Name: Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę wielowarstwowego obrazowania aktywności neuronów w korze mózgowej u swobodnie poruszających się myszy przy użyciu sond pryzmatycznych i zminiaturyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować V. Jayaramanowi, D.S. Kimowi, L.L. Loogerowi i K. Svobodzie z projektu Genetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector (GENIE) w Janelia Research Campus of the Howard Hughes Medical Institute za hojną darowiznę AAV1-GCaMP6f na rzecz University of Pennsylvania Vector Core. Chcieliby również podziękować A. Olsonowi i Neuroscience Microscopy Core na Uniwersytecie Stanforda, wspieranemu przez NIH NS069375 grant za ich usługi mikroskopii konfokalnej.

<ol><li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li>
<li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li>
<li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li>
<li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+underlying+effort%2C+time%2C+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li>
<li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li>
<li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698(2016).</li>
<li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Sys.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158(2015).</li>
<li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obsessive-compulsive+disorder%3A+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li>
<li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells%2C+including+respective+grid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li>
<li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li>
<li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763(2016).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li>
<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Rowland, D. C., Moser, M. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cortical+modules+to+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li>
<li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li>
<li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li>
<li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharma.+Rev%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li>
<li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice%3A+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068(2014).</li>
</ol>

Autorzy zapoznali się z polityką czasopisma i mają następujące konkurencyjne interesy: SG, SO i VC są płatnymi pracownikami Inscopix.

Zrozumienie aktywności obwodów nerwowych podczas czuwania jest istotnym poziomem badań neurobiologicznych potrzebnych do skutecznego zbadania funkcji mózgu w zdrowiu i chorobie. Kora mózgowa jest szczególnie ważnym regionem do badania w kontekście zachowania na jawie, ponieważ odgrywa ważną rolę w wielu ważnych funkcjach sensorycznych, poznawczych i wykonawczych28,29.
Uważa się, że kolumna korowa jest podstawową jednostką funkcjonalną w korze mózgowej, a wiadomo, że aktywność komórek korowych na poziomie populacji różni się w zależności od ich fizycznego położenia w kolumnie. Na przykład neurony pobudzające w warstwach 2/3 kory somatosensorycznej rzutują głównie na inne obszary kory nowej i modulują inne sieci korowe30, podczas gdy komórki w głębszych warstwach rzutują głównie na regiony podkorowe, takie jak wzgórze31. Rejestrowanie aktywności setek wcześniej określonych komórek korowych jednocześnie i niezawodnie w czasie na różnych blaszkach u swobodnie zachowujących się osób znacznie poszerzyłoby nasze zrozumienie przepływu informacji korowych, umożliwiając dokładniejszą funkcjonalną analizę kolumn korowych na podstawie informacji behawioralnych w czasie rzeczywistym i skal czasowych istotnych dla zadania.
Gromadzenie danych o obwodach neuronowych na tym poziomie jest możliwe dzięki zastosowaniu wydajnej i usprawnionej zminiaturyzowanej platformy mikroskopowej do przeprowadzania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ u swobodnie zachowujących się osób (lub osób z głową w zależności od potrzeb). Stosowany z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia w celu umożliwienia celowania specyficznego dla typu komórki i obrazowania wielowarstwowego pola widzenia zapewnianego przez przewlekle wszczepioną sondę pryzmatyczną, protokół ten zbadał jeden przypadek spośród wielu możliwych zastosowań: obserwację laminarnych różnic w somatosensorycznym przetwarzaniu korowym, gdy myszy fizycznie angażowały się w nowy obiekt (Figura 5). Jest to pierwsza proceduralna ilustracja tego rodzaju specyficznego dla typu komórki, in vivo podejścia do badania wielu warstw korowych u obudzonych, swobodnie zachowujących się zwierząt, i poszerza spektrum dostępnych metod eksperymentalnych do zrozumienia struktur laminarnych w aktywnym mózgu.
Peryskopowe pole widzenia, które umożliwia sonda pryzmatyczna w tej technice, może być z powodzeniem zastosowane do innych struktur mózgu, gdy pożądane jest zachowanie tkanki bezpośrednio grzbietowej do obszaru zainteresowania; na przykład obrazowanie CA3 można uzyskać bez zakłócenia funkcji hipokampa.
