Name: Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj protokół przetwarzania i przechowywania próbek nowotworów skórnych w praktyce dermatologicznej. Metoda umożliwia zbieranie tkanek zabieganych podczas chirurgii Mohsa do badań biomarkerów bez zakłócania codziennej pracy klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, przyznany EEH, oraz Midwestern University Office of Research and Sponsored Programs Intramural Grant, przyznany KJL. Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez Affiliated Laboratories i Affiliated Dermatology. Dziękujemy Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody'emu Jordingowi, Stacie Schimke, Heather Kissel i Ali Zaidi za ich pomoc techniczną.

Wszystkie eksperymenty na próbkach tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez Western IRB (Protokół WIRB #20142461). Jedynym kryterium pobierania tkanek do tych procedur jest potwierdzone biopsją diagnoza SCC. W pierwotnym protokole IRB nie określono żadnych kryteriów wykluczenia, ale nie wykorzystano próbek od pacjentów ze stwierdzoną chorobą zakaźną przenoszoną przez krew. Świadomą zgodę uzyskano przed pobraniem tkanki skórnej, krwi i śliny. Midwestern Institutional Review Board zatwierdziła prace walidacyjne z próbkami biorepozytorium klinicznego na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim (AZ#807).
1. Przetwarzanie tkanki nowotworowej skóry
UWAGA: To ma być wykonane przez histotechnologa Mohsa.
<ol>
	<li>Przetwarzanie tkanki świeżego raka płaskonabłonkowego (SCC) na RNA i hodowlę eksplantatów
	<ol>
		<li>Po wycięciu tkanki przez chirurga Mohsa, przed dalszym przetwarzaniem należy pobrać próbkę tkanki o wielkości od 10 do 50 mg (≥10 mm3) ze środka wierzchołkowej strony tkanki podczas relaksacji (czyli procesu manipulowania tkanką, aby mogła leżeć płasko na szkiełku) przed dodatkowym przetwarzaniem. 
		UWAGA: Jest to możliwe tylko wtedy, gdy guz jest wystarczająco duży, aby umożliwić usunięcie próbki o wielkości 10-50 mg (≥10 mm2) przed oceną histologiczną, która jest częścią procedury Mohsa. Jeśli guz nie jest wystarczająco duży, aby umożliwić usunięcie co najmniej 2mm3, nie przystępuj do przetwarzania RNA (pomiń krok 5).</li>
		<li>Przenieść żywotną tkankę do znakowanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę hodowlaną (mieszanina 1:1 DMEM:Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) za pomocą pęsety i upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w pożywce. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C przed dalszą obróbką.</li>
		<li>Tkankę należy wykorzystać do izolacji RNA i analizy ekspresji (patrz krok 5) i/lub do założenia kultury eksplantatów (patrz krok 6) w ciągu 24 godzin.</li>
		<li>Umieść pozostałą część próbki guza, która została usunięta od pacjenta (krok 1.1.1) na uchwycie na tkanki kriostatu (lub "chuck"). Zanurzyć tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamrażając tkankę w posiadaczu, aby umożliwić zakończenie badań histologicznych metodą Mohsa i przygotowanie dodatkowych szkiełek histologicznych do analizy eksperymentalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów histologicznych
	<ol>
		<li>Wytnij skrawki tkanki o grubości 7 μm za pomocą kriostatu i utwórz dwa (lub więcej) szkiełka dla każdej próbki guza. Upewnij się, że każdy szkiełko zawiera do trzech sekcji całego guza. 
		UWAGA: Jeden z dwóch preparatów zostanie wybarwiony przy użyciu H&E przez histotechnologa Mohsa, a dodatkowe szkiełka mogą być przetworzone za pomocą analizy IF, IHC lub FISH.</li>
		<li>Umieść szkiełka w acetonie na 1-2 sekundy, aby utrwalić tkankę. Odłóż te szkiełka na bok do wyschnięcia. Nie należy barwić szkiełka ani szkiełka nakrywkowego H&E, które ma być wykorzystane do przyszłej analizy immunofluorescencji (IF), immunohistochemii (IHC) lub hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH), w zależności od protokołu eksperymentalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie tkanek po Mohsie
	<ol>
		<li>Po zakończeniu przetwarzania metodą Mohsa (kroki 1.1-1.2) należy pracować w komorze kriostatu i podważyć próbkę z podłoża do zatapiania w kriogenicznym roztworze i umieścić tkankę w oznakowanej probówce kriogenicznej.</li>
		<li>Umieścić oznakowaną fiolkę w ciekłym azocie przed rozmrożeniem tkanki. Jeżeli próbki mają być wykorzystane do analizy białka i/lub DNA, mogą one zostać przeniesione do ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -80 °C w ciągu kilku minut w celu przechowywania do przyszłej analizy ekspresji białek i mutacji DNA (patrz kroki 4-5). 
		UWAGA: Jeśli pożądane jest nienaruszone RNA z próbki po Mohsie, ważne jest, aby próbka była zamrożona podczas usuwania z pożywki kriozatapiającej. Jeśli na tym etapie nie zostanie zachowana szczególna ostrożność, próbka po badaniu Mohsa powinna być zarezerwowana do analizy białka i/lub DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie świeżych mrówek
	<ol>
		<li>W momencie zamknięcia Mohsa uzyskaj ANT od chirurga Mohsa.</li>
		<li>Usunąć równą lub większą ilość ANT, jaka została pobrana z próbki SCC (patrz wyżej) ze strony wierzchołkowej normalnej tkanki i przenieść ją do znakowanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę hodowlaną (mieszanina 1:1 DMEM:Ham's F-12 uzupełniona 25 mM HEPES, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) za pomocą pęsety.</li>
		<li>Całkowicie zanurzyć tkankę w tej samej pożywce hodowlanej i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu późniejszego przetwarzania (patrz kroki 4-6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie krwi, śliny i wymazów z policzka
<ol>
	<li>Uzyskać około 10 ml krwi w probówkach do pobierania EDTA przez nakłucie żyły.</li>
	<li>Przenieść krew z probówek zbiorczych do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 lub 50 ml. Usunąć około 200 μl do probówki kriogenicznej o pojemności 1,5 ml, unikając pęcherzyków; Próbkę krwi pełnej należy przechowywać w temperaturze -80 °C, aby w razie potrzeby wykorzystać ją do przyszłego genotypowania i dopasowania tkanek.
	<ol>
		<li>Odwiruj pozostałą krew o masie 1 000 x g przez 30 minut i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami, aby pobrać frakcję osocza.</li>
