Nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila

Tutaj opisujemy nowe podejście do zadawania urazów mózgu u Drosophila melanogaster. Nasza metoda ma tę zaletę, że bezpośrednio dostarcza powtarzalne uderzenia z regulowaną siłą do samej głowy. Dalsze badania układu bezkręgowców pomogą rzucić światło na patogenezę przewlekłej encefalopatii pourazowej.

Ogólnym celem tej nowatorskiej procedury jest spowodowanie zamkniętych urazowych uszkodzeń mózgu u muszki owocowej Drosophila, aby ustalić nowy model przewlekłej encefalopatii pourazowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłej encefalopatii pourazowej, takie jak to, w jaki sposób powtarzający się uraz indukuje zwyrodnienie neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona powtarzalne uderzenia o regulowanej sile bezpośrednio na głowicę muchy, nie powodując uszkodzeń innych części ciała zwierzęcia.

Demonstracja tej metody w świecie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie, ponieważ montaż urządzenia i etapy ładowania w locie są trudne do nauczenia, ponieważ głowa Drosophila jest tak mała i ważne jest, aby przyłożyć uderzenie tylko do głowy. Aby wykonać aparat używany do wstrząsania lub uderzania muszek owocowych, najpierw należy wykonać część impaktorową aparatu. Wyjąć tłok z jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej z poliwęglanu, a następnie przeciąć lufę w miejscu oznaczenia jednego mililitra.

W przypadku impaktora użyj bariery aerozolowej znajdującej się na końcówce pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Impaktor ten powinien mieć trzy milimetry długości i cztery milimetry średnicy. Następnie umieścić impaktor w cylindrze strzykawki płaską stroną w kierunku dyszy.

Aby zapewnić siłę, podłącz cylinder strzykawki do regulatora przepływu dwutlenku węgla. Reduktor musi być wyposażony w przełącznik On Off i dobrą kontrolę natężenia przepływu gazu. Następnie zaciśnij lufę pionowo do żelaznego stojaka, tak aby impaktor spadł na dno lufy.

Następnie zrób uchwyt na muchę. Zacznij od końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Odetnij końcówkę pipety pięć milimetrów od małego końca, aby uzyskać otwór o średnicy 8 milimetrów.

Głowa muchy zmieści się w tym otworze, ale klatka piersiowa nie. Na koniec zrób uchwyt na muchę i urządzenie udarowe. Najpierw odetnij jednomililitrową końcówkę pipety w odległości 44 milimetrów od małego otworu.

Po drugie, wyciąć sześć milimetrów długości z osłonki igły na strzykawkę o pojemności jednego mililitra. Następnie ściśnij je razem. Znieczulenie pojedynczej, dwudniowej dorosłej samicy muchy za pomocą dwutlenku węgla.

Z podkładki z dwutlenkiem węgla użyj cienkiej szczoteczki, aby delikatnie przenieść muchę do uchwytu. Następnie delikatnie postukaj w uchwyt, aż główka wystaje z końcówki. Odsłoniętej trąbki użyj, jednomililitrowej igły strzykawki, aby delikatnie wsunąć ją z powrotem do końcówki.

Bardzo ważne jest, aby korpus muchy, zwłaszcza część ustnika, znajdował się wewnątrz uchwytu. W przeciwnym razie mucha może umrzeć z powodu uszkodzenia narządów wewnętrznych lub niemożności spożycia pokarmu. Następnie ustaw ciśnienie gazu na 100 kilopaskali i dostosuj przepływ w razie potrzeby.

Po załadowaniu muchy dokręć uchwyt do cylindra strzykawki za pomocą łącznika, tak aby głowica muchy była skierowana w dół. Następnie, za pomocą przełącznika, wyślij impuls gazu, który porusza impaktorem, aby uderzył w muchę raz i tylko raz. Teraz odłącz uchwyt na muchę i wrzuć muchę z powrotem na podkładkę z dwutlenkiem węgla.

Muchę należy przelać do pustej fiolki, aż wyzdrowieje. Zachowaj jedną muchę na fiolkę. Rekonwalescencja trwa tylko kilka minut.

