Name: Nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj nową metodę modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila melanogaster. Technika umożliwia kontrolowane uderzenia w głowę muchy bez uszkadzania innych części ciała.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

1. Montaż urządzenia uderzeniowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Wyjąć tłok ze strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml. Przeciąć beczkę na znaku 1 ml.</li>
	<li>Usunąć barierę aerozolową (3 mm wysokości x 4 mm średnicy) z końcówki pipety o pojemności 200 μl i użyć jej jako udaru. Umieścić impaktor w cylindrze strzykawki. Delikatnie postukaj w cylinder, aby przesunąć impaktor do końca końcówki, płaską stroną zakrywając otwór dyszy.</li>
	<li>Przymocuj końcówkę lufy do plastikowej rurki, która jest podłączona do regulatora przepływu dwutlenku węgla (CO2) stacji anestezjologicznej Drosophila.</li>
	<li>Trzymaj lufę pionowo i clamp ją do standardowego stojaka clamp holder, tak aby impaktor pozostał na dnie lufy.</li>
	<li>Zmodyfikuj końcówkę pipety o pojemności 200 μl, aby uzyskać uchwyt na muchy.
	<ol>
		<li>Wytnij 4 mm od końcówki, aby zrobić otwór o średnicy 0,8 mm, pozwalając na odsłonięcie tylko główki muchy. 
		UWAGA: Klatka piersiowa i wszystkie inne części korpusu muchy pozostaną wewnątrz końcówki pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmodyfikuj końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl i nasadkę igły strzykawkowej o pojemności 1 ml, aby utworzyć łącznik.
	<ol>
		<li>Odciąć 44 mm od otworu końcówki. Weź nasadkę na igłę strzykawki o długości 6 mm i wciśnij ją mocno w pozostały segment końcówki pipety o pojemności 1 000 μl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Działanie urządzenia uderzeniowego
<ol>
	<li>Znieczulij pojedynczą 2-dniową dorosłą samicę muchy za pomocą CO2 na podkładce przeciwmuchowej.</li>
	<li>Delikatnie przenieś go do uchwytu na muchy za pomocą cienkiej szczoteczki. Delikatnie postukaj w uchwyt, tak aby głowica muchy była widoczna na zewnątrz końcówki. Jeśli trąbka muchowa jest odsłonięta na zewnątrz końcówki, delikatnie wsuń ją z powrotem do końcówki za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Upewnij się, że trąba muchowa jest trzymana w uchwycie. W przeciwnym razie mucha może umrzeć z powodu urazu trąbki ssącej.</li>
	<li>Dokręcić uchwyt muchowy do cylindra strzykawki za pomocą łącznika tak, aby głowica muchy była skierowana w dół.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie gazu na 100 kPa. Dostosuj natężenie przepływu zgodnie z projektem eksperymentu.</li>
	<li>Szybko włączaj i wyłączaj przełącznik regulatora przepływu, aby impaktor uderzył raz w głowicę muchy.</li>
	<li>Podnieś uchwyt na muchy i przesuń go nad podkładką na muchy. Odwróć uchwyt na muchę i delikatnie postukaj w bok, aby wypuścić muchę. Pozostawić muchę w pustej fiolce do wyzdrowienia.</li>
</ol>
3. Śledzenie ruchu wspomagane wideo
<ol>
	<li>Wypełnij szalkę Petriego o średnicy 6 cm przezroczystym elastomerem silikonowym, aby uzyskać arenę śledzenia. Pozostaw 3 mm odstępu między silikonem a pokrywką naczynia, aby muchy mogły swobodnie chodzić, ale nie latać.</li>
	<li>Za każdym razem znieczulaj cztery muchy z grupy pozorowanej lub leczonej i umieszczaj je na arenie. Pozostaw muchy w temperaturze 22 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Umieść kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) nad arenami i nagrywaj przez 5 minut.</li>
	<li>Analizuj zarejestrowane trajektorie ruchu za pomocą oprogramowania Ctrax (dostępnego bezpłatnie w Caltech)16. Eksportuj śledzone dane w formacie zgodnym z językiem programowania (np. Matlab) i analizuj dane na podstawie odległości przebytej na klatkę17. Obliczyć średnią odległość przebytą pieszo dla każdej muchy i połączyć ją ze wszystkimi innymi zarejestrowanymi muchami/grupą, aby uzyskać średnią skumulowaną odległość przebytą przez populację plików w tej samej grupie.</li>
</ol>