		<li>Podwielokrotnić osocze na porcje o wielkości 1 ml w probówkach kriogenicznych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania podczas przyszłych analiz biopsji płynnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj sterylnego wacika, aby uzyskać wymaz z policzka sample i przechowuj wymazówkę w sterylnej probówce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W razie potrzeby pobrać próbkę śliny i przechowywać w sterylnej probówce w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Próbki te mogą być wykorzystane do przyszłego genotypowania i dopasowania tkanek, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
</ol>
3. Ewidencja próbek
<ol>
	<li>Przesyłanie informacji z listy kontrolnej próbek pobranych od pacjentów do bazy danych biorepozytorium. Dołącz informacje o pacjencie i diagnozę z karty pacjenta.</li>
	<li>Wydrukuj etykiety z kodem kreskowym dla każdej próbki i zapisz ją w bazie danych, aby połączyć każdą pobraną próbkę z danymi pacjenta.</li>
	<li>Rejestruj rozmieszczenie próbek pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację w bazie danych biorepozytorium przed przekazaniem próbek do laboratorium badawczego.</li>
</ol>
4. Izolacja białek i analiza Western Blot
<ol>
	<li>Umieścić każdą próbkę tkanki (SCC i/lub ANT) w fiolce zawierającej 500 μl buforu do lizy komórek zawierającego inhibitory proteazy na 100 mg tkanki w celu lizy tkanki. 
	UWAGA: Użyliśmy buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), składającego się z 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% deoksycholanu sodu, 1,0% NP-40 i 0,1% SDS. Można stosować inne do lizy komórek.</li>
	<li>Homogenizować tkanki za pomocą homogenizatora tkankowego przez 5 minut w odstępach 20 s w temperaturze 4 °C. Wirować próbki w temperaturze 21 000 x g i 4 °C przez 20 minut i zebrać supernatant zawierający białko do świeżej probówki. Ponownie odwirować supernatant w tych samych warunkach i zebrać końcowy supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Elektroforeza 30-50 μg białka z każdej próbki przy użyciu 4-20% żelu gradientowego SDS-poliakrylamidowego. W razie potrzeby zabarwić żel kolorem Coomassie Blue, aby uwidocznić pasma białkowe.</li>
	<li>Jeśli potrzebna jest analiza Western blot białek eksprymowanych, należy przenieść białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przeniesieniu Ponceau wybarwia membranę PVDF, aby w razie potrzeby uwidocznić pasma białkowe.</li>
	<li>Zablokuj błonę PVDF i sondę, aby wykryć interesujące białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Należy stosować przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania, wraz z odpowiadającymi im przeciwciałami drugorzędowymi specyficznymi dla przeciwciał pierwszorzędowych, w stężeniach zalecanych przez producenta do analizy Western blot.</li>
	<li>Wystaw sondowaną membranę za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego i zobrazuj membranę za pomocą systemu obrazowania.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR)
<ol>
	<li>Natychmiast umieść świeże próbki tkanek (SCC i/lub ANT) w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór stabilizujący RNA, a próbki tkanek po Mohsie umieść w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej zamrożony roztwór do przemiany tkankowej, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Próbki te należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Pobrać próbki RNA z temperatury -80 °C i rozmrozić na lodzie. Przenieść tkankę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu do ekstrakcji RNA (tiocyjanian fenolu/guanidyny) na 50-100 mg tkanki.</li>
	<li>Poddać lizie tkanki za pomocą homogenizatora tkankowego. Przeprowadzić sześć cykli homogenizacji, po których następuje okres chłodzenia próbki; każdy cykl składa się z 20 s homogenizacji w temperaturze 4 °C i 40-sekundowego okresu chłodzenia. Po homogenizacji próbkę inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml buforu do ekstrakcji RNA i energicznie wstrząsać probówką ręcznie przez 15 s. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Usunąć fazę wodną próbki i umieścić ją w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 100% izopropanolu na 1 ml buforu do ekstrakcji RNA użytego w kroku 5.2 do fazy wodnej i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Jeśli przewiduje się, że wydajność RNA będzie niska (tj. początkowa objętość tkanki jest mniejsza niż 10 mg), próbki można wytrącić przez noc w temperaturze -80 °C. Dodatkowo, podczas etapu wytrącania izopropanolu można dodać 5 μg glikogenu wolnego od RNaz na 500 μl buforu do ekstrakcji RNA w celu poprawy wydajności RNA.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml 75% etanolu.</li>
	<li>Krótko wymieszać próbkę, a następnie wirować ją w temperaturze 7 500 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Wyrzucić umyte płuczki i suszyć granulki na powietrzu przez 5-10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad RNA w 20 μl wody wolnej od RNaz.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby oczyść każdą próbkę RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z zaleceniami producenta. 
		UWAGA: Małe RNA zostaną utracone z próbki, jeśli ten krok zostanie wykonany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza próbki o wielkości 1 μg przy użyciu 1,2% żelu agarozowego formaldehyd-MOPS w celu analizy jakości RNA. 
	UWAGA: Alternatywnie należy przeanalizować próbki za pomocą bioanalizatora, aby uzyskać numer RIN13.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA przy użyciu protokołu odwrotnej transkrypcji do analizy qPCR docelowych mRNA (lub miRNA) będących przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>
6. Tkankowe kultury eksplantatów
<ol>
	<li>Wysterylizuj wyciętą tkankę przed hodowlą, zanurzając tkankę w 70% etanolu.</li>
	<li>Umieść tkankę na szkiełku lub szalce i dodaj tyle pożywki hodowlanej (mieszanina 1:1 DMEM: Ham's F-12 uzupełniona 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny), aby pokryć tkankę (aby zapobiec wysuszeniu tkanki). Ostrożnie pokrój tkankę na fragmenty (<1 mm3) za pomocą ostrza skalpela.</li>
	<li>Przenieść fragmenty tkanek do 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej i dodać około 20 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na wierzch każdego fragmentu.</li>
	<li>Pozostaw naczynie otwarte w okapie hodowlanym na 20-30 minut lub do prawie wyschnięcia.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki hodowlanej (mieszanina 1:1 DMEM:Ham's F-12 uzupełniona 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) do każdej szalki i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Subkultura lub subklonuj kultury, jeśli to konieczne.</li>
</ol>

<ol><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biorepositories%3A+Building+better+biobanks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biorepositories: Building better biobanks.</a> Nature. 486, 141-146 (2012).</li>
<li>Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+cancer+center+data+bank+and+biorepository+for+multidisciplinary+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).</li>
<li>Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26974264">Building a biobank.</a> Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).</li>
<li>National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biospecimens.cancer.gov/practices">http://biospecimens.cancer.gov/practices</a> (2016).</li>
<li>Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+and+preservation+of+RNA+from+biobank+tissue+specimens%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review.</a> J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).</li>
<li>Campbell, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+ISBER+best+practices+for+repositories%3A+Collection%2C+storage%2C+retrieval+and+distribution+of+biological+materials+for+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research.</a> Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).</li>
<li>Neumeister, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+assess+tissue+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tools to assess tissue quality.</a> Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).</li>
<li>Vaught, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).</li>
<li>Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+high-risk+squamous+cell+carcinoma+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Treat+Options+Oncol%22%5BJournal%5D)">Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin.</a> Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).</li>
<li>Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+human+epidermal+keratinocyte+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Classical human epidermal keratinocyte cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).</li>
<li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).</li>
<li>Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+methodology+for+sequential+extraction+of+RNA+and+protein+from+small+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies.</a> J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).</li>
<li>Cooper, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+glycosylation+of+MUC1+in+epidermolysis+bullosa-associated+and+sporadic+cutaneous+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas.</a> Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).</li>
<li>Riihila, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+factor+H%3A+a+biomarker+for+progression+of+cutaneous+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma.</a> J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).</li>
<li>Ha Lan, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p40+isoform+of+p63+has+high+specificity+for+cutaneous+sarcomatoid+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cutan+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma.</a> J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).</li>
<li>Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p40+is+a+more+specific+marker+than+p63+for+cutaneous+poorly+differentiated+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cutan+Pathol%22%5BJournal%5D)">p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma.</a> J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).</li>
<li>Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+oral+squamous+cell+carcinoma+triggered+by+transforming+growth+factor-beta1+is+Snail+family-dependent+and+correlates+with+matrix+metalloproteinase-2+and+-9+expressions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions.</a> Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).</li>
<li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+biospecimen+research%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Developments in biospecimen research.</a> Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zgodnie z wiedzą autora, niniejszy protokół jest pierwszym tego rodzaju rozwiązaniem koncentrującym się na klinicznym pozyskiwaniu próbek tkanki skórnej w sposób kosztowo efektywny i szybki. Pacjenci poddawani mikrochirurgii Mohsa są zazwyczaj planowani w określonych blokach czasowych, a pobieranie próbek ogranicza się do tych okresów. Proces zbierania próbek wymaga zaangażowania asystenta medycznego opiekującego się pacjentem, histotechnika specjalizującego się w metodzie Mohsa, który przetwarza próbki guza, oraz wyznac...