Podejście oparte na sondzie pryzmatycznej do obrazowania aktywności Ca2 + wymaga fizycznego wprowadzenia i trwałego wszczepienia mikropryzmatu do kory mózgowej, co jest równoznaczne z utworzeniem zmiany korowej w miejscu, w którym wprowadzana jest sonda soczewkowa. Może to spowodować zakłócenia lokalnych obwodów neuronalnych, w tym zerwanie dendrytów i procesów wierzchołkowych. Procedura ta spowoduje również początkową aktywację komórek glejowych w regionie, chociaż oczekuje się, że zostanie ona zlokalizowana w tkance około 150 μm od powierzchni pryzmatu i ustąpi po zagojeniu się mózgu22. Bardzo ważne jest, aby rozważyć, czy ta technika wpłynie na normalną anatomię obwodu i/lub zachowanie zwierząt podczas planowania eksperymentów. Grupy kontroli behawioralnej powinny być zawsze przeprowadzane, aby upewnić się, że nie ma znaczących zmian w podstawowych zachowaniach, które mogłyby spowodować mylące wyniki eksperymentalne.
Wykorzystanie tej zminiaturyzowanej, mobilnej techniki obrazowania Ca2 + z manipulacją neurofarmakologiczną, różnymi paradygmatami poznawczymi, społecznymi, motorycznymi lub behawioralnymi oraz połączenie jej z innymi wskaźnikami fizjologicznymi może pogłębić i wzbogacić badania skoncentrowane na zrozumieniu funkcjonalnych ról obwodów nerwowych w zachowaniu i przetwarzaniu sygnałów32. Tłumienie lub aktywacja pewnych szlaków modulowanych przez leki może wpływać na powiązane zachowania, które można łatwo badać za pomocą tej technologii33. Rozgałęzianie się na różne typy komórek poprzez modyfikację ukierunkowania wskaźnika wapnia to kolejne potężne i użyteczne zastosowanie, które umożliwia wiele kreatywnych kombinacji narzędzi eksperymentalnych w celu rozwiązania różnych problemów dotyczących obwodów neuronalnych.

Kora jest kluczowym graczem w wielu złożonych funkcjach umysłowych i behawioralnych, od uwagi, percepcji sensorycznej i kontroli poznawczej odgórnej1,2,3 do ścieżek motywacyjnych, nagród i uzależnień4,5. Zrozumienie procesów obliczeniowych, które leżą u podstaw jego funkcji, jest ważnym celem lepszego zrozumienia klinicznego wielu zaburzeń psychicznych i behawioralnych.
Wiele obecnych teorii chorób psychiatrycznych skupia się wokół idei, że dysfunkcja lub brak koordynacji obwodów nerwowych kory mózgowej może leżeć u podstaw zaburzeń poznawczych i behawioralnych, które są cechami charakterystycznymi stanów takich jak schizofrenia6, autism7 lub zaburzenie obsesyjno-kompulsywne8. W związku z tym uzyskanie danych o aktywności neuronalnej na poziomie populacji z obwodów korowych w odpowiednim kontekście jednoczesnych informacji behawioralnych ma ogromne znaczenie i idealnie może być ukierunkowane na określone typy komórek w celu dokładniejszej sekcji obwodów neuronalnych.
Zminiaturyzowane mikroskopy w połączeniu z wszczepialnymi mikrosoczewkami gradientowego indeksu załamania światła (GRIN) umożliwiają optyczny dostęp do zespołów neuronalnych w warunkach swobodnego ruchu z różnych możliwych obszarów mózgu9,10,11,12,13, w tym cortex14,15,16. Korzystanie z mobilnego systemu mikroskopowego w połączeniu z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia pozwala na spójne obrazowanie tej samej populacji komórkowej obejmującej setki neuronów w ciągu dni lub tygodni w wielu regionach mózgu9, i może być genetycznie ukierunkowana na określone typy komórek za pomocą wektora wirusowego lub technik transgenicznych.
Ponieważ wiadomo, że kora mózgowa obsługuje różne funkcje i łączy się z różnymi obszarami mózgu, w zależności od lokalizacji komórek w blaszce korowej17,18,19, jesteśmy zainteresowani uzyskaniem jednoczesnej wielowarstwowej aktywności neuronalnej u osób zachowujących się w stanie czuwania. Tutaj pokazujemy, jak zobrazować setki fluorescencyjnie znakowanych neuronów u swobodnie zachowujących się myszy w ciągu kilku dni, używając zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego20 w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną, która oferuje wielowarstwowy widok kory mózgowej (Figura 1).
