Name: Ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i oczyszczania polifenoli z liofilizowanych jagód przy użyciu ultradźwięków i rozpuszczalników organicznych. Technika ta umożliwia badanie wpływu związków na komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez American Heart Association (14GRNT20180028) oraz Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj 80% etanol (100 ml), mieszając 80 ml absolutnego etanolu (klasy biologicznej molekularnej) i 20 ml sterylnej wody do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Aby przygotować ekstrakt polifenolowy (10 mg/ml), należy odważyć 10 mg CE lub PE. Dodaj 1 ml zwykłego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) pod kapturem do hodowli komórkowych. Wiruj roztwór. Podwielokrotność rozliczyć w porcjach po 200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml 1 M roztworu podstawowego HEPES (pH 7,4; 50 mM wersja ostateczna), 1 ml 5 M roztworu podstawowego NaCl (50 mM wersja ostateczna), 1 ml 0,5 M roztworu podstawowego EDTA (5 mM wersja ostateczna), 2 ml 0,5 M roztworu podstawowego NaF (10 mM wersja ostateczna), 286 μl roztworu podstawowego 700 mM Na3VO4 (2 mM wersja ostateczna), 5 ml 200 mM roztworu podstawowego Na4P2O7 (10 mM końcowy) i 5 ml 20% roztworu podstawowego Triton-X-100 przygotowanego w wodzie (1% końcowy). Dodaj wodę, aby osiągnąć objętość 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 10 μl/ml koktajlu inhibitorów proteazy. Dodaj świeże, gdy komórki będą gotowe do lizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do próbek Laemmli (4x).
	<ol>
		<li>Dodać 31,25 ml 2 M roztworu podstawowego Tris (pH 6,8), 100 ml glicerolu, 50 ml 20% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) przygotowanego w wodzie i 50 ml β-merkaptoetanolu. Dodaj wodę do 250 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować bufor do soli fizjologicznej (TBS), należy odważyć 3 g Tris (25 mM wersja ostateczna), 0,18 g KCl (2,5 mM wersja ostateczna) i 8,76 g NaCl (150 mM wersja ostateczna). Ustaw pH na 7,4 i dodaj wodę do 1 l. Trzymaj w temperaturze RT.</li>
	<li>Aby przygotować TBS-T, dodaj 997,5 ml TBS i 2,5 ml 20% roztworu Triton-X-100 przygotowanego w wodzie. Trzymaj się RT.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów z czerni
<ol>
	<li>Przygotowanie surowego ekstraktu z liofilizowanego proszku jagodowego.
	<ol>
		<li>Zważ 10 g liofilizowanej jeżyny w proszku (lub 5 g świeżego proszku). Jeśli używane są mrożone owoce, przed rozpoczęciem ekstrakcji pokrój je na bardzo małe kawałki.</li>
		<li>Wymieszać proszek owocowy ze 100 ml 80% wodnego roztworu etanolu w okrągłodennej kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l.</li>
		<li>Sonikować mieszaninę przez 20 minut przy 42 kHz, 135 W, używając łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 25 °C, bez żadnych odstępów czasowych pomiędzy nimi. Wykonaj sonikację z ciągłym przedmuchiwaniem azotem w przytłumionym świetle. W przypadku mrożonych owoców wydłuż czas inkubacji do 4 godzin.</li>
		<li>Przefiltrować mieszaninę przez bibułę filtracyjną #2 za pomocą schłodzonego lejka Buchnera z odsysaniem próżniowym. 
		UWAGA: Pod koniec tego etapu na bibule filtracyjnej pojawiają się pozostałości próbki; Nazywa się to placekiem filtracyjnym.</li>
		<li>Przepłukać placek filtracyjny 50 ml 100% etanolu. Zachować filtrat i dodać placek filtracyjny do kolby okrągłodennej o pojemności 1 litra zawierającej 100 ml 80% wodnego roztworu etanolu.</li>
		<li>Powtórzyć proces ekstrakcji pozostałości (etapy 2.1.2 - 2.1.4).</li>
		<li>Połączyć oba filtraty w kolbie okrągłodennej z dodatkowymi 50 ml 80% wodnego roztworu etanolu. 