Badania nad rakiem i biomarkerami opierają się na dostępie do wysokiej jakości próbek tkanek ludzkich, a ich ograniczona podaż utrudnia prowadzenie prac badawczych1,2. Wiele badań dermatologicznych jest ograniczonych przez niewystarczającą ilość, zmienną jakość oraz koszty związane z wykorzystaniem ludzkich tkanek. Koszt stworzenia dużego, wyspecjalizowanego biobanku szacuje się na około dwa miliony dolarów3, a wydatki te sprawiają, że korzystanie z ludzkich tkanek jest nieosiągalne dla wielu badaczy. Ponadto proces pozyskiwania i przechowywania próbek badawczych niesie ze sobą ryzyko zakłócenia operacji klinicznych i opóźnienia opieki nad pacjentem, jeśli nie zostanie przeprowadzony z należytą starannością. Utworzono kosztowo efektywne repozytorium biologiczne w ramach kliniki, które koncentruje się na próbkach raka skóry, zgodnie z zalecanymi najlepszymi praktykami oraz walidacją próbek4,5,6.
Niniejszy protokół został opracowany w klinice dermatologicznej, w której wykonuje się dużą liczbę mikrochirurgicznych operacji Mohsa w celu usunięcia raka kolczystokomórkowego (SCC), raka podstawnokomórkowego (BCC) oraz czerniaka skóry. Ochotniczy dawcy mogą być rekrutowani z tej populacji pacjentów. Ważne jest, aby biobank został utworzony w miejscu pobierania materiału, co pozwala na szybkie pozyskanie tkanek i krwi od pacjentów, którzy wyrazili zgodę, bez opóźniania leczenia. Gromadzenie próbek w tej samej klinice minimalizuje różnice w technikach pobierania oraz zmienność jakości próbek, co może być problematyczne w przypadku dalszych analiz7,8.
Celem techniki mikrochirurgii Mohsa jest zapewnienie usunięcia całej tkanki nowotworowej przy jednoczesnym zachowaniu jak największej ilości zdrowej tkanki. Procedura polega na stopniowym usuwaniu cienkich warstw tkanki guza. Każda kolejna warstwa jest badana histologicznie (po kriosekcjonowaniu tkanki guza i przeprowadzeniu barwienia H&amp;E) przez dermatologa w celu ustalenia, czy cała tkanka nowotworowa została usunięta. Wycięcie i badanie kolejnych warstw tkanek odbywa się w czasie, gdy pacjent pozostaje w gabinecie. Technikę tę uznaje się za najlepszą opcję leczenia SCC9. Na tym etapie rana zostaje zamknięta, a w celu poprawy gojenia i efektu kosmetycznego często wycina się sąsiadującą tkankę prawidłową (ANT). Zatem ta procedura chirurgiczna usuwania guza jest idealnie dostosowana do pobierania histologicznie scharakteryzowanej tkanki do przyszłych badań.
Procedura pozyskiwania próbek tkanki nowotworowej, sąsiadującej tkanki prawidłowej, śliny oraz krwi została zaprojektowana tak, aby w minimalnym stopniu wpływać na codzienne obowiązki personelu (Rycina 1). Asystenci medyczni pobierają krew podczas przygotowywania pacjenta do zabiegu. Po zakończeniu procedury Mohsa histotechnolog wykonuje dodatkowe preparaty histologiczne z próbki i przekazuje tkankę do biorepozytorium. Koszty związane z utworzeniem biorepozytorium obejmują zakup zamrażarek do kriokonserwacji, wydzielenie niewielkiej przestrzeni laboratoryjnej oraz opracowanie programu do śledzenia inwentarza.
<img alt="Przebieg pobierania próbek; schemat blokowy; rejestracja pacjenta, wymaz, pobranie krwi, wycięcie guza." src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Kolejność pobierania próbek i personel odpowiedzialny. Po zarejestrowaniu pacjenta i uzyskaniu jego zgody, asystent medyczny pobiera wymaz z policzka oraz krew. Następnie dermatolog i asystent medyczny wycinają guz i zamykają ranę, podczas czego pobierane są odpowiednio próbki SCC i ANT. Wyznaczony technik laboratoryjny przetwarza krew oraz wykonuje sekcjonowanie próbek SCC i ANT w celu hodowli tkankowej, konserwacji i wprowadzenia do biorepozytorium. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55583/55583fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Różnorodność pobranych próbek umożliwia zastosowanie wielu podejść eksperymentalnych (Rysunek 2). Próbki pobrane od pacjenta to wymazy z policzków (w razie potrzeby można również pobrać ślinę), krew pełna oraz wycięta tkanka. Wymazy z policzków i próbka krwi pełnej są przechowywane bez obróbki do genotypowania i dopasowania tkanek. Krew pełną rozdziela się na frakcje leukocytów (WBC) i osocza do dalszych analiz. Po opracowaniu metodą Mohsa zamrożony guz jest umieszczany bezpośrednio w ciekłym azocie, a następnie przenoszony do zamrażarki -80 °C. Świeże, żywe próbki tkanki nowotworowej oraz ANT są hodowane z zastosowaniem modyfikacji wcześniejszych technik10,11, a następnie krio konserwowane. Podczas pobierania liczba próbek każdego typu jest zapisywana w arkuszu kalkulacyjnym przed wprowadzeniem do programu śledzenia zapasów, aby ułatwić dokładne przetwarzanie (Tabela 1).
<img alt="Schemat przetwarzania próbek pacjentów w mikrochirurgii Mohsa, wirowanie, analiza histologiczna." src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat pobierania i przetwarzania próbek w klinicznym biorepozytorium. Od pacjenta pobiera się wymaz z policzka oraz próbkę krwi, które są przechowywane do późniejszego genotypowania i dopasowania tkanek. Krew pełna jest dalej przetwarzana w celu izolacji białych krwinek (WBC) i analizy CTC, a także w celu pobrania osocza i analizy biopsji płynnej. Tkanka wycięta podczas procedury Mohsa jest przetwarzana histologicznie do celów diagnostycznych, po czym preparaty histologiczne mogą być wykorzystane eksperymentalnie do dalszych analiz immunohistochemicznych. Jeśli wycięta próbka tkanki jest wystarczająco duża, część świeżej tkanki jest pobierana i sekcjonowana w celu izolacji białek i RNA oraz do ustanowienia linii komórkowych. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55583/55583fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Data pobrania:</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Pacjent 1</td >
			<td >Pacjent 2</td >
