Name: Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj czterokolorową immunohistochemię fluorescencyjną do analizy subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach raka płaskonabłonkowego gardła. Ta metoda umożliwia wizualizację wielu biomarkerów w jednym przekroju tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, wspierając stratyfikację pacjentów do terapii immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Simone Punt otrzymała wsparcie od Holenderskiego Towarzystwa Onkologicznego UL2010-4801. Chcielibyśmy podziękować wszystkim współautorom oryginalnego artykułu, na którym opiera się ten protokół JoVE: Emilie A. Dronkers, Marij J. P. Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter J. F. Snijders, Arko Gorter i Sjoerd van der Burg.

Próbki pacjentów były traktowane zgodnie z wytycznymi etyki medycznej opisanymi w Kodeksie Postępowania dla Właściwego Wtórnego Wykorzystania Tkanek Ludzkich Holenderskiej Federacji Naukowych Towarzystw Biomedycznych (www.federa.org).
1. Przygotuj slajdy
<ol>
	<li>Uzyskać wycięty materiał tkankowy (dowolny rodzaj tkanki) z oddziału patologii po uzyskaniu zgody komisji etyki medycznej na użycie wyciętego materiału. 
	UWAGA: W obecnym eksperymencie próbki guza przed leczeniem uzyskano z pierwotnych guzów jamy ustnej i gardła zdiagnozowanych w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Lejdzie w Holandii w latach 1970-2011, wybranych zgodnie z wcześniejszym opisem (n = 162)13. Rozmiar tkanki był ograniczony jedynie przez wymóg wystarczającej ilości tkanki nowotworowej, aby wiarygodnie wykonać 4 obrazy mikroskopowe wewnątrz guza.</li>
	<li>Utrwal tkankę w 4% buforowanej formalinie przez co najmniej 12 godzin. Odwodnić tkankę w stopniowanej serii etanolu. Umyj go w ksylenie i zanurz w wosku parafinowym za pomocą automatycznego procesora do tkanek.</li>
	<li>Wytnij skrawki tkanki o grubości 4 μm, utrwalone formaliną, zatopione w parafinie (FFPE) na szkiełkach za pomocą mikrotomu. Umieść blok tkankowy w mikrotonowym uchwycie na chusteczki przy użyciu standardowych procedur.
	<ol>
		<li>Przeciąć wstęgi tkanki i położyć je na powierzchni łaźni wodnej zawierającej wodę dejonizowaną o temperaturze 45 °C. Użyj szkiełka odpowiedniego do barwienia immunohistochemicznego, aby wyłowić przekrój, umieszczając szkiełko w wodzie bezpośrednio pod sekcją. Ostrożnie przesuń zjeżdżalnię pod kątem do góry, wyjmując sekcję z wody i przyklejając ją do zjeżdżalni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odparafinować szkiełka FFPE, zanurzając je całkowicie w świeżym 100% ksylenie, trzy razy na 5 minut każda. Ponownie nawodnij szkiełka, zanurzając je dwukrotnie w świeżym 100% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu na 5 minut każda.</li>
</ol>
2. Wykonaj pobieranie antygenu
<ol>
	<li>Myj szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 5 minut.</li>
	<li>Rozgrzej bufor kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) do temperatury wrzenia za pomocą kuchenki mikrofalowej. Pobrać antygen, zanurzając szkiełka w podgrzanym buforze EDTA i utrzymując bufor w tej temperaturze przez 10 minut w kuchence mikrofalowej. 
	UWAGA: Można używać dowolnej kuchenki mikrofalowej o mocy 900 W.</li>
	<li>Pozwól szkiełkom ostygnąć w buforze przez 2 godziny.</li>
</ol>
3. Szkiełka do plam
<ol>
	<li>Umyć szkiełka dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez 5 minut każde.</li>