Używana tutaj sonda pryzmatyczna składa się z dwóch oddzielnych soczewek GRIN: pryzmatu i cylindrycznej soczewki przekaźnikowej (Rysunek 1). Światło z mikroskopu wzbudza fluorescencyjnie znakowane komórki znajdujące się wzdłuż powierzchni obrazowania sondy pryzmatycznej, po odbiciu od przeciwprostokątnej pryzmatycznej części sondy. Światło emitowane z komórek odbija się również od przeciwprostokątnej pryzmatu, jest zbierane przez obiektyw mikroskopu i dociera do czujnika w mikroskopie. Sonda pryzmatyczna użyta w tej procedurze jest przystosowana do łatwego użycia ze standardowym sprzętem stereotaktycznym.
Zminiaturyzowany mikroskop fluorescencyjny20 wykrywa stany przejściowe Ca2+ wywołane potencjałem czynnościowym w populacjach neuronów o rozdzielczości pojedynczej komórki, po tym jak komórki te zostały specjalnie oznaczone genetycznie kodowanymi wskaźnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na Ca2+. W tym protokole wstrzykujemy wskaźnik Ca2+ zakodowany w wektorze wirusowym (AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), wszczepić sondę pryzmatyczną, zainstalować mikroskop, a następnie uzyskać dane o aktywności neuronalnej somatosensorycznej (kończyna tylna S1) z wielu dni od zwierzęcia wystawionego na działanie nowych powierzchni obiektów podczas swobodnej eksploracji (ryc. 2).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized Ultra precyzyjny instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Chirurgia i obrazowanie</td></tr><tr><td>Mini sonda termistorowa odbytnicy (średnica .062"/1,6 mm) - 1/4" Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Chirurgiczna</td></tr><tr><td>poduszka grzewcza 5 x 12,5 cm&nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Chirurgiczny</td></tr><tr><td>regulator temperatury DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Chirurgiczna</td></tr><tr><td>pompa mikrostrzykawkowa</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model UMP3; seryjny 155788 F110</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &mu; L Świat strzykawek</td><td>Instrumenty precyzyjne</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Końcówka skośna Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Frezy chirurgiczne</td></tr><tr><td>do Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Obrazowania</td></tr><tr><td>AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&nbsp;</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gąbka żelpiankowa 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>kleszcze Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Noże preparacyjne</td><td>Grzywna Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>implantów chirurgicznych ProView</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Chirurgia i obrazowanie</td></tr><tr><td>Sonda pryzmatyczna ProView o średnicy 1,0 mm o średnicy ~4,3 mm</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Chirurgia i obrazowanie</td></tr><tr><td>Zestaw kleju Kwik-Sil składający się z 2</td><td>światowych instrumentów precyzyjnych</td><td>Chirurgia KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz Kwik-Cast</td><td>World Instrumenty</td> <td>precyzyjneKWIK-CAST</td><td>Chirurgia i obrazowanie</td></tr><tr><td>Miniaturowy optyczny słupek montażowy Newport</td><td></td><td>M-TSP-3</td><td>Mikroskop do obrazowania</td></tr><tr><td>Płytka bazowa</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td></td></tr><tr><td>Osłona podstawy mikroskopu</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Obrazowanie</td> Inscopix BPC-2</tr></tbody></table>

wielowarstwowe obrazowanie kory ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Obrazowanie funkcjonalne obwodów i komórek in vivo jest kluczowym narzędziem do zrozumienia mózgu w działaniu. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości mysich neuronów korowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej dostarczyło unikalnych informacji na temat struktury, funkcji i plastyczności kory mózgowej. Jednak badania te są ograniczone do zwierząt z unieruchomioną głową, co znacznie zmniejsza złożoność behawioralną dostępną do badań. W tym artykule opisujemy procedurę wykonywania przewlekłej mikroskopii fluorescencyjnej z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie zachowujących się myszy. Użyliśmy zintegrowanego zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną, aby jednocześnie wizualizować i rejestrować dynamikę wapnia setek neuronów w wielu warstwach kory somatosensorycznej, gdy mysz angażowała się w nowe zadanie eksploracji obiektów przez kilka dni. Technika ta może być zaadaptowana do innych obszarów mózgu u różnych gatunków zwierząt dla innych paradygmatów behawioralnych.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu przedstawia skuteczną i wydajną metodę prowadzenia podłużnego wielowarstwowego obrazowania Ca2+ setek neuronów korowych u myszy w stanie swobodnego zachowania z wykorzystaniem sond pryzmatycznych (Rysunek 1). Poprzednie podejścia do wielowarstwowego obrazowania kory ograniczały się głównie do zwierząt z unieruchomioną głową 2,23,24,25,26,27. Aby uzyskać dane na tym poziomie w kontekście swobodnego zachowania, zastosowano platformę miniaturowego mikroskopu w celu zapewnienia elastyczności behawioralnej; użyto genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GCaMP6f) do ukierunkowania na konkretną populację komórek (komórki CAMKII+ w korze); oraz wybrano sondę pryzmatyczną, aby zapewnić przewlekłe, wielowarstwowe pole widzenia.
