu z komórkami warstwy piątej w dniu, w którym mysz była wystawiona na działanie nowego obiektu.

Oto reszta wykresów aktywności komórek od powierzchownych graczy istot, kiedy zwierzę znajdowało się na otwartym polu, zapoznanie się z obiektem i eksploracja nowych obiektów. Po opanowaniu każdej techniki można ukończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią systemową do badania określonych typów komórek w różnych obszarach mózgu, wykorzystując jednocześnie różne paradygmaty zachowania w droningu i inne modele neurofizjologii w chorobie.

Na podstawie tego protokołu należy dobrze zrozumieć, jak oznaczyć wiele warstw kory somatosensorycznej, wszczepić sondę pryzmatyczną i przymocować zminiaturyzowany mikroskop montowany na głowie.