			<td >Pacjent 3</td >
			<td >Pacjent 4</td >
			<td >Pacjent 5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Inicjały i data urodzenia</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kolor oczu</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Rodzaj próbki</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Miejsce pobrania próbki</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Ślina</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Krew pełna</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Osocze</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Żywa tkanka guza</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Żywa tkanka prawidłowa</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Guz (metoda Mohsa), ciekły azot</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tkanka prawidłowa, ciekły azot</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Preparaty histologiczne</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Lista kontrolna do rejestracji pobrania próbek. Dane śledzone i zapisywane przy każdej pobranej próbce obejmują inicjały pacjenta, datę urodzenia i kolor oczu (do typowania skóry), a także miejsce pobrania materiału. Liczba próbek śliny, objętości pobranej krwi oraz liczba pobranych żywych i utrwalonych próbek tkanek są również zapisywane jako referencje do późniejszego przydziału. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Aby zwalidować procedury pobierania próbek, każdy rodzaj próbki został przetestowany w dalszych zastosowaniach. Wykorzystując modyfikacje poprzednich technik12, guz oraz ANT zostały z powodzeniem wykorzystane do izolacji białek i RNA, a potencjalnie mogą być użyte do izolacji DNA. Żywiołowe eksplantaty przygotowane z przekrojów tkankowych zostały ocenione za pomocą mikroskopii, natomiast przechowywane preparaty histologiczne wykorzystano do immunohistochemii i immunofluorescencji.
Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, możliwe jest rozszerzenie tego modelu na inne kliniki dermatologiczne, inne typy nowotworów (takie jak czerniak) oraz inne specjalizacje i praktyki chirurgiczne w celu pozyskiwania próbek tkanek ludzkich do wieloaspektowych badań nad nowotworami u ludzi. W przypadku innych praktyk prawdopodobnie konieczne będą niewielkie modyfikacje tego protokołu, lecz w zasadzie jest on możliwy do zastosowania w każdej praktyce chirurgicznej, w której rutynowo utylizuje się próbki pobrane od pacjentów w toku leczenia.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z K3EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa Sciences Ostrza o podwójnej krawędzi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione średniopunktowe kleszcze ogólnego przeznaczenia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>Premium Probówki</td> <td>do mikrowirówekThermoFisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville KGM Keratynocyte Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9791321</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa Tissue TEK OCT Compound</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-363-579</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1950 Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743909</td><td></td></tr><tr><td>Matowe szkiełka mikroskopowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome H& E Zestaw do barwienia sekcji mrożonych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>99-900-01</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne do długotrwałego przechowywania</td><td>Nalgene ThermoFisher Scientific</td><td>03-337-7X</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Boca Scientific BuccalT-Swab&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9679349</td><td></td></tr><tr><td>Cell Signaling Technology 10x bufor RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-195-822</td><td></td></tr> Koktajl inhibitorów <tr><td>proteazy i fosfatazy Halt</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf 5424R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-401-203</td><td></td></tr><tr><td>Akumulatorowy homogenizator</td> <td>do granulek MorterThermoFisher Scientific</td><td>12-141-3</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do peletów bez RNAzy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>121-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Forma Inkubator SteriCycle CO2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-998-089</td><td></td></tr><tr><td>Hyklonowa płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SH30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-634-028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 1 M Hepes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-630-130</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórek Nunc 35 mm z odpowietrznikiem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1256591</td><td></td></tr><tr><td>Klon przeciwciała monoklonalnego anty-CFH OX-24</td><td>Abnova</td><td>MAB12583</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p40 (p63 delta) przeciwciało</td><td>Abnova</td><td>ABX-144A Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty MUC-1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-7313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail + Slug (phospho S246)</td><td>Abcam</td><td>Ab63568</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Sondy</td><td>molekularne Phallodin&nbsp;</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant z</td><td>sondami molekularnymi DAPI&nbsp;</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axio Imager Z1 z kamerą Axiocam</td><td>Zeiss</td><td>4300009901</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 kontrast fazowy z kamerą DP72</td><td>Olympus</td><td>IX511F3</td><td></td></tr></tbody></table>

utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Establishment of a Clinic-based Biorepository

Częstość występowania raka skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) wzrasta w ciągu ostatnich kilku lat. Oczekuje się, że równolegle będzie istniało zapotrzebowanie na próbki nowotworów skóry do badań biomedycznych. Dostępność tkanek jest jednak ograniczona ze względu na koszty utworzenia biorepozytorium oraz brak dostępnych protokołów pobierania próbek klinicznych, które nie kolidują z operacjami klinicznymi. Ustanowiono protokół pobierania i przetwarzania próbek krwi i śliny guza skóry oraz związanych z nim próbek krwi i śliny, który ma minimalny wpływ na rutynowe procedury kliniczne w dniu operacji Mohsa. Próbki guza są pobierane i przetwarzane od pacjentów poddawanych pierwszej warstwie operacji Mohsa z powodu potwierdzonych biopsją nowotworów złośliwych skóry przez histotechnologa Mohsa. Sąsiednia normalna tkanka jest pobierana w momencie chirurgicznego zamknięcia. Dodatkowe próbki, które można pobrać, to wymazy z krwi pełnej i policzkowe. Wykorzystując próbki tkanek, które zwykle są wyrzucane, stworzono biorepozytorium, które oferuje kilka kluczowych zalet dzięki temu, że znajduje się w klinice w porównaniu z warunkami laboratoryjnymi. Obejmują one szeroki zakres pobieranych próbek; dostęp do zanonimizowanych kart pacjentów, w tym raportów patologicznych; oraz, w przypadku typowego dawcy, dostęp do dodatkowych próbek podczas wizyt kontrolnych.

Tumor oraz ANT zostały z sukcesem wykorzystane w izolacji białek i przetestowane metodą Western blotting. Jak pokazano na Rysunku 3, markery raka płaskonabłonkowego skóry (Muc114, FHL-115 oraz p4016,17) mogą być wykrywane w próbkach pacjentów pobranych i przechowywanych w naszym klinicznym biorepozytorium.
...

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest umożliwienie personelowi wsparcia klinicznego w praktyce dermatologicznej skutecznego przetwarzania i przechowywania próbek guzów skóry do późniejszych zastosowań laboratoryjnych, bez zakłócania rutynowych działań klinicznych. Protokół ten został opracowany, aby umożliwić asystentom medycznym i histotechnikom wykonującym operację Mohsa pobieranie i przechowywanie próbek guzów skóry do przyszłych projektów badawczych w zakresie biomedycyny, jako element ich codziennych obowiązków klinicznych. Główną zaletą tego protokołu jest to, że wycięte tkanki, które zazwyczaj są odrzucane i utylizowane, zostają zamiast tego zebrane i zachowane do badań przy użyciu procedur, które w minimalnym stopniu wpływają na rutynowy przebieg pracy klinicznej.Różnorodność pobranych próbek umożliwia korelację biomarkerów białkowych i RNA w próbkach tkanek oraz osocza z danymi dotyczącymi wyników leczenia pacjentów. W zasadzie protokół ten, po niewielkich modyfikacjach, można zastosować w każdej praktyce chirurgicznej, w której rutynowo utylizuje się próbki pobrane od pacjentów w toku leczenia. Procedurę zaprezentują Stefani Fawks, technik histolog w metodzie Mohsa, oraz dr Mitchell Manway, pracownik naukowy w naszej praktyce.Na początek, korzystając z tkanki otrzymanej od chirurga stosującego metodę Mohsa, wyciąć skalpelem próbkę o masie od 10 do 50 mg z centralnej części strony wierzchołkowej tkanki. Za pomocą pęsety przenieść żywą tkankę do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml, uprzednio wypełnionej pożywką hodowlaną. Należy upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w pożywce.Umieść próbkę w lodówce i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza nie dłużej niż przez 24 godziny przed dalszą obróbką. Pobierz fragment tkanki o objętości co najmniej 10 mm³ z górnej części wyciętej tkanki, jeżeli próbka guza jest wystarczająco duża i takie usunięcie nie będzie zakłócać rutynowego przetwarzania metodą Mohsa. Następnie umieść pozostałą, nieprzetworzoną próbkę guza na uchwycie do tkanek w kriostacie.Zatopić tkankę w specjalnym medium do kriostatu (OCT) i zamrozić ją w uchwycie w celu przygotowania preparatów histologicznych. Za pomocą kriostatu wykonać przekroje tkanki o grubości 7 µm i ułożyć do trzech warstw przekrojów na szkiełku. Po cięciu utrwalić tkankę, zanurzając szkiełka w acetonie na okres od jednej do dwóch sekund.Następnie pozostaw preparaty do wyschnięcia na powietrzu. Pozostawiając resztę próbki w komorze kriostatu, oddziel tkankę od medium do wlewania kriogenicznego i przenieś ją do opisanej probówki kriogenicznej. Natychmiast przenieś opisaną probówkę do ciekłego azotu.Przeniesienie tkanki do probówki kriogenicznej po obróbce metodą Mohsa musi zostać wykonane w komorze kriostatu o temperaturze -20 °C. Jeśli zostanie to przeprowadzone prawidłowo i tkanka pozostanie zamrożona, krok ten umożliwi skutewną ekstrakcję RNA z próbek tkanek po zabiegu Mohsa. Następnie należy pobrać przyległą normalną tkankę od chirurga wykonującego zabieg Mohsa.Wytnij próbkę z górnej strony sąsiedzącej prawidłowej tkanki. Następnie, używając pęsety, przenieś wyciętą próbkę do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra wypełnionej pożywką hodowlaną. Zanurz tkankę w tej samej pożywce hodowlanej.Umieść próbkę w odpowiedniej torebce na próbki i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu dalszego przetwarzania. Pobierz około 10 ml krwi żylnej do probówek z EDTA. Połącz próbki krwi w sterylnej probówce do wirowania o pojemności 15 ml.Następnie przenieś około 1 ml próbki krwi do 1,5 ml probówki kriogenicznej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Próbkę krwi pełnej przechowuj w temperaturze -80 °C aż do czasu przeprowadzenia genotypowania i dopasowania tkanek. Następnie odwiruj pozostałą próbkę krwi przy 1000 ×g przez 30 minut w celu uzyskania osocza krwi.Po wirowaniu zebrać i podzielić osocze na aliquoty po 1 ml w 1,5 ml probówkach kriogenicznych. Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłych analizach płynnej biopsji. Wprowadzić dane z listy kontrolnej próbek pacjentów, wraz z informacjami o pacjencie i diagnozą pobranymi z karty pacjenta, do bazy danych biobanku.Na koniec należy odnotować lokalizację zanonimizowanych próbek w bazie danych biorepozytorium i przenieść próbki do laboratorium badawczego. Następnie bezzwłocznie przenieść próbki tkanek do probówek 1,5 ml, wypełnionych odpowiednimi roztworami do ekstrakcji, upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.Przedstawiono tutaj obrazy reprezentatywnych analiz Western blot dla znanych markerów raka kolczystokomórkowego: mucyny 1, FHL-1 oraz p40, uzyskane dla przyległej tkanki prawidłowej oraz próbki guza. Jakość RNA wyizolowanego z próbek Mohsa została najpierw oceniona za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie przeprowadzono analizę integralności RNA. Uzyskane wartości wskaźnika integralności RNA (RIN) dla próbek prawidłowych i nowotworowych wskazują na uzyskanie wysokiej jakości, nienaruszonego RNA.Profile cytometry pasm przedstawiono jako jednostki fluorescencji w funkcji liczby nukleotydów dla reprezentatywnych próbek RNA z tkanek nowotworowych i prawidłowych pacjentów. Eksplant tkanki z raka плоскоściennego obrazowano za pomocą mikroskopii fazokontrastowej, wykazując, że jest to mieszana hodowla keratynocytów i fibroblastów, która może zostać poddana pasażowaniu lub wykorzystana do przyszłej hodowli linii komórkowych. Na koniec, w przekrojach tkanki z raka плоскоściennego wykazano pozytywne barwienie dla markera przejścia epitelialno-mezenchymalnego.Po opanowaniu tej procedury, standardowy przepływ pracy personelu klinicznego zostanie skrócony do mniej niż 30 minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Większość kroków jest realizowana przez obecny personel kliniczny po zakończeniu opieki nad pacjentem. Podczas stosowania tego protokołu ważne jest prowadzenie dokładnej dokumentacji, łączącej próbki z historią choroby i diagnozą pacjenta.Ponieważ informacje te są często niezbędne do dalszych zastosowań, technika ta pomoże badaczom z dziedziny dermatologii w opracowaniu płynnych biopsji oraz biomarkerów w raku kolczystokomórkowym i czerniaku. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia klinicznego biobanku próbek nowotworów skóry, pozyskiwanych w ramach codziennej praktyki medycznej.

establishment-of-a-clinic-based-biorepository

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Ta metoda polega na wykorzystaniu klinicznych danych diagnostycznych dla pacjentów z rakiem prostaty w celu kierowania procedurami pobierania próbek podczas biobankowania tkanek po radykalnej prostatektomii. Pozwala to przezwyciężyć problemy z wcześniej opublikowanymi metodami dotyczącymi wydajności i dostępności świeżej tkanki dla szerszego zakresu dalszych zastosowań.

Wykorzystanie danych z obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i biopsji do kierowania procedurami pobierania próbek do biobankowania raka prostaty

W poniższej pracy opisujemy kolejne kroki niezbędne do stworzenia dużego biobanku raka jelita grubego i trzustki.

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę biorepozytorium do standaryzowanego zbierania, opisywania i biobankowania wysokiej jakości ludzkich biopsji cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.

Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pobierania próbek raka piersi, zaprojektowany tak, aby zoptymalizować ich zastosowanie w biobankowaniu, medycynie spersonalizowanej i innych zastosowaniach badawczych. Szczegółowo opisano proces pobierania próbek, w tym biopsję piersi i mastektomii, koncentrując się na minimalizacji uszkodzeń tkanek i maksymalizacji jakości próbki.

Optymalizacja procedur biopsji piersi i pobierania próbek po mastektomii dla biobankowania, medycyny spersonalizowanej i zastosowań badawczych

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Poznaj protokół przetwarzania i przechowywania próbek nowotworów skórnych w praktyce dermatologicznej. Metoda umożliwia zbieranie tkanek zabieganych podczas chirurgii Mohsa do badań biomarkerów bez zakłócania codziennej pracy klinicznej.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Przeglądaj więcej filmów