<ol><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).</li>
<li>Martland, H. S. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/260461">Punch drunk.</a> JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).</li>
<li>Millspaugh, J. A. <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-0005984841&origin=inward&txGid=863ABC19BCEDFF53A3AD7536B601EEA3.wsnAw8kcdt7IPYLO0V48gA%3a2">Dementia pugilistica.</a> US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).</li>
<li>Omalu, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+a+national+football+league+player%3A+part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II.</a> Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).</li>
<li>Goldstein, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+blast-exposed+military+veterans+and+a+blast+neurotrauma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model.</a> Sci Transl Med. 4 (134), (2012).</li>
<li>Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy%3A+where+are+we+and+where+are+we+going%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurol+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going?</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+disease+in+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy.</a> Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).</li>
<li>Petraglia, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+neurobehavioral+sequelae+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+novel+mouse+model+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy.</a> J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).</li>
<li>Littleton, J. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+synaptic+organization%3A+analysis+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome.</a> Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).</li>
<li>Appel, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Stubble-stubbloid+gene+encodes+an+apparent+transmembrane+serine+protease+required+for+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+hemolymph+sampling+and+analysis+of+individual+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster.</a> Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li>
<li>Barekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+an+integrated+model+to+study+mild+repetitive+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 25252(2016).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Inflict+Closed+Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila.</a> J Vis Exp. (e52905), (2015).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).</li>
<li>Talavage, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally-detected+cognitive+impairment+in+high+school+football+players+without+clinically-diagnosed+concussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion.</a> J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).</li>
<li>Theadom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+impact+of+recurrent+traumatic+brain+injury+in+a+population-based+sample%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample.</a> J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).</li>
<li>Drobysheva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+histological+detection+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster.</a> J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).</li>
</ol>

Praca ta była wspierana przez fundusz startowy wydziału Johns Hopkins University School of Medicine dla L.C.

Modele zwierzęce, które wiernie odwzorowują cechy CTE, w tym zmiany neurofizjologiczne, cechy neuropatologiczne i deficyty neurobehawioralne, są niezbędne do odkrycia mechanizmów chorobowych oraz opracowania celów diagnostycznych i terapeutycznych. Zrozumiałe jest, że żaden zwierzęcy model ludzkiej choroby nie jest doskonały w naśladowaniu wszystkich klinicznie istotnych punktów końcowych. Uważamy jednak, że solidny model CTE powinien spełniać następujące trzy wymagania: (1) uderzenie musi być bezpośrednio zastosowane do...