Powtórz proces, aby przetestować cztery muchy na grupę eksperymentalną. Przetwarzanie dwóch grup, testu i pozoru, powinno zająć tylko od 20 do 30 minut. należy traktować tak samo jak zwierzęta doświadczalne, z wyjątkiem tego, że w rurze impaktora nie należy umieszczać bariery aerozolowej.

Aby śledzić ruchy much na szalce Petriego, najpierw wypełnij sześciocentymetrową szalkę przezroczystym elastomerem krzemowym, aby utworzyć arenę śledzenia. Pozostaw trzymilimetrową szczelinę między silikonem a pokrywką, aby muchy mogły swobodnie chodzić w szczelinie, ale nie latać. Pod areną śledzenia mają białe tło.

Następnie znieczul cztery muchy z tej samej grupy zabiegowej i umieść je na arenie. Pozwól muchom zaaklimatyzować się przez godzinę na arenie, która powinna być w pełni oświetlona i mieć około 22 stopni Celsjusza. Nie cieplejszy niż temperatura pokojowa.

Po godzinie użyj kamery ze sprzężonym ładunkiem umieszczonej nad areną, aby rejestrować aktywność muchy przez pięć minut. Po pięciominutowym nagraniu znieczul muszki na arenie i umieść je z powrotem w nowej fiolce domowej. Następnie pozbądź się areny.

Później przeanalizuj nagrania za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Ctrax. To oprogramowanie generuje dane śledzenia, które można wyeksportować w programowalnym formacie zgodnym z językiem, takim jak format MATLAB. Na podstawie danych oblicz odległość przebytą na klatkę, średnią odległość przebytą pieszo dla każdej muchy oraz średnią odległość przebytą na muchę.

Aby uzyskać istotność statystyczną, spodziewaj się przetestowania około 100 much na grupę leczoną. Aby ustalić model przewlekłej encefalopatii pourazowej, przeanalizowano skuteczność pojedynczego, zamkniętego urazu głowy spowodowanego przez aparat uderzający przy różnych prędkościach na użyciu dwudniowych samic Canton-S. Ciśnienie gazu utrzymywało się na poziomie 100 kilopaskalów.

Muchy wystawione na pojedyncze uderzenie przy najwyższym badanym natężeniu przepływu, wykazywały minimalne wady zewnętrzne. Pomimo braku wyraźnych dowodów na uszkodzenia zewnętrzne, urazy przy natężeniu przepływu 15 litrów na minutę były bardzo śmiertelne, co skutkowało mniej niż 10% przeżyciem w ciągu 24 godzin. Przeżywalność wzrastała wraz z niższymi natężeniami przepływu.

Stuprocentowa przeżywalność została osiągnięta przy pięciu litrach na minutę lub mniej, więc jako standard dla modelu wybrano pięć litrów na minutę. Tuż po uderzeniu muchy stopniowo odzyskiwały swoją mobilność w ciągu czterech minut. Rekonwalescencja po pozorach była o około minutę szybsza.

Do pomiaru funkcji lokomotywy wykorzystano wspomagane wideo śledzenie ruchu po zderzeniu. W ciągu dwóch dni po uderzeniu lokomocja powoli wracała do normy. Te dowody na stopniową regenerację są zgodne z odzyskiwaniem CTE u ludzi.

Aby ocenić długoterminowe skutki, zastosowano protokół powtarzającego się urazowego uszkodzenia mózgu polegający na pięciu uderzeniach w ciągu pięciu dni. Dwadzieścia dni po leczeniu porównano sposób poruszania się ocalałych członków w każdej grupie, a grupa leczona wyraźnie chodziła mniej. Długość życia grupy leczonej również uległa znacznemu skróceniu, z medianą wynoszącą 26 dni w porównaniu z 37 dniami w grupie kontrolnej.

Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się łagodnym, powtarzającym się urazowym uszkodzeniem mózgu do zbadania mechanizmów patogennych w klasycznym modelu zwierzęcym Drosophila melanogaster. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o ochronie trąby, klatki piersiowej i brzucha przed bezpośrednim oddziaływaniem bariery aerozolowej.