	<li>Narysuj okrąg wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka, aby zapobiec rozlaniu się rozcieńczonych przeciwciał ze szkiełka. Umyj jeszcze raz za pomocą PBS; Jest to opcjonalne.</li>
	<li>Inkubować tkankę z pierwszorzędowymi przeciwciałami (anty-CD3 1:50, anty-FoxP3 1:200 i anty-IL-17 1:50) rozcieńczonymi w 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS w temperaturze pokojowej przez noc. 
	UWAGA: Objętość na szkiełko zależy od wielkości tkanki, ale zwykle wynosi 50 - 150 μL. Zastąp pierwszorzędowe przeciwciała przeciwciałami tej samej klasy izotypów o nieznanej swoistości dla szkiełek kontroli ujemnej w tym samym rozcieńczeniu, co przeciwciała CD3, CD8 i FoxP3 (tj. przeciwciało kontrolne królika Ig, mysie przeciwciało kontrolujące izotyp IgG1 i przeciwciało kontrolne koziej izotypu IgG).</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez 5 minut każde.</li>
	<li>Inkubować tkankę z kombinacją znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych skierowanych przeciwko pierwszorzędowym gatunkom przeciwciał i/lub izotypom (tj. 1:200 anty-koziej IgG Alexa 488, anty-króliczej IgG A546 osła i anty-mysiej osła A647) rozcieńczonych w 1% BSA w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. 
	UWAGA: Objętość na szkiełko zależy od wielkości tkanki, ale zwykle wynosi 50 - 150 μl.
	<ol>
		<li>Po dodaniu przeciwciała wtórnego należy w miarę możliwości chronić szkiełka przed światłem, przechowując je w ciemnym pudełku lub owijając pudełko folią aluminiową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż i przeciwbarwienie szkiełek tkankowych
<ol>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 5 minut każde.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka za pomocą wodnego podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego przeciwplamę jądrową (np. DAPI). Przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego tak szybko, jak to możliwe (w ciągu dwóch tygodni). Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
5. Analizuj preparaty z barwionymi tkankami
<ol>
	<li>Uzyskaj cztery obrazy każdego preparatu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20-25X. Rób zdjęcia w losowych miejscach w całym obszarze guza zawartym na szkiełku, aby uchwycić reprezentatywną frakcję guza. 
	UWAGA: Należy użyć standardowego powiększenia 250x. Można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego lub laserowego skaningowego, pod warunkiem, że posiada on filtry i lasery potrzebne do wizualizacji użytych fluorochromów.
	<ol>
		<li>Do wizualizacji Alexa 488 należy użyć maksimum wzbudzenia 490 i maksimum emisji 525; do wizualizacji Alexa 546 należy użyć maksimum wzbudzenia 556 i maksimum emisji 573; do wizualizacji Alexa 647 należy użyć maksimum wzbudzenia 650 i maksimum emisji 665; a do wizualizacji DAPI, Użyć maksimum wzbudzenia 358 i maksimum emisji 461.</li>
		<li>Zapisz obrazy jako pliki graficzne (tj. jpeg i tiff) w oprogramowaniu dostępnym dla użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozróżnij nabłonek guza i obszary zrębu guza na podstawie kształtów jądrowych i komórkowych nabłonka guza w porównaniu z komórkami zrębu po konsultacji z patologiem.
	<ol>
		<li>Aby określić całkowitą powierzchnię zrębu, narysuj linię wokół wszystkich obszarów zajmowanych przez komórki zrębu (a nie komórki nowotworowe) i zarejestruj pole powierzchni za pomocą oprogramowania do analizy obrazu dostarczonego przez producenta mikroskopu.