Przedstawiliśmy przebieg prac związanych z przygotowaniem zwierzęcia do obrazowania. Do kory wstrzyknięto wektor wirusowy kodujący odpowiedni wskaźnik wapnia (Rysunek 2, krok 1), a następnie trwale wszczepiono sondę pryzmatyczną, aby umożliwić dostęp optyczny do znakowanych komórek (Rysunek 2, krok 2). Następnie na głowie zwierzęcia zamontowano płytkę bazową, służącą jako stabilny, tymczasowy uchwyt do pozycjonowania mikroskopu podczas sesji obrazowania (Rysunek 2, krok 3), co umożliwiło wizualizację aktywności korowej w wielu warstwach komórkowych w układzie eksperymentalnym z zachowaniem aktywności zwierzęcia w stanie czuwania (Rysunek 2, krok 4).
Aby upewnić się, że celem była pożądana populacja komórek, na Rysunku 3 przedstawiono pośmiertny koronalny przekrój mózgu reprezentatywnej myszy z zaznaczonym traktem sondy pryzmowej oraz polem widzenia w odniesieniu do neuronów etykietowanych GCaMP6f w warstwach 2/3 i 5 kory somatosensorycznej.
Podczas obrazowania zachowania zwierząt w stanie czuwania za pomocą systemu, rejestrowano aktywność neuronów kory somatosensorycznej, gdy mysz była eksponowana na trzy różne środowiska: Otwarte Pole (Dzień 1), Zapoznanie z Obiektami (Dzień 2-4) oraz Nowy Obiekt (Dzień 5) (Rysunek 4). Pierwszego dnia mysz umieszczono w arenie behawioralnej pozbawionej jakichkolwiek obiektów. W dniach 2-4 mysz umieszczano w arenie z tymi samymi dwoma obiektami o różnej teksturze (podkładka żelowa i drewniany klocek). Piątego dnia jeden z obiektów zastąpiono nowym obiektem. Obrazowanie zwierzęcia trwało 5 dni po 20 min każdego dnia.
Po ekstrakcji komórek przy użyciu oprogramowania do analizy danych obrazowych Ca2+, filtry przestrzenne odpowiadające lokalizacjom komórek nałożono na projekcję średniej intensywności fluorescencji z danych rejestracji mikroskopowej (Rysunek 5)). Biała przerywana linia oddziela komórki warstw 2/3 i 5. Odpowiednie przebiegi Ca2+ z 5 komórek z każdej z warstw pokazują wzorzec wyładowań komórek w dwóch różnych kontekstach behawioralnych: zapoznaniu z obiektem oraz ekspozycji na nowy obiekt. Komórki warstwy 2/3 były bardziej aktywne w porównaniu z komórkami warstwy 5 w dniu, w którym mysz została poddana ekspozycji na nowy obiekt. Jest to również widoczne na wykresach rastrowych, które przedstawiają aktywność wyładowań przekraczających próg dla wszystkich obrazowanych komórek w dniach 1, 4 i 5.