Przewlekła encefalopatia pourazowa (CTE) została niedawno uznana za odrębne zaburzenie neurodegeneracyjne, odrębne od innych tauopatii, takich jak choroba Alzheimera1. W przeciwieństwie do choroby Alzheimera i innych powszechnych tauopatii, których najważniejszymi czynnikami ryzyka są zaawansowany wiek i historia demencji w rodzinie, CTE, jak wskazuje jego nazwa, sugeruje ścisły związek z historią urazów mózgu, najprawdopodobniej obserwowanych u sportowców sportów kontaktowych, takich jak bokserzy i piłkarze, a także u weteranów wojskowych2, 3,4,5. Uważa się, że jest inicjowany przez powtarzające się wstrząsowe i podwstrząsowe uderzenia w głowę. Pacjenci mogą wykazywać objawy przedmiotowe i przedmiotowe, takie jak deficyty poznawcze, zmiany nastroju i zachowania oraz dysfunkcje ruchowe, które w znacznym stopniu pokrywają się z chorobą Alzheimera, otępieniem czołowo-skroniowym, otępieniem z ciałami Lewy'ego i chorobą Parkinsona6. W przeciwieństwie do tego, badania pośmiertne tkanki mózgowej ujawniają wyraźny wzór hiperfosforylowanej akumulacji tau otaczającej małe naczynia krwionośne na głębokości bruzd korowych, patognomoniczna cecha nieobserwowana w innych stanach zwyrodnieniowych7. Jednak do tej pory bardzo niewiele wiadomo na temat patogenezy prowadzącej do manifestacji choroby. Wynika to w dużej mierze z braku wiernego modelu zwierzęcego - dopiero niedawno wygenerowano modele gryzoni5,8. Te organizmy modelowe mają wady związane z kosztowną intensywną opieką i stosunkowo długą żywotnością, które nie nadają się do badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
W porównaniu do ich ssaczych odpowiedników, zwierzęta bezkręgowe, takie jak Drosophila, stanowią doskonałą alternatywę, z ich opłacalną konserwacją, obszernymi narzędziami do analizy genetycznych uwarunkowań i stosunkowo krótką żywotnością9. Co ciekawe, mózgi much i ludzi mają ewolucyjnie zachowane szlaki molekularne i komórkowe, a także podobieństwa anatomiczne10,11,12. Wcześniej zgłoszono dwa pomysłowe modele Drosophila do badania urazowego uszkodzenia mózgu13,14. Pierwsze urządzenie "High Impact Trauma" (HIT) zaprojektowane przez Katzenbergera i współpracowników zawierało swobodnie poruszające się muchy w plastikowej fiolce, która była przywiązana do wolnego końca metalowej sprężyny13,15. Kiedy plastikowa fiolka została przechylona pionowo i zwolniona, uderzyła w poliuretanową podkładkę i spowodowała uraz u much, gdy odbijały się od ścianki fiolki i odbijały się. W przeciwieństwie do tego, Barekat i jego koledzy zaprojektowali inną metodę dostarczania przy użyciu platformy homogenizatora Omni Bead Ruptor-2414. Muchy obezwładniono za pomocą CO2 i umieszczono w probówce z nakrętką o pojemności 2 ml, która została przymocowana do homogenizatora i poddana zaprogramowanym warunkom wstrząsania. Jedną z korzyści płynących z używania systemu homogenizatora tkanek jest to, że eksperymentator może modulować intensywność urazu, czas trwania urazu i liczbę napadów urazu. Oba reżimy mają jednak tę samą wadę: pierwotne urazy głowy są zadawane losowo pod względem miejsca uderzenia i siły. Ponadto obie metody skutkowały znaczną śmiertelnością, spowodowaną nieuniknionymi ubocznymi uszkodzeniami innych części ciała i narządów wewnętrznych. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę indukowania mTBI u muszek owocowych. Nasza aparatura składa się z impaktora balistycznego napędzanego gazem. W porównaniu z istniejącymi modelami Drosophila14,15, nasza metoda ma wyjątkową zaletę, że zapewnia mierzalne uderzenie, skierowane tylko na swobodnie poruszającą się głowicę muchy, co pozwala na dokładną kontrolę różnych czynników, takich jak siła uderzenia, odstęp czasu między uderzeniami i całkowita liczba doznanych uderzeń.

<table><tbody><tr><td>Bariera aerozolowa</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Używana jako impaktor</td></tr><tr><td>200 &#956; L Końcówka do pipet</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td>Używana jako uchwyt na głowicę muchową</td></tr><tr><td>1000 &#956; L Końcówka do pipet</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Używana jako łącznik</td></tr><tr><td>1 mL Strzykawka tuberkulinowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Używany jako areny śledzące</td></tr><tr><td>Regulator przepływu</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WC</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy uchwyt zaciskowy/stojak</td><td>EISCO Scientific</td><td>CH0688</td><td></td></tr><tr><td>Drobna szczotka</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td></td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silikonowy elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td>HD-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ctrax Walking Fly Tracker</td><td>Caltech</td><td>Ctrax 0.2.11</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu MATLAB</td><td></td><td>R2015b</td><td></td></tr></tbody></table>

nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u drosophila

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Przewlekła encefalopatia pourazowa (CTE) jest uznaną chorobą neurodegeneracyjną, która jest ściśle związana z narażeniem na powtarzające się łagodne urazowe uszkodzenie mózgu (mTBI). Mechanizmy odpowiedzialne za jego złożone zmiany patologiczne pozostają w dużej mierze nieuchwytne, pomimo niedawnego konsensusu w sprawie zdefiniowania kryteriów neuropatologicznych. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę opracowania modelu CTE u Drosophila melanogaster (Drosophila ) w próbie zidentyfikowania kluczowych genów i szlaków, które prowadzą do charakterystycznej hiperfosforylowanej akumulacji tau i śmierci neuronów w mózgu. Uderzenia o regulowanej sile w celu zadawania łagodnych zamkniętych obrażeń są dostarczane bezpośrednio do głowicy muchy, poddając głowę gwałtownemu przyspieszaniu i zwalnianiu. Nasza metoda eliminuje potencjalne problemy związane z innymi modelami Drosophila mTBI (np. śmierć zwierzęcia może być wywołana uszkodzeniem innych części ciała lub narządów wewnętrznych). Mniej pracochłonna i kosztowna opieka nad zwierzętami, krótka żywotność i rozbudowane narzędzia genetyczne sprawiają, że muszka owocowa idealnie nadaje się do badania patogenezy CTE i umożliwia wykonywanie badań genetycznych i farmakologicznych na dużą skalę, obejmujących cały genom. Przewidujemy, że trwająca charakterystyka modelu dostarczy ważnych mechanistycznych spostrzeżeń na temat zapobiegania chorobom i podejść terapeutycznych.

Aby opracować model CTE z wykorzystaniem dorosłych Drosophila, określiliśmy skuteczność naszego urządzenia w zadawaniu pojedynczego zamkniętego urazu głowy. W celu wyeliminowania zmienności związanej z genotypem, płcią lub wiekiem, w eksperymencie wykorzystaliśmy 2-dniowe samice much Canton-S WT. Siłę uderzenia mogliśmy łatwo kontrolować poprzez regulację natężenia przepływu CO2 przy stałym ciśnieniu gazu 100 kPa. Muchy poddane pojedynczemu uderzeniu przy najwyższym n...

Tutaj opisujemy nowe podejście do zadawania urazów mózgu u Drosophila melanogaster. Nasza metoda ma tę zaletę, że bezpośrednio dostarcza powtarzalne uderzenia z regulowaną siłą do samej głowy. Dalsze badania układu bezkręgowców pomogą rzucić światło na patogenezę przewlekłej encefalopatii pourazowej.

Nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Ogólnym celem tej nowej procedury jest wywołanie zamkniętych urazowych uszkodzeń mózgu u muszki owocówki, Drosophila, w celu stworzenia nowego modelu przewlekłej encefalopatii urazowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłej encefalopatii urazowej, takie jak mechanizm, w jaki powtarzające się urazy indukują degenerację neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zadawanie powtarzających się uderzeń o regulowanej sile bezpośrednio w głowę muchy, bez powodowania uszkodzeń innych części ciała zwierzęcia.Praktyczna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy montażu urządzenia oraz wprowadzania much są trudne do opanowania ze względu na niewielki rozmiar głowy Drosophila oraz konieczność wywarcia uderzenia wyłącznie na obszar głowy. Aby przygotować aparat służący do wstrząsania lub uderzania muszek owocówek, należy najpierw wykonać element uderzający urządzenia. Wyjmij tłok z jednofazowej poliwęglanowej strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml, a następnie odetnij korpus strzykawki na poziomie oznaczenia 1 ml.Jako impaktor należy wykorzystać barierę aerozolową znajdującą się na końcówce pipety 200 µL. Impaktor ten powinien mieć 3 mm długości i 4 mm średnicy. Następnie należy umieścić impaktor w tulei strzykawki płaską stroną w kierunku dyszy.Aby zapewnić odpowiednią siłę, należy podłączyć cylinder strzykawki do regulatora przepływu dwutlenku węgla. Regulator musi posiadać przełącznik On Off oraz umożliwiać precyzyjną kontrolę natężenia przepływu gazu. Następnie cylinder należy przymocować pionowo do statywu żelaznego w taki sposób, aby impaktor mógł opaść na dno cylindra.Następnie przygotuj uchwyt do much. Wykorzystaj w tym celu końcówkę do pipety o pojemności 200 µL. Odetnij końcówkę pipety 5 mm od węższego końca, aby uzyskać otwór o średnicy 8 mm.Przez ten otwór zmieści się głowa muchy, ale nie zmieści się tułów. Na koniec przygotuj uchwyt dla muchy oraz urządzenie uderzeniowe. Najpierw odetnij końcówkę pipety o pojemności jednego mililitra 44 mm od małego otworu.Po drugie, odetnij odcinek o długości 6 mm z osłony igły do strzykawki o pojemności 1 mL. Następnie zsuń oba elementy ze sobą. Znieczul jedną, dwudniową dorosłą samicę muchy za pomocą dwutlenku węgla.Z podkładki z dwutlenkiem węgla, za pomocą cienkiego pędzla, delikatnie przenieś muchę do uchwytu. Następnie lekko opukaj uchwyt, aż głowa wysunie się z końcówki. Jeśli aparat gębowy (proboscis) jest widoczny, użyj stępionej igły od strzykawki o pojemności 1 mL, aby delikatnie wsunąć go z powrotem do końcówki.Kluczowe jest utrzymanie ciała muchy, a w szczególności części gębowych, wewnątrz uchwytu. W przeciwnym razie mucha może zginąć z powodu uszkodzenia organów wewnętrznych lub niemożności przyjmowania pokarmu. Następnie należy ustawić ciśnienie gazu na 100 kilopascals i dostosować przepływ zgodnie z potrzebami.Po umieszczeniu muchy, przytwierdź uchwyt do korpusu strzykawki za pomocą łącznika w taki sposób, aby głowa muchy była skierowana w dół. Następnie, używając przełącznika, podaj impuls gazu, który przesunie uderzacz tak, aby uderzył w muchę dokładnie jeden raz. Teraz odłącz uchwyt i przełóż muchę z powrotem na podkładkę z dwutlenkiem węgla.Przenieś muchę pędzelkiem do pustej fiolki i poczekaj, aż odzyska sprawność. W każdej fiolce powinna znajdować się jedna mucha. Proces regeneracji trwa zaledwie kilka minut.Powtórz ten proces, aby przebadać po cztery muchy w każdej grupie eksperymentalnej. Przetwarzanie dwóch grup, testowej i pozorowanej, powinno zająć od 20 do 30 minut. Postępuj z grupą pozorowaną tak samo jak ze zwierzętami testowymi, z wyjątkiem tego, że w rurce impaktora nie umieszczaj bariery aerozolowej.Aby śledzić ruchy much w szalce Petriego, najpierw wypełnij szalkę o średnicy sześciu centymetrów przezroczystym elastomerem silikonowym, tworząc arenę do śledzenia. Pozostaw trzymilimetrową szczelinę między silikonem a pokrywką, tak aby muchy mogły swobodnie poruszać się w tej przestrzeni, ale nie mogły wzbić się w powietrze. Pod areną do śledzenia umieść białe tło.Następnie znieczul cztery muchy z tej samej grupy badawczej i umieść je w arenie. Pozostaw muchy na godzinę w celu aklimatyzacji w arenie, która powinna być w pełni oświetlona i znajdować się w temperaturze około 22 °C. Temperatura nie powinna przekraczać temperatury pokojowej.Po godzinie, użyj kamery z urządzeniem sprzężonym ładunkowo (CCD) umieszczonej nad areną, aby zarejestrować aktywność muchy przez pięć minut. Po zakończeniu pięciominutowego nagrywania, znieczul muchy w arenie i przenieś je do nowej fiolki domowej. Następnie zutylizuj arenę.Następnie przeanalizuj nagrania, korzystając z bezpłatnego oprogramowania Ctrax. Oprogramowanie to generuje dane śledzenia, które mogą zostać wyeksportowane w formacie kompatybilnym z językami programowania, takim jak format MATLAB. Na podstawie uzyskanych danych oblicz dystans pokonany w jednej klatce, średni dystans marszu dla każdej muchy oraz średni dystans pokonany przez poszczególne muchy.Aby uzyskać istotność statystyczną, należy przebadać około 100 much w każdej grupie traktowania. W celu opracowania modelu przewlekłej encefalopatii pourazowej przeanalizowano skuteczność pojedynczego urazu zamkniętego głowy, wykonanego za pomocą aparatu uderzeniowego przy różnych prędkościach, na dwudniowych samicach szczepu Canton-S. Ciśnienie gazu utrzymywano na poziomie 100 kilopascals.Muchy narażone na pojedyncze uderzenie przy najwyższym testowanym przepływie wykazywały minimalne wady zewnętrzne. Mimo braku wyraźnych dowodów na uszkodzenia zewnętrzne, obrażenia przy przepływie 15 litrów na minutę były bezpośrednio śmiertelne, co skutkowało przeżywalnością poniżej 10% w ciągu 24 godzin. Przeżywalność wzrastała przy niższych wartościach przepływu.Sto procent przeżywalności osiągnięto przy przepływie pięciu litrów na minutę lub mniej, dlatego pięć litrów na minutę wybrano jako standard dla modelu. Tuż po uderzeniu muchy stopniowo odzyskiwały mobilność w ciągu czterech minut. Czas powrotu do sprawności w grupie kontrolnej (shams) był o około minutę krótszy.Po uderzeniu zastosowano śledzenie ruchu wspomagane wideo w celu pomiaru funkcji lokomocyjnych. W ciągu dwóch dni po uderzeniu zdolność poruszania się powoli powróciła do normy. Dowód na stopniowy powrót do sprawności jest zgodny z procesem rekonwalescencji po CTE u ludzi.Aby ocenić efekty długofalowe, zastosowano protokół powtarzalnego urazowego uszkodzenia mózgu polegający na zadaniu pięciu uderzeń w ciągu pięciu dni. Dwudziestego dnia po zabiegu porównano lokomocję przeżywających osobników w każdej z grup, wykazując, że grupa poddana zabiegowi poruszała się wyraźnie mniej. Czas przeżycia grupy poddanej zabiegowi był również znacznie krótszy, z medianą wynoszącą 26 dni w porównaniu do 37 dni w grupie kontrolnej.Po opracowaniu, technika ta otwiera przed badaczami w dziedzinie łagodnych powtarzających się urazów mózgu możliwość badania mechanizmów patogennych w klasycznym modelu zwierzęcym Drosophila melanogaster. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o osłonięciu cykutły, klatki piersiowej i odwłoka przed bezpośrednim uderzeniem za pomocą bariery aerozolowej.