		<ol>
			<li>Kliknij zakładkę "Nakładka" pod obrazem; wybierz kształt "Zamknięta polilinia" i kliknij na niego. Wyznacz granicę między polami nabłonka guza i zrębu, klikając wokół obszaru, aż ponownie dotrzesz do pierwszego punktu.; To zapewnia miarę dla tego obszaru. 
			UWAGA: Po zamknięciu kształtu, obok kształtu otaczającego obszar wybranego obrazu pojawi się liczba (A = x μm2).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odejmij ten obszar powierzchni od całkowitego obszaru powierzchni obrazu (podanego we właściwościach obrazu), aby obliczyć pole powierzchni nabłonka. Wyklucz obszary naczyniowe, martwicze i autofluorescencyjne, rysując wokół nich linię, rejestrując rozmiar podanego obszaru i odejmując go od powierzchni nabłonka.</li>
		<li>Zapisz wszystkie numery powierzchni w pliku arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnie pola powierzchni i liczby komórek na slajdzie.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, określ, czy komórki są jedno-, podwójnie czy potrójnie dodatnie, sprawdzając fluorescencję wszystkich czterech kanałów.
		<ol>
			<li>Policz pojedyncze, podwójne i potrójnie dodatnie komórki na każdym obrazie za pomocą ImageJ.
			<ol>
				<li>Pobierz plik ImageJ. Otwórz obraz, klikając "Plik" i "Otwórz" i wybierając obraz do analizy. Kliknij prawym przyciskiem myszy "Narzędzie Punkt" (czerwony kwadrat pośrodku czterech linii) i wybierz "Narzędzie Wielopunktowe". Kliknij dwukrotnie "Narzędzie Multi-Point" i policz liczbę różnych typów komórek na obrazie, wybierając inny numer licznika dla każdego typu komórki. 
				UWAGA: Policz wszystkie komórki każdego typu komórki, identyfikowane przez obecność jednego, dwóch lub wszystkich trzech kolorów fluorescencyjnych. Wyklucz DAPI, ponieważ to jądrowe przeciwbarwienie jest obecne we wszystkich komórkach i służy do odróżniania komórek nowotworowych od komórek odpornościowych. Każdy typ komórki jest zliczany przy użyciu innego numeru licznika. Policz liczbę komórek każdego typu komórek osobno w obszarach nabłonka i zrębu guza, wybierając za każdym razem inny numer licznika. Nie licz komórek w naczyniach krwionośnych i obszarach w dużej mierze autofluorescencyjnych.</li>
				<li>Zapisz liczbę analizowanych komórek w każdym pojemniku licznika dla każdego obrazu w pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
				<li>Podziel całkowitą liczbę komórek dla każdego typu komórek na całkowitą powierzchnię analizowanego nabłonka guza i zrębu guza.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
UWAGA: Wszystkie analizy statystyczne powinny być omawiane ze statystykiem, aby zapewnić jakość danych. Aby uzyskać ogólne statystyki, skorzystaj z dowolnego przewodnika po statystykach medycznych14.
<ol>
	<li>Przetestuj korelacje między częstościami komórek za pomocą testu rho korelacji rang Spearmana.</li>
	<li>Przetestuj statystyczne różnice w liczbie dodatnich komórek między grupami pacjentów za pomocą testu Wilcoxona Manna-Whitneya.</li>
	<li>Przetestuj korelacje między liczbą komórek a przeżyciem wolnym od choroby (tj. czas od diagnozy do miejscowego lub odległego nawrotu śmierci lub choroby), dzieląc pacjentów na grupy na podstawie odcięcia liczby komórek za pomocą generowania krzywej Kaplana-Meiera i analizy logarytmicznej15.</li>
	<li>Wykonywanie analiz wielowymiarowych przy użyciu analizy proporcjonalnej regresji hazardu Coxa.</li>
</ol>