<img alt="Konfiguracja sondy pryzmatycznej miniskopu do obrazowania GCaMP; schematy i wyniki fluorescencji pola." src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: In vivo Ca2+ Obrazowanie wielu warstw korowych u swobodnie poruszających się myszy. (A) Specyfikacja sondy pryzmowej i przedstawienie płaszczyzny obrazowania. Powłoka refleksyjna na wewnętrznej stronie przeciwprostokątnej umożliwia obrazowanie 90° od płaszczyzny wprowadzenia sondy pryzmatycznej. Mufa soczewki integruje się z uchwytem soczewki, co usprawnia procedurę implantacji i umożliwia potencjalną obserwację fluorescencji tkanek otaczających podczas implantacji (B) (i). Ilustracja rozmieszczenia kraniotomii pod sondę pryzmatyczną i nacięcia nożem względem miejsca wstrzyknięcia wirusa oraz (ii) ilustracja położenia płaskiej strony sondy pryzmatycznej względem nacięcia nożem i miejsca wstrzyknięcia wirusa. (CIlustracja in vivo Ca2+ układ obrazowania przedstawiający drogę światła dla niewielkiego obszaru w obrębie pełnego pola widzenia poprzez sondę pryzmatyczną wszczepioną w korę mózgu myszy.DPrzykład pola widzenia podczas instalacji sondy pryzmatycznej. Mikroskop miniaturowy jest przymocowany do uchwytu soczewki, który trzyma sondę pryzmatyczną, umożliwiając sprawdzenie ekspresji wirusa podczas instalacji sondy.E) Integracja mikroskopu z sondą pryzmatyczną do wielowarstwowego obrazowania kory z komórkami S1 znakowanymi GCaMP6f. F Przykład pola widzenia podczas instalacji płytki bazowej. W momencie instalacji płytki bazowej widoczny jest wyraźny wzór naczyń krwionośnych, a w obrazie surowym widoczne są niektóre komórki. Po włączeniu funkcji DF/F w oknie oprogramowania akwizycyjnego wyraźnie widocznych jest więcej komórek. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Harmonogram obrazowania mózgu myszy; etapy: iniekcja wirusa, sonda pryzmatyczna, płyta bazowa, mikroskop." src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat przedstawiający harmonogram zdarzeń w procesie implantacji sondy pryzmatycznej i instalacji mikroskopu. Liczba tygodni została przedstawiona na osi X, a kroki procedur w ramach przepływu pracy na osi Y.AGrafika ilustrująca iniekcję wirusową (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) wzdłuż tej samej osi grzbietowo-brzusznej w celu znakowania wielu warstw kory somatosensorycznej myszy.B) 2 tygodnie po wstrzyknięciach wirusa implantowany jest pryzmatyczny sensor (prism probe) w osi równoległej do miejsc wstrzyknięć wirusa. (COkoło tydzień po implantacji sondy pryzmowej sprawdza się pod mikroskopem, czy występuje ekspresja; jeśli widoczna jest populacja komórek, na głowie zwierzęcia montuje się płytkę podstawową.DZwierzę jest następnie gotowe do obrazowania chronicznego podczas odpowiednich zadań behawioralnych (Rysunek myszy zmodyfikowany po uzyskaniu zgody od UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie tkanki mózgowej za pomocą sondy pryzmatycznej; mikroskopia fluorescencyjna; opona twarda i miękka; płaszczyzna ogniskowania." src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Pośmiertna walidacja histologiczna lokalizacji sondy Prism oraz ekspresji GCaMP. (A) Przekrój wieńcowy reprezentatywnego mózgu mysiego przedstawiający tor sondy pryzmatycznej, z jej stroną obrazującą skierowaną w stronę komórek wykazujących ekspresję GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f wykazujący ekspresję w neuronach warstw 2/3 i 5). (B) Ten sam koronalny przekrój mózgu po barwieniu DAPI. Pasek skali = 250 µm (C) Powiększony widok komórek wykazujących ekspresję GCaMP6f w korze somatosensorycznej. Pasek skali = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Mapa ciepła przedstawiająca aktywność zwierząt w otwartym polu, podczas zapoznawania z obiektem oraz ekspozycji na nowy obiekt." src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Aktywność myszy podczas habituacji, oswajania i testu ekspozycji na nowy obiekt była śledzona za pomocą oprogramowania wideo. (AW 1. dniu zwierzę umieszczono w arena behawioralnej pozbawionej jakichkolwiek obiektów (Open Field).B) W dniach 2–4 w arenie umieszczono te same dwa obiekty o różnej teksturze (podkład żelowy i blok drewniany) (Oswajanie z Obiektami). (C) W 5. dniu jeden z obiektów zastąpiono nowym przedmiotem (drewniany blok z papierem ściernym) (Ekspozycja na Nowy Obiekt). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza aktywności neuronalnej, dane elektrofizjologiczne; wizualizacja za pomocą wykresów liniowych i punktowych; 151 komórek, głębokość warstwy." src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Dynamika wapnia w warstwach powierzchownych i głębokich kory somatosensorycznej reprezentatywnej myszy obrazowanej za pomocą mikroskopu. (A) Nałożony obraz neuronalnych filtrów przestrzennych (zielone plamy) i projekcja średniej intensywności fluorescencji z zapisu mikroskopowego w polu widzenia sondy pryzmatycznej. Granica między warstwami supragranularnymi a infragranularnymi zaznaczona białą przerywaną linią. Pasek skali = 100 µm. (B) Przebiegi wapniowe z pięciu przykładowych komórek z warstwy powierzchownej i głębokiej (wypełnione niebieskie i czerwone komórki na panelu A), wskazujące jednostki odchylenia standardowego fluorescencji po analizie głównych i niezależnych komponentów. Poziomy pasek skali 50 s i pionowy pasek skali 10 S.D. (CWykres rastrowy komórek z warstw powierzchownych (warstwy 2/3) i głębokich (warstwa 5) przedstawiony podczas testu otwartego pola (Open field), zapoznawania z obiektem (Object Familiarization) oraz eksploracji nowego obiektu (Novel object exploration). Pasek skali = 10 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie jednoczesnej wizualizacji aktywności neuronalnej w wielu warstwach neuronów korowych przy użyciu wskaźników wapnia u swobodnie poruszającej się myszy oraz zrozumienie funkcjonowania obwodów neuronalnych za pomocą zminiaturyzowanego fluorescencyjnego mikroskopu montowanego na głowie. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki systemowej, takie jak sposób propagacji informacji pomiędzy wieloma warstwami kory mózgowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na niezawodną w czasie wizualizację dużych populacji genetycznie kodowanych neuronów w wielu warstwach kory u zwierząt zachowujących swobodną aktywność.Aby zwizualizować genetycznie kodowane neurony z wielu warstw kory u zwierzęcia w stanie swobodnego zachowania, należy przeprowadzić następujące procedury; niniejszy protokół przedstawia implantację sondy pryzmatycznej, instalację płyty podstawowej oraz obrazowanie in vivo u myszy w stanie swobodnego zachowania. Aby rozpocząć tę procedurę, jeden do dwóch tygodni po wstrzyknięciu wirusa, umieść zwierzę w aparacie stereotaksycznym i przygotuj się do operacyjnego wszczepienia sondy pryzmatycznej, dezynfekując ją 70% etanolem i czyszcząc papierem do soczewek. Następnie wykonaj okrągłą kraniotomię, używając mikrowiertarki z wiertłem o średnicy 0,5 mm.Należy upewnić się, że średnica otworu trepanacyjnego jest nieco większa od średnicy pryzmatu. Następnie należy tak umieścić otwór trepanacyjny, aby po wprowadzeniu pryzmatu do kory jego płaska krawędź była skierowana w stronę miejsca wstrzyknięcia wirusa i znajdowała się w promieniu od 150 do 200 micronów. Po tym zabiegu należy usunąć oponę twardą za pomocą precyzyjnej pęsety.Po odsłonięciu tkanki mózgowej należy stale utrzymywać jej wilgotność za pomocą sterylnej soli fizjologicznej. Pozwoli to również zachować odpowiedni nacisk na tkankę. Aby zmniejszyć ucisk w tkance mózgowej podczas wprowadzania sondy pryzmatycznej, należy utworzyć kanał wprowadzający, mocując nóż do sekcji o prostym ostrzu do ramienia uchwytu elektrod w aparaturze stereotaktycznej.Zamocuj go pod kątem tak, aby płytka noża była prostopadła do krzywizny czaszki i znajdowała się w płaszczyźnie równoległej do kolumny wstrzykiwania wirusa. Ostrożnie ustaw nóż nad otworem trepanacyjnym, wzdłuż jego przyśrodkowej krawędzi wewnętrznej i około 200 mikronów bocznie od miejsca wstrzyknięcia wirusa, z krawędzią tnącą skierowaną ku tyłowi. Wyzeruj oś Z w momencie, gdy końcówka noża dotknie omiaki.Następnie stopniowo obniż go do głębokości, na którą zostanie wprowadzona sonda pryzmatyczna. Następnie przesuń nóż o jeden milimetr do tyłu, aby stworzyć przejście dla przedniej krawędzi pryzmatu. Powoli wycofaj nóż, korzystając z mikromanipulatora ramienia stereotaktycznego w przyrostach 10 micron na sekundę, a nad nacięciem umieść kawałek gąbki z pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną.Następnie przymocuj uchwyt soczewki do ramienia manipulatora stereotaktycznego pod tym samym kątem, co nóż w poprzednim kroku. Ustaw pryzmat tak, aby jego płaska strona znajdowała się nad nacięciem i równolegle do kolumny iniekcji wirusa. Gdy pryzmat znajdzie się pod odpowiednim kątem, stopniowo opuszczaj go do mózgu w krokach co 10 micron, aż do końcowego poziomu Z wynoszącego 1,1 millimeter od powierzchni mózgu, dla tej sondy.Przykryj każdą odsłoniętą tkankę wokół pryzmatu w otworze trepanacyjnym bardzo cienką ochronną warstwą kleju elastomerowego, używając igły 25G. Aby zapobiec przesuwaniu się soczewki wewnątrz otworu trepanacyjnego, po utwardzeniu kleju elastomerowego użyj igły 25G, aby nanieść klej cyjanoakrylanowy i przytwierdzić szkło soczewki pryzmatu do przyległej czaszki na warstwie kleju elastomerowego. Po utwardzeniu kleju cyjanoakrylanowego odkręć uchwyt soczewki i ostrożnie usuń mikroskop.Następnie powoli wycofaj ramię manipulatora stereotaktycznego, pozostawiając sondę pryzmatyczną bezpiecznie implantowaną. Nałóż warstwę akrylu dentystycznego lub kleju cyjanoakrylowego wokół implantu, aby zakryć odsłoniętą powierzchnię czaszki, nie dotykając przy tym otaczającej, odsuniętej tkanki mięśniowej. Pokrycie w ten sposób dużego obszaru czaszki tzw. czapką kranialną ułatwi późniejsze przymocowanie płyty podstawy.Następnie wymieszaj katalizator i bazę z silikonowej strzykawki z klejem i nanieś kroplę elastomeru do wnętrza osłonki sondy pryzmatycznej, aby pokryć górną część soczewki sondy w celu zapobiegania uszkodzeniom i osadzaniu się kurzu. Od jednego tygodnia do 10 dni po implantacji sondy pryzmatycznej sprawdź ekspresję wirusa w tkance za pomocą wszczepionej sondy. W tym celu usuń silikonową nasadkę z kleju z powierzchni soczewki implantowanej sondy pryzmatycznej.Należy zbadać powierzchnię soczewki sondy i delikatnie oczyścić ją z wszelkich zanieczyszczeń za pomocą papieru do soczewek i 70% etanolu, aby upewnić się, że powierzchnia obrazująca jest czysta. Następnie do mikroskopu należy przymocować płytkę podstawową i dokręcić śrubę mocującą płytkę, aby utrzymać ją w pozycji. Następnie należy zamocować mikroskop w uchwycie mikroskopowym na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora.Przymocuj chwytak do pręta, który można zamontować na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora. Następnie, używając ramienia stereotaktycznego mikromanipulatora, ustaw mikroskop nad soczewką sondy pryzmatycznej. Sprawdź wizualnie orientację, oglądając soczewkę pryzmatyczną z boku i z tyłu stołu zwierzęcego.Należy wyrównać osie optyczne obiektywu mikroskopu oraz sondy pryzmatycznej. Następnie należy uruchomić oprogramowanie do akwizycji, wybrać projekt i włączyć diodę LED mikroskopu za pomocą oprogramowania. Jakość wyrównania mikroskopu należy ocenić w oprogramowaniu do akwizycji, ustawiając ostrość na górnej fazie soczewki wszczepionej sondy pryzmatycznej poprzez przesuwanie ramienia manipulatora stereotaktycznego.Po prawidłowym ustawieniu krawędzie soczewki sondy pryzmatycznej powinny być wyraźne. Dostosuj fizyczny dystans mikroskopu nad wszczepioną sondą pryzmatyczną, korzystając z ramienia manipulatora stereotaktycznego, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę ogniskowania wewnątrz tkanki. Następnie użyj akrylu dentystycznego lub cyjanoakrylanu, aby na stałe przymocować płytkę podstawową do akrylowej nasadki w celu wypełnienia przerwy.Kluczowe jest, aby nie nakładać kleju na żadną część korpusu mikroskopu ani na śrubę dociskową podczas przyklejania płytki podstawy do głowy zwierzęcia. Teraz zwolnij mikroskop z chwytaka i wycofaj chwytak z mikroskopu. Jeśli użyto cyjanoakrylanu lub innego przezroczystego kleju, należy pokryć go czarnym lakierem do paznokci lub