		UWAGA: Ostateczna objętość powinna wynosić około 300 ml.</li>
		<li>Użyć wyparki obrotowej o temperaturze 62 °C i prędkości 50 obr./min, aby odparować rozpuszczalnik. Kontynuuj ten proces, aż etanol przestanie parować. 
		UWAGA: Ten proces trwa około 45 minut.</li>
		<li>Przenieść próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odparować etanol, wstrzykując gazowy azot w górnej części rurki przez 10 min. 
		UWAGA: Ten krok jest potrzebny, aby zapewnić całkowite odparowanie etanolu. Objętość próbki na tym etapie wynosi około 20 ml.</li>
		<li>Zamrażać próbkę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 h. 
		UWAGA: Ten krok jest potrzebny, aby umożliwić bardziej wydajny proces liofilizacji.</li>
		<li>Próbkę należy liofilizować w temperaturze -50 °C przez około 8 godzin. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Liofilizator wytwarza silne podciśnienie w temperaturze -50 °C wewnątrz komory w celu wysuszenia próbek, ale zachowuje większość związków, takich jak polifenole.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie oczyszczonych ekstraktów polifenolowych z ekstraktów surowych.
	<ol>
		<li>Zważyć liofilizowane próbki ekstrahowane. 
		UWAGA: Objętość ekstraktu na tym etapie wynosi około 10 ml.</li>
		<li>Dodać dwie objętości (~20 ml) chloroformu do surowego ekstraktu i wstrząsać roztworem przez 5 minut na mieszance.</li>
		<li>Wlej mieszaninę do rozdzielacza. Pozostaw ekstrakt surowy na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby uzyskać oczyszczoną frakcję. 
		UWAGA: Na tym etapie utworzy się dwufazowa mieszanina.</li>
		<li>Wyrzucić dolną warstwę (fazę chloroformu) z rozdzielacza i zebrać warstwę wodną do czystej zlewki.</li>
		<li>Dodać dwie objętości octanu etylu do frakcji wodnej i za pomocą mieszadła magnetycznego mieszać mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przefiltrować mieszaninę przez bibułę filtracyjną #2 za pomocą schłodzonego lejka Buchnera z odsysaniem próżniowym.</li>
		<li>Zebrać przefiltrowaną próbkę i przenieść ją do kolby okrągłodennej, która ma być używana z wyparką obrotową.</li>
		<li>Ustawić parownik obrotowy na 62 °C i 50 obr./min i odparowywać octan etylu przez około 30 minut.</li>
		<li>Próbkę liofilizować w temperaturze -50 °C przez około 8 godzin. Przenieść próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie VSMC ekstraktami z jagód
<ol>
	<li>Kultura VSMC.
	<ol>
		<li>Wyizoluj VSMC z aort piersiowych szczurów Sprague-Dawley, przeprowadzając trawienie enzymatyczne, jak opisano wcześniej29. Kultura VSMC zgodnie z opisem29.</li>
		<li>Przygotować kompletną pożywkę do hodowli VSMC przy użyciu DMEM zawierającego 1 g / l glukozy i uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U / ml penicyliny, 100 mg / ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy. Przechowywać całe podłoże w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja VSMC z ekstraktami polifenolowymi.