<ol><li>Westra, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+head+and+neck+cancer+in+the+21st+century%3A+the+impact+of+HPV+on+the+epidemiology+and+pathology+of+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Pathol%22%5BJournal%5D)">The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer.</a> Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).</li>
<li>Rietbergen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+detection+and+comorbidity%3A+critical+issues+in+selection+of+patients+with+oropharyngeal+cancer+for+treatment+De-escalation+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials.</a> Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).</li>
<li>Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+immune+parameters+in+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers.</a> Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).</li>
<li>Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+regulation+of+human+Th17+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity.</a> Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+of+pancreatic+cancer-infiltrating+T+lymphocytes+reveals+that+ENO-specific+Tregs+accumulate+in+tumor+tissue+and+inhibit+Th1%2FTh17+effector+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+regulatory+T+cells+%28Treg%29+regulating+in+cancer+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?</a> Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angels+and+demons%3A+Th17+cells+represent+a+beneficial+response%2C+while+neutrophil+IL-17+is+associated+with+poor+prognosis+in+squamous+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer.</a> Oncoimmunology. 4 (1), e984539(2015).</li>
<li>Bamias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+differences+of+lymphocytes+isolated+from+ascites+of+patients+with+ovarian+cancer+compared+to+blood+and+tumor+lymphocytes.+Association+of+CD3%2BCD56%2B+cells+with+platinum+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance.</a> Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).</li>
<li>Gasparoto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma+are+characterized+by+increased+frequency+of+suppressive+regulatory+T+cells+in+the+blood+and+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).</li>
<li>Jordanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I%2C+MHC+class+I+chain-related+molecule+A%2C+and+CD8%2B%2Fregulatory+T-cell+ratio%3A+which+variable+determines+survival+of+cervical+cancer+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?</a> Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).</li>
<li>van Esch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+classical+and+nonclassical+HLA+expression+in+recurrent+and+progressive+HPV-induced+usual+vulvar+intraepithelial+neoplasia+and+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).</li>
<li>Heeren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+effect+of+different+PD-L1+expression+patterns+in+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+of+the+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix.</a> Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17%28%2B%29+cell+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li>
<li>Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirkwood%2C+BR+%22Essential+Medical+Statistics%22">Essential Medical Statistics</a>. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).</li>
<li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Survival+Analysis%3A+A+Self-Learning+Text%22">Survival Analysis: A Self-Learning Text</a>. , 2nd ed, Springer. (2005).</li>
<li>Fabre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Tumor+Microenvironment%3A+The+Protumor+Effects+of+IL-17+Related+to+Cancer+Type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak handlowego lub finansowego konfliktu interesów.