warstwą czarnego cementu dentystycznego, aby zapobiec przedostawaniu się światła otoczenia do nasadki głowy, co mogłoby zanieczyścić obrazy pozyskane podczas przyszłych eksperymentów.Następnie zabezpiecz implantowaną sondę pryzmatyczną osłoną płyty podstawowej. W tej procedurze podłącz mikroskop do modułu akwizycji danych połączonego z komputerem i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Następnie zdejmij osłonę płyty podstawowej, odkręcając śrubę ustalającą płyty podstawowej w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyjmując osłonę.Ustaw mikroskop na płytce podstawy zwierzęcia. Mikroskop powinien wskoczyć na miejsce dzięki magnesom znajdującym się na płytce podstawy. Następnie dokręć śrubę regulacyjną płytki podstawy, aż poczujesz lekki opór.Następnie wybierz ustawienia akwizycji do zbierania danych, w tym częstotliwość próbkowania klatek. Podczas wybierania ustawień sprawdź histogram obrazu, aby upewnić się, że stosunek sygnału do szumu jest odpowiedni. Następnie rozpocznij zbieranie danych.Po zakończeniu nagrywania poluzuj śrubę mocującą płytę podstawy i odłącz mikroskop od płyty, delikatnie go podnosząc. Następnie załóż osłonę płyty podstawy i delikatnie dokręć śrubę mocującą. Poniżej znajduje się demonstracja zwierzęcia z zamontowanym mikroskopem, swobodnie wchodzącego w interakcje z obiektami w arenie behawioralnej.Podczas obrazowania zachowania zwierząt w stanie czuwania z wykorzystaniem systemu, rejestrowano aktywność neuronów kory somatosensorycznej, gdy mysz była wystawiona na trzy różne środowiska: otwarte pole w pierwszym dniu, zapoznanie z obiektem od drugiego do czwartego dnia oraz nowy obiekt w piątym dniu. Po ekstrakcji komórek za pomocą oprogramowania do analizy danych obrazowania wapniowego, filtry przestrzenne odpowiadające lokalizacjom komórek nałożono na projekcję średniej intensywności fluorescencji danych z rejestracji mikroskopowej.Biała przerywana linia oddziela komórki z warstwy drugiej, trzeciej i piątej. Odpowiednie zapisy poziomu wapnia z pięciu komórek z każdej z warstw pokazują wzorzec aktywności komórek w dwóch różnych kontekstach behawioralnych: zapoznanie z obiektem oraz ekspozycja na nowy obiekt. Komórki z warstwy drugiej i trzeciej były bardziej aktywne w porównaniu z komórkami z warstwy piątej w dniu, w którym mysz została poddana działaniu nowego obiektu.Poniżej przedstawiono pozostałe wykresy aktywności komórek z powierzchniowych jednostek badawczych, zarejestrowane podczas przebywania zwierzęcia w otwartym polu, procesu zapoznawania z obiektem oraz eksploracji nowego obiektu. Po opanowaniu każdej z tych technik, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu godziny. Opracowana metoda otwiera drogę badaczom neuronauk systemowych do analizy specyficznych typów komórek w różnych obszarach mózgu, z wykorzystaniem różnych paradygmatów behawioralnych w droningach oraz innych modelach neurofizjologii chorób.Dzięki temu protokołowi należy uzyskać pełną wiedzę na temat tego, jak znakować wiele warstw kory somatosensorycznej, implantować sondę pryzmatyczną oraz mocować miniaturowy mikroskop montowany na głowie.

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Wprowadzenie prawokątnych mikropryzmatów do nowokory mózgu myszy umożliwia głębokie obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej dla preparatów przekrojowych. Mikropryzmaty o rozmiarze jednego milimetra zapewniają szerokie pole widzenia (~900 μm) oraz rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do zobrazowania kolców dendrytycznych. Prezentujemy obrazowanie neuronów warstwy V oraz obrazowanie naczyń krwionośnych nowokory z wykorzystaniem mikropryzmatów.

Obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Poznaj metodę wielowarstwowego obrazowania aktywności neuronów w korze mózgowej u swobodnie poruszających się myszy przy użyciu sond pryzmatycznych i zminiaturyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną (Wideo) | JoVE Journal

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca²⁺ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Przeglądaj więcej filmów