	<ol>
		<li>Aby podzielić VSMC, wyrzuć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodaj 4 ml PBS i 2 ml trypsyny EDTA 0,25%. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
		<ol>
			<li>Zebrać komórki, wymieszać je z 2 ml kompletnej pożywki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 100 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml PBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
			<li>Wysiewaj 50 000 VSMC na dołek na 6-dołkowych płytkach hodowlanych i hoduj je na kompletnym podłożu zawierającym 10% FBS, aż osiągną 90% konfluencji (około 3 dni). Utrzymuj VSMC w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do zabiegu za pomocą pożywki DMEM zawierającej 1 g/l glukozy, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 0,5% FBS. Przechowywać pożywkę zabiegową w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Ekstrakty polifenolowe i Ang II są dodawane bezpośrednio do komórek za pomocą tego podłoża.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml surowego ekstraktu (CE) lub oczyszczonego ekstraktu (PE) polifenoli, rozpuszczając 10 mg ekstraktu w 1 ml zwykłej pożywki DMEM. Przechowywać zapas w podwielokrotnościach 200 μl w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Inkubować VSMC z 2 ml pożywki zabiegowej zawierającej 0,5% FBS i dodać ekstrakty CE lub PE do uzyskania stężenia 50 - 500 μg/ml. Zmieniaj pożywkę co 24 godziny, dodając świeże ekstrakty polifenolowe. Traktuj komórki przez 3 dni.</li>
		<li>W przypadku leczenia Ang II lub innymi hormonami i czynnikami wzrostu, należy zagłodzić komórki przez co najmniej 24 godziny poprzez inkubację komórek z pożywką zawierającą 0,5% FBS przed dodaniem Ang II (100 nM). 
		UWAGA: Zaleca się inkubację z CE i PE i bez CE i PE w 0,5% pożywce zabiegowej FBS przed dodaniem Ang II.
		<ol>
			<li>Po 24 godzinach głodu dodaj 100 nM Ang II. Podłoże zabiegowe należy wymieniać na świeże CE, PE lub Ang II co 24 godziny przez 3 dni.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek komórek.
	<ol>
		<li>Umyj poddane działaniu substancji komórki dwukrotnie w zimnym PBS i poddaj je lizie za pomocą 200 μl buforu do lizy na lodzie.</li>
		<li>Zebrać lizaty komórkowe za pomocą skrobaków do komórek i przenieść lizaty do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Inkubować całkowite lizaty komórkowe przez 20 minut na lodzie i wirować co 5 minut.</li>
		<li>Sonizacja ekstraktów komórkowych za pomocą trzech impulsów o mocy 125 W przez 10 s każdy, z przerwą na 2 s pomiędzy nimi. Próbki należy przechowywać na lodzie przez cały czas trwania sonikacji.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie białka za pomocą odczynnika do oznaczania białek przy długości fali 595 nm.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy metodą Western blot.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blot.
	<ol>
		<li>Zmieszać równe ilości białka (około 50 μg) z próbek kontrolnych niepoddanych działaniu substancji i próbek poddanych działaniu polifenoli lub próbek poddanych działaniu Ang II z buforem do lizy, aby uzyskać maksymalną całkowitą objętość 50 μl. Dodać 16 μl 4x buforu do próbek Laemmli. Podgrzewać próbki przez 5 minut w temperaturze 75 °C.</li>
		<li>Rozdzielić próbki w 10% żelach SDS-PAGE i przenieść je do membran PDVF pod napięciem 10 V przez 75 minut w półsuchym systemie transferowym do analizy Western blot ze specyficznymi przeciwciałami.</li>
		<li>Zatkać membranę 2% mlekiem w buforze TBS 0,05% Triton-X100 (TBS-T) na 20 min.</li>
		<li>Usunąć mleko, przemywając membranę co najmniej trzykrotnie TBS (po 5 minut każdy) i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć błonę trzy razy po 10 minut za pomocą TBS-T i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP przez 45 minut.</li>
		<li>Przemyć membranę trzy razy po 10 minut za pomocą TBS-T i wywołać metodą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biological+effects+of+dietary+phenolic+compounds%3A+relevance+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664075">Gut microbiota in health and disease.</a> Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).</li>
<li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols%3A+food+sources+and+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).</li>
<li>Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onions--a+global+benefit+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother+Res%22%5BJournal%5D)">Onions--a global benefit to health.</a> Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).</li>
<li>Mazzoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+aspects+of+berries%3A+from+field+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sci+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">The genetic aspects of berries: from field to health.</a> J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).</li>
<li>Wang, S. Y., Jiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+capacity+of+berry+crops+on+superoxide+radicals%2C+hydrogen+peroxide%2C+hydroxyl+radicals%2C+and+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen.</a> J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).</li>
<li>Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+black+raspberry+seed+containing+anthocyanins+against+oxidative+damage+to+DNA%2C+protein%2C+and+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid.</a> J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).</li>
<li>Forbes-Hernandez, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Healthy+Effects+of+Strawberry+Polyphenols%3A+Which+Strategy+behind+Antioxidant+Capacity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).</li>
<li>Figueira, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+a+blueberry+extract+in+acute+inflammation+and+collagen-induced+arthritis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat.</a> Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).</li>
<li>Daglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyphenols as antimicrobial agents.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).</li>