W przypadku opisanego protokołu jednym z najbardziej krytycznych kroków jest określenie prawidłowego rozcieńczenia zastosowanych przeciwciał pierwotnych. Rozcieńczenie znakowanych przeciwciał drugorzędowych wynosiło 1:200, zgodnie z zaleceniami producenta tych specyficznych przeciwciał znakowanych Alexą. Rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych należy następnie oznaczyć przez seryjne rozcieńczenie, najlepiej przy użyciu dwóch różnych próbek zamierzonego typu tkanki (w tym przypadku OPSCC). Optymalnym rozcieńczeniem ro...

Raki płaskonabłonkowe jamy ustnej i gardła (OPSCC) to niejednorodna grupa nowotworów płaskonabłonkowych wywodzących się z jamy ustnej gardła. Czynniki ryzyka OPSCC obejmują zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) oraz spożywanie alkoholu i palenie tytoniu1,2. Rola odpowiedzi immunologicznej i sposoby jej wykorzystania w warunkach klinicznych dopiero zaczynają być badane. Mikrośrodowisko guza jest infiltrowane przez komórki odpornościowe, które są przyciągane do miejsca nowotworu. Chociaż wysoka częstość cytotoksycznych limfocytów T CD8 + została skorelowana z poprawą przeżycia u pacjentów z OPSCC3, rola innych podzbiorów limfocytów T, w tym limfocytów Treg i Th17, jest nadal niejasna4. Podczas gdy komórki Th1 i Th17 mają pomagać w odpowiedzi immunologicznej ukierunkowanej na komórki nowotworowe, limfocyty Treg są dobrze znane ze swoich zdolności do tłumienia aktywności innych limfocytów T5. Stwierdzono jednak, że obecność limfocytów Treg koreluje zarówno z korzystnymi, jak i niekorzystnymi reakcjami w różnych typach nowotworów6. Ponieważ nie wszystkie komórki odpornościowe obecne we krwi infiltrują guz w takim samym stopniu, badanie lokalnego mikrośrodowiska guza zapewnia najbardziej wiarygodną miarę odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko nowotworowi. Celem pracy jest określenie korelacji między liczbą i typami komórek odpornościowych a wynikiem klinicznym. Użyliśmy czterokolorowego obrazowania fluorescencji IHC do analizy liczby i lokalizacji różnych subpopulacji komórek T w ludzkim OPSCC.
Skupiliśmy się na całkowitej liczbie limfocytów T (CD3+), komórek Th17 i immunosupresyjnych limfocytów FoxP3+, których szlak różnicowania jest ściśle związany z komórkami Th17. Komórki Th17 charakteryzują się połączeniem CD3 i IL-17. Cytokina IL-17 może być również wytwarzana przez komórki inne niż T7. Określiliśmy rozmieszczenie wewnątrznabłonkowych i zrębowych limfocytów T, Treg, Th17 i komórek innych niż T IL-17 + w dużej serii przypadków OPSCC i przeanalizowaliśmy korelacje z przeżyciem pacjentów. Wielokolorowa fluorescencja IHC została użyta do identyfikacji ekspresji CD3, Foxp3 i IL-17 w połączeniu z przeciwbarwieniem DAPI. Test ten pozwolił na łatwą i wyraźną identyfikację zarówno komórek nowotworowych (za pomocą barwienia jądrowego DAPI), jak i infiltrujących populacji limfocytów T (przy użyciu kombinacji różnych markerów). Po przygotowaniu próbki i barwieniu użyto mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do obrazowania, aby oddzielić różne użyte kolory fluorescencyjne oraz określić liczbę i rodzaj komórek obecnych zarówno w nabłonku guza, jak i zrębie związanym z nowotworem.
Alternatywnym testem do ilościowego i fenotypowego oznaczania populacji komórek odpornościowych jest analiza metodą cytometrii przepływowej lub cytometrii według czasu lotu (CyTOF) próbek guza lub próbek obwodowych (np. krwi lub wodobrzusza). Korzystając z tej techniki, wszystkie informacje o lokalizacji i względnym rozmieszczeniu różnych typów komórek są tracone. Wykorzystanie i analiza próbek obwodowych również nie dostarcza informacji o tym, które komórki są w stanie przeniknąć do mikrośrodowiska guza. Wykazano, że analizy krwi i komórek odpornościowych worka nie odzwierciedlają fenotypu i częstości naciekania komórek odpornościowych tkanki nowotworowej8,9.
Inną alternatywą jest użycie mikroskopii jasnego pola. Przewagą tej techniki nad obrazowaniem fluorescencyjnym jest brak autofluorescencji tkankowej. Chociaż niektóre próbki zawierają więcej autofluorescencji - szczególnie erytrocyty, ale także inne typy komórek, w tym granulocyty neutrofilowe - obszary te można łatwo usunąć w analizie prawie wszystkich próbek. Immunofluorescencja ma tę zaletę, że umożliwia analizę wielu markerów w jednej próbce przy użyciu panelu docelowych długości fal fluorescencyjnych. Jest to obecnie niemożliwe w takim samym stopniu w przypadku mikroskopii jasnego pola ze względu na brak wystarczającej liczby znaczników i dostępnych na rynku izotypów przeciwciał dla danego antygenu.
Opisana tutaj technika wielokolorowej fluorescencji IHC została wykorzystana w wielu różnych typach nowotworów i kombinacjach przeciwciał do badania różnych populacji komórek odpornościowych, a także cząsteczek wyrażanych w komórkach nowotworowych, takich jak ludzkie antygeny leukocytów (HLA) i PD-L110,11,12. Protokół został opracowany i zweryfikowany przy użyciu wielu różnych typów próbek i przeciwciał.

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td><td>Milestone i Histostar</td><td></td><td>Automatyczny procesor tkanek</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Maszyna do zatapiania bloków tkankowych</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td> Ethanol Merck <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ water</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na chusteczki do mikrotomów</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC side</td><td>Dako</td><td></td><td>Szkiełko do tkanek</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1,083,821,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Miareczkowanie wymagane rozcieńczenie przeciwciał</td></tr><tr><td>Mysz IgG1 anty-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Wymagane miareczkowanie Rozcieńczenie przeciwciała</td></tr><tr><td>Kozia IgG anty-IL-17</td><td>R& D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>Miareczkowanie wymagane rozcieńczenie przeciwciała</td></tr><tr><td>Przeciwciało kontrolne izotypu Ig królika</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Stosować w tym samym stężeniu końcowym co przeciwciało kontrolne izotypu anty-CD3</td></tr><tr><td>Mysia IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Stosować w tym samym stężeniu końcowym co</td></tr><tr><td>przeciwciało kontrolujące izotyp kozi IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>Stosować w tym samym stężeniu końcowym co anty-IL-17</td></tr><tr><td>Oślica IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Rozcieńczony 1:200 w 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Oślica przeciw myszy-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Rozcieńczony 1:200 w 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Ośli anty-kozi IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Rozcieńczony 1:200 w 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>VectaShield zawierający DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy LSM700&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Software</td><td>Zeiss</td><td>wersja 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>wersja 4.2.0.121</td><td>Dostępne do pobrania pod adresem www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>wersja 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>wersja 1.50i</td><td>Dostępna do pobrania pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij.</td></tr></tbody></table>

czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek t w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Technika immunohistochemii fluorescencji czterokolorowej (IHC) to metoda ilościowego określania interesujących populacji komórek, biorąc pod uwagę ich względne rozmieszczenie i lokalizację w tkance. Technika ta jest szeroko stosowana do badania nacieku immunologicznego w różnych typach nowotworów. Mikrośrodowisko guza jest infiltrowane przez komórki odpornościowe, które są przyciągane do miejsca guza. Stwierdzono, że różne populacje komórek odpornościowych odgrywają różne role w mikrośrodowisku guza i mają różny wpływ na wynik choroby. W artykule opisano zastosowanie wieloparametrowej fluorescencji IHC w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej i gardła (OPSCC) jako przykład. Technikę tę można rozszerzyć na inne próbki tkanek i typy komórek będące przedmiotem zainteresowania. W prezentowanym badaniu przeanalizowano przedział śródnabłonkowy i podścieliskowy dużej kohorty OPSCC (n = 162). Skupiliśmy się na całkowitych limfocytach T (CD3 +), immunosupresyjnych limfocytach T regulatorowych (Treg; tj. FoxP3 +) i komórki pomocnicze T 17 (Th17) (tj. IL-17 + CD3 +) za pomocą przeciwbarwienia jądrowego w celu odróżnienia nabłonka guza od zrębu. Stwierdzono, że duża liczba limfocytów T jest skorelowana z poprawą przeżycia wolnego od choroby u pacjentów z niską liczbą wewnątrznowotworowych komórek innych niż T IL-17 +. Sugeruje to, że limfocyty inne niż T IL-17 + mogą być skorelowane ze słabą odpowiedzią immunologiczną w OPSCC, co jest zgodne z opisaną korelacją między IL-17 a słabym przeżyciem u pacjentów z rakiem. Obecnie opracowywane są nowatorskie techniki fluorescencji wieloparametrowej IHC wykorzystujące do 7 różnych fluorochromów, które umożliwią bardziej precyzyjną charakterystykę i lokalizację komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza.

Serię próbek guzów utrwalonych w FFPE, pobranych z pierwotnych nowotworów jam gardłowych zdiagnozowanych w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Lejdnie (Leiden, Holandia) między 1970 a 2011 rokiem i wybranych zgodnie z wcześniejszym opisem (n = 162), barwiono według opisanego protokołu13. Analizie poddano od jednego do czterech losowych obrazów z każdego preparatu (Rysunek 1). Wskazano niektóre komórki autofluorescencyjne, które można wyra...

Wieloparametrowa immunohistochemia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny liczby, względnego rozmieszczenia i lokalizacji populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie tej techniki do analizy subpopulacji komórek T w raku jamy ustnej i gardła.

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przeprowadzenie wielokolorowej immunohistochemicznej wizualizacji i zliczenia różnych subpopulacji limfocytów T w archiwalnych skrawkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych formaliną z próbek raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunoonkologii, takie jak, czy istnieje związek między subpopulacjami komórek odpornościowych naciekającymi tkankę nowotworową a rokowaniem pacjenta. Dzięki tej technice można zwizualizować kilka biomarkerów w jednym przekroju tkanki.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię nowotworów, ponieważ jednoczesna ocena wielu komórek odpornościowych lub czynników związanych z odpornością może pomóc w stratyfikacji pacjentów pod kątem określonych terapii immunologicznych. Zacznij od użycia mikrojęzyka, aby uzyskać skrawki tkanek o grubości czterech mikrometrów, utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie, układając wstęgi tkankowe na powierzchni dejonizowanej kąpieli wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza w miarę ich pozyskiwania. Aby uchwycić skrawki, umieść szklane szkiełko w wodzie, bezpośrednio pod próbką tkanki i ostrożnie przesuń szkiełko w górę pod kątem.Ta sekcja przyklei się do szklanej powierzchni, gdy zjeżdżalnia zostanie wyjęta z wody. Po wysuszeniu próbek przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odparafinowaj tkanki za pomocą trzech pięciominutowych zanurzeń w 100% ksylolu. Po zakończeniu skrawków odparafinowania, należy ponownie nawodnić próbki tkanek za pomocą trzech zanurzeń etanolu w dół.Następnie należy umyć się przez pięć minut w wodzie dejonizowanej. Następnie zanurz próbki we wrzącym buforze EDTA na 10 minut w kuchence mikrofalowej i pozwól szkiełkom ostygnąć w buforze przez dwie godziny. W celu znakowania antygenów będących przedmiotem zainteresowania, przepłukać próbki dwoma pięciominutowymi płukankami PBS.Po drugim przemyciu inkubować tkanki z pierwszorzędowymi przeciwciałami i odsetkami rozcieńczonymi w 1% albuminie surowicy bydlęcej w PBS w temperaturze pokojowej, przez noc. Następnego ranka przepłukać skrawki trzema pięciominutowymi płukaniami PBS i inkubować próbki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 1% surowicy w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w PBS, jak właśnie pokazano, i zamontować szkiełka za pomocą wodnego podłoża do mocowania zapobiegającego blaknięciu zawierającego jądrowy barwnik przeciwplamiający.Aby przeanalizować próbki, najpierw wybierz obiektyw 20 do 25 razy w mikroskopie fluorescencyjnym i uchwyć cztery obrazy na szkiełko za pomocą odpowiednich filtrów dla przeciwciał wtórnych i barwienia przeciwbarwnego. Zapisz obrazy w takiej postaci, w jakiej zostały uzyskane. Następnie, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, otwórz pierwszy interesujący Cię obraz i kliknij zakładkę nakładki.Wybierz kształt zamkniętej linii poli, aby usunąć ramkę zaznaczenia obszaru zainteresowania. Gdy kształt zostanie zamknięty, obok obszaru zainteresowania pojawi się obszar pomiaru. Zapisz wszystkie dane dotyczące powierzchni w pliku arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnie pola powierzchni i liczby dźwięków na slajd.Wyeksportuj obraz jako plik TIFF lub JPG, aby otworzyć go w ImageJ. Następnie w ImageJ otwórz pierwszy interesujący