a-novel-method-to-model-chronic-traumatic-encephalopathy-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

Ten film demonstruje procedurę zadawania obrażeń urazu głowy u znieczulonych muchówek Drosophila za pomocą urządzenia uderzeniowego z impaktorem napędzanym gazem. Uraz wpływa na funkcje neuronów i upośledza zdolność chodzenia.

Technika zadawania urazowego uszkodzenia mózgu u muchówek Drosophila

Film demonstruje użycie urządzenia High-Impact Trauma (HIT) do wywołania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową (TBI) u Drosophila. TBI powoduje mechaniczny uraz mózgu wpływający na funkcje neuronów, co z czasem prowadzi do neurodegeneracji i śmiertelności.

Metoda zadawania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową u Drosophila

Ten film pokazuje indukcję penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu w mózgu drosophila. Nowo wylęgłe muchy są selekcjonowane, znieczulane i umieszczane pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym we fluorescencję. Identyfikowany jest korpus grzyba wykazujący ekspresję GFP i wkładana jest szpilka Minutien w celu spowodowania obrażeń. Muchom pozwala się wyzdrowieć w celu dalszych badań.

Wywoływanie penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu u dorosłych much Drosophila

Opisujemy tutaj procedury ekstrakcji i oczyszczania mRNA i metabolitów z głów Drosophila. Stosujemy te techniki, aby lepiej zrozumieć perturbacje komórkowe leżące u podstaw degeneracji neuronów. Metodologie te można łatwo skalować i dostosowywać do innych projektów "omicznych".

Oczyszczanie transkryptów i metabolitów z głów Drosophila

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.

Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Tutaj opisujemy metodę zadawania zamkniętego urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u Drosophila. Metoda ta stanowi bramę do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw patologii TBI, przy użyciu szerokiej gamy narzędzi i technik eksperymentalnych dostępnych dla much.

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Poznaj nową metodę modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila melanogaster. Technika umożliwia kontrolowane uderzenia w głowę muchy bez uszkadzania innych części ciała.

Nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów