Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną
June 13th, 2017
Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.
Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie jednoczesnej wizualizacji aktywności neuronalnej w wielu warstwach neuronów korowych za pomocą wskaźników wapniowych u swobodnie zachowującej się myszy oraz zrozumienie funkcjonowania obwodów nerwowych za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego montowanego na głowie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki systemowej, takie jak, w jaki sposób propagator informacji w wielu warstwach kory mózgowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na niezawodną wizualizację dużych populacji genetycznie kodowanych neuronów w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie zachowujących się zwierząt, w miarę upływu czasu.
Aby uwidocznić genetycznie zakodowane neurony z wielu warstw kory mózgowej u swobodnie zachowującego się zwierzęcia, należy wykonać następujące procedury, a protokół ten podkreśla implantację sondy pryzmatycznej, instalację płytki bazowej i obrazowanie in vivo u swobodnie zachowującej się myszy. Aby rozpocząć tę procedurę, od jednego do dwóch tygodni po wstrzyknięciu wirusa, umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym i przygotuj się do operacji wszczepienia implantu sondy pryzmatycznej, dezynfekując je w 70% etanolu i czyszcząc papierem do soczewek. Następnie otwórz okrągłą kraniotomię za pomocą mikrowiertła z 0,5 milimetrowym zadziorem.
Upewnij się, że średnica kraniotomii jest tylko większa niż średnica pryzmatu. Następnie ustaw kraniotomię w taki sposób, aby po wprowadzeniu pryzmatu do kory jego płaska krawędź była skierowana w stronę miejsca wstrzyknięcia wirusa i znajdowała się w promieniu od 150 do 200 mikronów. Następnie usuń oponę twardą za pomocą drobnych kleszczyków.
Zawsze utrzymuj tkankę wilgotną sterylną solą fizjologiczną, gdy tkanka mózgowa zostanie odsłonięta. To również utrzyma nacisk na tkankę. Aby zmniejszyć ciśnienie w tkance mózgowej podczas wprowadzania sondy pryzmatycznej, należy utworzyć drogę wprowadzającą, mocując nóż do preparowania o prostych krawędziach do ramienia uchwytu elektrody aparatu stereotaktycznego.
Zamontuj go pod kątem, tak aby płytka noża była prostopadła do krzywizny czaszki i w płaszczyźnie równoległej do kolumny iniekcyjnej wirusa. Ostrożnie umieść nóż nad kraniotomią, wzdłuż jej wewnętrznej krawędzi podłoża i około 200 mikronów w bok od miejsca wstrzyknięcia wirusa, z krawędzią tnącą skierowaną do tyłu. Wyzeruj oś Z, gdy końcówka noża dotknie pia.
Następnie stopniowo obniżaj go na głębokość, na którą zostanie włożona sonda pryzmatyczna. Następnie przesuń nóż o jeden milimetr do tyłu, aby utworzyć ścieżkę dla krawędzi natarcia pryzmatu. Powoli nóż za pomocą stereotaktycznego mikromanipulatora ramienia w odstępach co 10 mikronów na sekundę i umieść kawałek gąbki z pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną na nacięciu.
Następnie przymocuj uchwyt obiektywu do ramienia manipulatora stereotaktycznego pod tym samym kątem, co nóż w poprzednim kroku. Ustaw pryzmat tak, aby płaska strona pryzmatu znajdowała się powyżej nacięcia i równolegle do kolumny do wstrzykiwania wirusa. Gdy pryzmat znajdzie się pod odpowiednim kątem, stopniowo opuszczaj go do mózgu w krokach co 10 mikronów, aż do końcowego poziomu Z wynoszącego 1,1 milimetra od powierzchni mózgu, dla tej sondy.
Przykryj odsłoniętą tkankę wokół pryzmatu podczas kraniotomii bardzo cienkim ochronnym poziomem kleju elastomerowego, używając igły o rozmiarze 25. Aby zapobiec przesuwaniu się soczewki wewnątrz kraniotomii, po utwardzeniu kleju elastomerowego użyj igły o rozmiarze 25, aby nałożyć trochę kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować szkło soczewki pryzmatycznej do sąsiedniej czaszki nad warstwą kleju elastomerowego. Po utwardzeniu kleju cyjanoakrylowego odkręć uchwyt obiektywu i ostrożnie wyjmij mikroskop.
Następnie powoli cofnij ramię manipulatora stereotaktycznego, aby sonda pryzmatyczna była bezpiecznie wszczepiona. Nałóż warstwę akrylowego kleju dentystycznego lub kleju cyjanoakrylowego wokół implantu, aby pokryć odsłoniętą powierzchnię czaszki bez dotykania otaczającej cofniętej tkanki mięśniowej. Pokrycie dużego obszaru czaszki tą czapeczką czaszki pomoże później w mocowaniu płyty podstawy.
Następnie wymieszaj końcówkę katalizatora z silikonowej strzykawki z klejem i umieść kroplę elastomeru w mankiecie sondy pryzmatycznej, aby zakryć górną część soczewki sondy, aby zapobiec uszkodzeniom i osadzaniu się kurzu. Od tygodnia do 10 dni po wszczepieniu sondy pryzmatycznej sprawdź ekspresję wirusa w tkance za pomocą wszczepionej sondy pryzmatycznej. W tym celu zdejmij silikonową nasadkę samoprzylepną z powierzchni wszczepionej soczewki sondy pryzmatycznej.
Sprawdź powierzchnię soczewki sondy i delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia papierem do soczewek i 70% etanolem, aby upewnić się, że powierzchnia obrazowania jest czysta. Następnie przymocuj płytkę bazową do mikroskopu i dokręć dociskową płytki podstawy, aby utrzymać ją na miejscu. Następnie przymocuj mikroskop do chwytaka mikroskopu na ramieniu mikromanipulatora stereotaktycznego.
Przymocuj chwytak do pręta, który można zamontować na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora. Następnie umieść mikroskop nad soczewką sondy pryzmatycznej, używając ramienia mikromanipulatora stereotaktycznego. Sprawdź wzrokowo orientację, patrząc na soczewkę pryzmatyczną z boku i z tyłu sceny zwierzęcej.
Oś optyczna zarówno obiektywu mikroskopu, jak i sondy pryzmatycznej musi być wyrównana. Następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji, wybierz projekt i włącz diodę LED mikroskopu za pomocą oprogramowania. Oceń jakość wyrównania mikroskopu, skupiając się na górnej fazie wszczepionej soczewki sondy pryzmatycznej w oprogramowaniu akwizycyjnym, przesuwając ramię manipulatora stereotaktu.
Po prawidłowym ustawieniu krawędzie soczewki sondy pryzmatycznej powinny wydawać się ostre. Dostosuj fizyczną odległość mikroskopu nad wszczepioną sondą pryzmatyczną, używając ramienia manipulatora stereotaktycznego, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę ogniskową wewnątrz tkanki. Następnie użyj akrylu dentystycznego lub cyjanoakrylu, aby na stałe przymocować płytkę podstawy do akrylowej nasadki, aby wypełnić szczelinę.
Bardzo ważne jest, aby nie nakładać kleju na żadną część korpusu mikroskopu ani ustalającą podczas przyklejania płytki podstawy do głowy zwierzęcia. Teraz zwolnij mikroskop z chwytaka i schuj chwytak z mikroskopu. Jeśli użyto cyjanoakrylu lub innego przezroczystego kleju, pokryj go czarnym lakierem do paznokci lub warstwą czarnego cementu dentystycznego, aby zapobiec przedostawaniu się światła otoczenia do nasadki głowy, co może zanieczyścić przyszłe obrazy uzyskane podczas eksperymentów.
Następnie zabezpiecz wszczepioną sondę pryzmatyczną za pomocą pokrywy płyty podstawy. W tej procedurze podłącz mikroskop do skrzynki akwizycji danych podłączonej do komputera i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Następnie zdejmij pokrywę płyty podstawy, obracając dociskową płyty podstawy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i podnosząc pokrywę płyty podstawy.
Umieść mikroskop w płytce podstawy na zwierzęciu. Mikroskop powinien zatrzasnąć się na swoim miejscu za pomocą magnesów na płycie podstawy. Następnie przesuń dociskową płyty podstawy, aż poczujesz lekki opór.
Następnie wybierz ustawienia pozyskiwania, które mają być używane do zbierania danych, w tym liczbę klatek na sekundę do przechwytywania danych. Sprawdź histogram obrazu podczas wybierania ustawień, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu. Następnie rozpocznij pobieranie danych.
Po zakończeniu zapisu poluzuj dociskową płyty podstawy i odłącz mikroskop od płyty podstawy, delikatnie pociągając mikroskop do góry. Następnie załóż pokrywę płyty podstawy i delikatnie dokręć dociskową płyty podstawy. Oto demonstracja zwierzęcia wyposażonego w mikroskop, swobodnie wchodzącego w interakcję z obiektami na arenie zachowań.
Podczas obrazowania zachowania w stanie czuwania za pomocą systemu, aktywność somatosensorycznych neuronów korowych była rejestrowana, gdy mysz była wystawiona na działanie trzech różnych środowisk. Pierwszego dnia na otwartym polu, w drugim do czwartego dnia zapoznanie się z obiektem, a piątego dnia z nowym obiektem. Po ekstrakcji komórek za pomocą oprogramowania do analizy danych obrazu wapnia, filtry przestrzenne odpowiadające lokalizacjom komórek nałożono na projekcję średniej intensywności fluorescencji danych rejestrujących pod mikroskopem.
Biała przerywana linia oddziela warstwy dwie, trzy i pięć komórek. Odpowiednie ślady wapnia z pięciu komórek z każdej z warstw pokazują wzorzec hodowli komórek w dwóch różnych kontekstach behawioralnych: zapoznanie się z obiektem i ekspozycja na nowy obiekt. Warstwy drugiej, trzy komórki były bardziej aktywne w porównaniu z komórkami warstwy piątej w dniu, w którym mysz była wystawiona na działanie nowego obiektu.
Oto reszta wykresów aktywności komórek od powierzchownych graczy istot, kiedy zwierzę znajdowało się na otwartym polu, zapoznanie się z obiektem i eksploracja nowych obiektów. Po opanowaniu każdej techniki można ukończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią systemową do badania określonych typów komórek w różnych obszarach mózgu, wykorzystując jednocześnie różne paradygmaty zachowania w droningu i inne modele neurofizjologii w chorobie.
Na podstawie tego protokołu należy dobrze zrozumieć, jak oznaczyć wiele warstw kory somatosensorycznej, wszczepić sondę pryzmatyczną i przymocować zminiaturyzowany mikroskop montowany na głowie.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia procedurę dużej skali obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory u wolno poruszających się myszy. Metoda umożliwia jednoczesne obserwowanie setek aktywnych komórek za pomocą zminiaturyzowanego, zamontowanego na głowie mikroskopu sparowanego z zaimplantowanym pryzmatycznym sondem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Techniki obrazowania
- Funkcjonowanie obwodów nerwowych
Tło
- Rozumienie aktywności neuronowej w warstwach kory jest kluczowe dla neuronauki systemowej.
- Wskaźniki wapnia są używane do wizualizowania aktywności neuronowej u swobodnie zachowujących się zwierząt.
- Ta technika umożliwia badanie propagacji informacji w korze.
- Miniaturyzowane narzędzia do obrazowania zwiększają zdolność monitorowania dużych populacji neuronów.
Cel badania
- Wizualizacja aktywności neuronowej w wielu warstwach kory u swobodnie zachowujących się myszy.
- Zrozumienie funkcjonowania obwodów nerwowych za pomocą zaawansowanych technik obrazowania.
- Dostarczenie niezawodnej metody długotrwałej obserwacji genetycznie zakodowanych neuronów.
Stosowane metody
- Implantacja sondu pryzmatycznego i instalacja podstawy.
- Wizualizowanie in vivo aktywności neuronowej u swobodnie zachowujących się myszy.
- Użycie aparatu stereotaksyjnego do precyzyjnych zabiegów chirurgicznych.
- Ocena ekspresji wirusa za pomocą zaimplantowanego sondu pryzmatycznego.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja dużych populacji neuronów w wielu warstwach kory.
- Wykazana niezawodność metody w czasie.
- Dostarczenie wglądu w dynamikę funkcjonowania obwodów nerwowych.
- Ustanowienie protokołu dla przyszłych badań w neuronaukach systemowych.
Wnioski
- Technika umożliwia kompleksową analizę aktywności neuronowej u wolno poruszających się myszy.
- Otwierają nowe drogi dla badań w zakresie rozumienia przetwarzania informacji w korze.
- Ta metoda może znacznie poszerzyć dziedzinę neuronauki systemowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This technique enables longitudinal, cellular-resolution imaging of neuronal activity across cortical layers in freely behaving animals, addressing a critical gap in systems neuroscience for studying neural circuit dynamics under naturalistic conditions. By overcoming the behavioral constraints of head-fixed preparations, it supports target validation and mechanistic de-risking in neuropsychiatric drug discovery where circuit-level phenotypes are increasingly prioritized. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular activity patterns to complex behaviors, thereby improving translational relevance for CNS therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by monitoring cell-type-specific activity across cortical layers during behaviorally relevant tasks.
- Operational Value: Provides reproducible, longitudinal readouts of neural circuit engagement to support target de-risking and phenotypic screening campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved calcium dynamics readouts that can serve as functional biomarkers for compound effects on cortical processing.
- Operational Value: Establishes a standardized platform for assay readiness, enabling scalable screening of pharmacological agents across multiple cortical layers and behavioral paradigms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by capturing layer-specific neuronal dynamics during novel object exploration, a proxy for cognitive and sensory processing domains.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by allowing repeated imaging sessions over days to assess chronic drug effects or genetic manipulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights into cortical information processing that inform go/no-go decisions in CNS drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous visualization of hundreds of neurons across layers during behavior.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high signal-to-noise ratio, facilitating reliable compound evaluation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Enables extraction of spatial filters and calcium traces for comparative analysis of neuronal activity patterns across behavioral contexts and experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker development by linking cellular activity patterns to ethologically relevant behaviors, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for chronic imaging across studies, reducing redundant surgical preparation and enhancing cross-project consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cortical circuit function and enabling cell-type-specific interrogation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through chronic implant design and magnetic baseplate system for consistent daily imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing circuit-level phenotypic data that reduces late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in behaving animals, improving capital efficiency in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery, viral vector handling, and in vivo microscopy for successful probe implantation and imaging.
- Depends on miniaturized fluorescence microscopy systems, stereotaxic manipulators, and acquisition software for optical alignment and data collection.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, imaging, and behavioral science groups to ensure reproducible preparation and handling.
- Involves adaptation considerations for different brain regions, animal species, and behavioral paradigms beyond somatosensory cortex and object exploration.
- Includes practical limitations such as surgical recovery time, potential tissue response to chronic implants, and the need for daily calibration to maintain imaging quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Prism Probe Implant Surgery
9:52
Conclusion
8:33
Results: Calcium Dynamics from Superficial and Deep Layers of Somatosensory Cortex of a Representative Mouse Imaged with the Microscope
4:52
Baseplate Attachment for Miniature Microscope Installation
7:22
Imaging Multiple Cortical Layers in a Freely Moving Mouse