Cię obraz i wybierz licznik komórek w menu wtyczek. Następnie kliknij przycisk inicjalizuj, kliknij typ pierwszy i kliknij każdą komórkę oznaczoną jako typ pierwszy.Wybierz inny typ dla każdego typu komórki, aby policzyć liczbę różnych typów komórek na obrazie zgodnie z wyrażeniem fluorochromu. Na koniec zapisz liczbę analizowanych komórek w każdym pojemniku licznika dla każdego obrazu w pliku arkusza kalkulacyjnego. W tym reprezentatywnym eksperymencie przeanalizowano jeden z czterech losowych obrazów z serii utrwalonych w formalinie próbek guzów przed leczeniem zatopionych w parafinie, uzyskanych z pierwotnych guzów jamy ustnej i gardła, zdiagnozowanych w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Lejdzie w latach 1970-2011, które zostały przygotowane tak, jak właśnie wykazano.W tej próbce eksperymentalnej zaobserwowano niektóre komórki autofluorescencyjne, które wyróżniały się całkowicie żółtym wyglądem, podczas gdy szkiełka kontroli ujemnej nie wykazywały żadnego specyficznego barwienia powyżej autofluorescencji tkanek tła. Stwierdzono, że wszystkie próbki guza są naciekane przez różną liczbę limfocytów T lisa p3-dodatniego, CD3-dodatniego z tylko małym podzbiorem limfocytów T wykazujących ekspresję IL-17. Próbki od pacjentów z dużą liczbą całkowitych naciekających limfocytów T CD3 wykazują tendencję do korelacji z lepszym przeżyciem wolnym od choroby w porównaniu z próbkami pacjentów z niską liczbą limfocytów T.Co więcej, w próbkach z niską liczbą komórek dodatnich IL-17, wysoka liczba całkowitych naciekających komórek T jest również skorelowana z poprawą przeżycia wolnego od choroby, co sugeruje, że skuteczne limfocyty T naciekające guz w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej i gardła mogą być związane z niską liczbą obecnych komórek dodatnich IL-17. Po opanowaniu, te etapy przygotowania próbki można wykonać w ciągu półtora dnia, co daje maksymalnie 25 szkiełek na sesję barwienia. Bardzo ważne jest, aby odparafinizować próbkę, w przeciwnym razie uzyskasz dużo tła.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie patologii i immunologii. Do badania mikrośrodowiska w celu lokalizacji różnych subpopulacji komórek odpornościowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować różne białka i typy komórek w jednej sekcji tkanki archiwalnej.Nie zapominaj, że praca z silosem jest bardzo niebezpieczna, zawsze powinieneś pracować w komorze przepływowej.

four-color-fluorescence-immunohistochemistry-t-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w przekrojach histologicznych materiału nowotworowego z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu oraz statystycznego miernika heterogeniczności. Metoda ta jest przeznaczona do zastosowania w opracowywaniu i analizie klinicznych biomarkerów.

Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Chromogeniczna hybrydyzacja in situ RNA wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) jest uważana za jeden ze złotych standardów wykrywania aktywnego zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego w obrębie nowotworów. Pozwala na wizualizację ekspresji mRNA HPV E6-E7 wraz z lokalizacją i półilościową oceną jego sygnału.

Chromogenna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnostyki raka głowy i szyi związanego z HPV

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Obecny protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA w celu lokalizacji lncRNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka.

Fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ dla długiej lokalizacji niekodującego RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj czterokolorową immunohistochemię fluorescencyjną do analizy subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach raka płaskonabłonkowego gardła. Ta metoda umożliwia wizualizację wielu biomarkerów w jednym przekroju tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, wspierając stratyfikację pacjentów do terapii immunologicznych.

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

Przeglądaj więcej filmów