<li>Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenol+protection+and+treatment+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Polyphenol protection and treatment of hypertension.</a> Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).</li>
<li>Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+Efficacy+of+Polyphenols+and+Their+Combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations.</a> Nutrients. 8 (9), E552(2016).</li>
<li>Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+raspberries+in+cancer+clinical+trials%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Berry+Res%22%5BJournal%5D)">Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future.</a> J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).</li>
<li>Hertog, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+intake+and+long-term+risk+of+coronary+heart+disease+and+cancer+in+the+seven+countries+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study.</a> Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).</li>
<li>Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+flavonoids+and+cardiovascular+disease+incidence+or+mortality+in+European+and+US+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations.</a> Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+anthocyanin+intake+is+associated+with+a+reduced+risk+of+myocardial+infarction+in+young+and+middle-aged+women%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women.</a> Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).</li>
<li>Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+flavonoid+intakes+and+CVD+incidence+in+the+Framingham+Offspring+Cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort.</a> Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).</li>
<li>Aghababaee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blackberry+%28Morus+nigra+L.%29+consumption+on+serum+concentration+of+lipoproteins%2C+apo+A-I%2C+apo+B%2C+and+high-sensitivity-C-reactive+protein+and+blood+pressure+in+dyslipidemic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Res+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients.</a> J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).</li>
<li>Jeong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Rubus+occidentalis+extract+on+blood+pressure+in+patients+with+prehypertension%3A+Randomized%2C+double-blinded%2C+placebo-controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial.</a> Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).</li>
<li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antihypertensive+effect+of+ethyl+acetate+extract+from+red+raspberry+fruit+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogn+Mag%22%5BJournal%5D)">The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats.</a> Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).</li>
<li>Feresin, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blackberry%2C+raspberry+and+black+raspberry+polyphenol+extracts+attenuate+angiotensin+II-induced+senescence+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells.</a> Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).</li>
<li>Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+biosynthesis+by+anthocyanin+fraction+of+blackberry+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract.</a> Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).</li>
<li>Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+chemoprevention+of+black+raspberry+extracts%3A+from+transcription+factors+to+their+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes.</a> Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+extract+of+unripe+Rubus+coreanus+fruit+attenuates+atherosclerosis+by+improving+blood+lipid+profile+and+inhibiting+NF-%CE%BAB+activation+via+phase+II+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression.</a> J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).</li>
<li>Wang, J., Mazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anthocyanins+and+other+phenolic+compounds+on+the+production+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+LPS%2FIFN-gamma-activated+RAW+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages.</a> J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).</li>
<li>Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavanols+and+anthocyanins+in+cardiovascular+health%3A+a+review+of+current+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence.</a> Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).</li>
<li>Kim, D. O., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142913.fai0102s06/abstract">Extraction and Isolation of Polyphenolics.</a> Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).</li>
<li>Queires, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+%28Schinus+terebinthifolius%2C+Raddi%29+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li>
<li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phosphatidylinositol-specific+phospholipase+C+from+cultured+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells.</a> J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).</li>
<li>Vuong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+polyphenol-enriched+preparation+on+chemoprevention+of+mammary+carcinoma+through+cancer+stem+cells+and+inflammatory+pathways+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation.</a> J Transl Med. 14, (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Polifenole wyizolowane z jagód zawierają różne składy. Opisany tutaj protokół ekstrakcji na bazie etanolu pozwolił na identyfikację różnych poziomów kwasów fenolowych i flawonoidów obecnych w surowych i oczyszczonych ekstraktach polifenolowych BL (tab. 1). CE został wzbogacony w kwas galusowy, kwas ferulowy, kwas 4-O-kawoilochinowy i kwas 5-O-kawoilochinowynowy. Proces oczyszczania nie zmienił istotnie poziomu kwasu galusowego i kwasu p-kumarowego. Zwiększył jednak poziom kwasu 3-O-kawoilochinowego ze 17...

Polifenole to związki zawierające co najmniej jeden pierścień fenolowy w swojej strukturze i są obficie obecne w królestwie roślin1. Ludzie od tysiącleci spożywają rośliny w celach leczniczych, nie zdając sobie sprawy z istnienia takich związków2. Wiele owoców i warzyw ma pewne wspólne związki polifenolowe, choć w różnych ilościach, w tym flawonoidy, stylbeny i kwasy fenolowe3. Chociaż polifenole są często kojarzone z kolorowymi owocami i warzywami, nie jest to do końca prawda. Na przykład zeaksantyna i ksantyna są obecne w warzywach, które nie są zbyt kolorowe, takich jak cebula i czosnek, które pochodzą z rodziny szalotek i są związane z licznymi korzyściami zdrowotnymi4. Oprócz tego, że polifenole kojarzą się z wieloma korzyściami zdrowotnymi5, służą również roślinom, chroniąc je przed owadami i promieniowaniem ultrafioletowym2. Polifenole są powszechnie spotykane w diecie człowieka i są uważane za silne przeciwutleniacze, ponieważ mogą wymiatać reaktywne formy tlenu (ROS)6,7,8. Mają również właściwości przeciwzapalne9, przeciwbakteryjne10, przeciwnadciśnieniowe11 i przeciwrakotwórcze12,13.
Badania epidemiologiczne wykazują odwrotny związek między spożyciem flawonoidów a częstością występowania chorób sercowo-naczyniowych (CVD)16,17 i śmiertelność14,15. Jagody są powszechnie spożywane w USA i zawierają duże ilości polifenoli, w tym flawonoidów. Na przykład spożywanie soku z jeżyn (BL) (300 ml/d) przez osiem tygodni znacznie obniżyło skurczowe ciśnienie krwi u pacjentów z dyslipidemią18. Jeong i wsp.19 poinformował, że mężczyźni i kobiety z nadciśnieniem spożywający 2,5 g ekstraktu z czarnej maliny (BRB) dziennie mieli niższe ciśnienie krwi w ciągu 24 godzin i nocy w porównaniu do osób spożywających placebo. Maliny (RB) obniżyły ciśnienie krwi, jednocześnie zwiększając ekspresję dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) u szczurów z samoistnym nadciśnieniem20. Niedawno wykazano, że BL, RB i BRB obniżają poziom ROS i starzenia się indukowanego przez angiotensynę II (Ang II) w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMCs)21. Ponadto frakcja antocyjanów z ekstraktu BL zmniejszała ekspresję indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) i hamowała aktywność czynnika jądrowego kappa B (NF-κB) i kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) w stymulowanych lipopolisacharydami (LPS) komórkach J774 stymulowanych lipopolisacharydami22. Ekstrakty BRB zmniejszyły aktywację NF-κB i ekspresję cyklooksygenazy 2 (COX-2) in vitro 23, poprawiły profil lipidowy i zapobiegły powstawaniu zmian miażdżycowych u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową24. Antocyjany, które są uważane za najobficiej występujące flawonoidy w jagodach, modulują odpowiedź zapalną w makrofagach RAW 264.7 stymulowanych przez LPS poprzez zmniejszenie produkcji czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) 25 i zmniejszają proliferację i migrację VSMCs26.
Ponieważ rośnie zainteresowanie zrozumieniem roli polifenoli w ludzkim zdrowiu i chorobach, ważne jest, aby zoptymalizować metodę ekstrakcji. Ekstrakcja rozpuszczalnikowa jest szeroko stosowana w tym celu, ponieważ jest opłacalna i łatwa do odtworzenia. W tym badaniu zastosowano ekstrakcję rozpuszczalnikiem etanolem, wraz z metodą ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami, która została zaadaptowana z Kim and Lee27. Oczyszczanie i frakcjonowanie surowych ekstraktów (CE) przy użyciu chloroformu i octanu etylu przeprowadzono w celu uzyskania oczyszczonej frakcji ekstraktu (PE), która została zaadaptowana z Queires et al28. Ponadto porównano skuteczność surowych i oczyszczonych ekstraktów polifenolowych z BL w zmniejszaniu podstawowej fosforylacji ERK1/2 i przedstawiono reprezentatywne przykłady hamującego wpływu oczyszczonego ekstraktu polifenolowego BL na indukowane przez Ang II redukcje sygnalizacji VSMC.

<table><tbody><tr><td>Angiotensyna II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>Leczenie VSMC</td></tr> <tr><td>i beta-aktyny</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:5000)</td></tr><tr><td>Owoce jeżyny</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>Liofilizowana jeżyna w proszku</td></tr><tr><td>Katalaza&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>Przygotowanie oczyszczonych ekstraktów polifenolowych</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>Hodowla VSMC</td></tr><tr><td>Etanol (absolutna klasa biologii molekularnej)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>Preparat ekstraktów polifenolowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>Przygotowanie oczyszczonych ekstraktów polifenolowych</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S Przeciwciało</td><td>pierwszorzędowe (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8,0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>Przygotowanie ekstraktów polifenolowych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>Bufor do lizy&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , dziesięciowodny</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>fosfo ERK1/2&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>9101S Przeciwciało</td><td>pierwotne (1:1000)</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Odczynnik barwnikowy do oznaczania białek</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>Pomiar stężenia białka Membrana</td></tr><tr><td>transferowa PVDF</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>Przygotowanie ekstraktów polifenolowych</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>Przygotowanie ekstraktów polifenolowych</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>Przygotowanie ekstraktów komórkowych</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td>Bibuła filtracyjna <td>X100</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Whatman #2</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>Otrzymywanie ekstraktów polifenolowych</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Badania epidemiologiczne wskazują, że zwiększone spożycie flawonoidów koreluje ze zmniejszoną śmiertelnością z powodu chorób sercowo-naczyniowych (CVD) w Stanach Zjednoczonych (USA) i Europie. Jagody są powszechnie spożywane w USA i mają wysoką zawartość polifenoli. Wykazano, że polifenole wchodzą w interakcje z wieloma celami molekularnymi i wywierają liczne pozytywne funkcje biologiczne, w tym działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i kardioprotekcyjne. Polifenole wyizolowane z jeżyny (BL), maliny (RB) i maliny czarnej (BRB) zmniejszają stres oksydacyjny i starzenie się komórek w odpowiedzi na angiotensynę II (Ang II). Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis protokołu stosowanego do przygotowania ekstraktów polifenolowych z liofilizowanych jagód. Ekstrakcje polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego przeprowadzono przy użyciu 80% wodnego etanolu i metody ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami. Surowy ekstrakt poddano dalszemu oczyszczaniu i frakcjonowaniu przy użyciu odpowiednio chloroformu i octanu etylu. Działanie zarówno surowych, jak i oczyszczonych ekstraktów przetestowano na komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) w hodowli.

Wcześniej wykazano, że ekstrakty polifenolowe wyizolowane z BL, RB i BRB hamowały starzenie się VSMC w odpowiedzi na Ang II21. Wykazano, że te oczyszczone ekstrakty polifenolowe modulują sygnalizację Ang II poprzez redukcję fosforylacji Akt, kinazy p38 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) oraz ERK1/2. BL zapobiega starzeniu poprzez zmniejszenie ekspresji oksydazy NADPH (Nox) 1, enzymu produkującego aniony ponadtlenkowe, którego ekspresja jest silnie zwiększana p...

Ta praca szczegółowo opisuje krok po kroku metodę przygotowania bogatych w polifenole ekstraktów z liofilizowanego proszku jagodowego. Ponadto zawiera dokładny opis sposobu stosowania tych bogatych w polifenole ekstraktów w hodowli komórkowej w obecności hormonu peptydowego angiotensyny II (Ang II) przy użyciu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC).

Ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie prostej i powtarzalnej metody ekstrakcji i oczyszczania polifenoli roślinnych, które mogłyby zostać wykorzystane w przyszłości do traktowania komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące roli żywności funkcjonalnej w zdrowiu i chorobach ludzi. Ta oparta na etanolu i wspomagana ultradźwiękami ekstrakcja polifenoli jest łatwą i powtarzalną metodą, która pozwala na uzyskanie wyższej wydajności polifenoli.Zastosowanie chloroformu pozwala na usunięcie cukrów, kwasów tłuszczowych, białek i innych cząsteczek, podczas gdy octan etylu umożliwia frakcjonowanie polifenoli. Te skoncentrowane ekstrakty polifenolowe mogą być następnie wykorzystane in vitro i in vivo do badania efektów działania polifenoli oraz ich mechanizmów oddziaływania na różne tkanki, w tym na układ sercowo-naczyniowy, zgodnie z opisem w niniejszej procedurze. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować odczynniki zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokole tekstowym.Następnie odważ 10 g liofilizowanego proszku z jagód jeżyn. Dodaj proszek z owoców do kolby okrągłodennej o pojemności jednego litra zawierającej 100 ml 80% etanolu wodnego. Umieść kolbę w kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze 25 °C.Pod stałym przedmuchiwaniem azotem w przyciemnionym świetle poddaj mieszaninę sonikacji przez 20 minut przy częstotliwości 42 kilohertz i mocy 135 watts. Następnie, używając schłodzonej lejka Buchnera z ssaniem próżniowym, przefiltruj mieszaninę przez papier filtracyjny numer dwa. Przepłucz osad na filtrze 50 milliliters 100%ethanol.Zatrzymaj filtrat, a osad z filtra przenieś do kolby okrągłodennej o pojemności jednego litra zawierającej 100 mililitrów 80% wodnego etanolu. Następnie powtórz proces ekstrakcji poprzez sonikację, filtrowanie i przemywanie mieszaniny. Połącz oba filtraty w kolbie okrągłodennej zawierającej 50 mililitrów 80% wodnego etanolu.Używając rotavapora przy temperaturze 62 °C i prędkości 50 rpm, odparuj rozpuszczalnik. Kontynuuj ten proces, aż etanol przestanie parować. Następnie przenieś próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.Przez 10 minut wdmuchuj azot w górną część probówki, aby odparować pozostały etanol. Zamroź próbkę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny. Następnie liofilizuj próbkę w temperaturze -50 °C przez około osiem godzin.Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Na początek odważyć liofilizowane próbki z ekstraktem. Dodać około 20 ml chloroformu do zlewki o pojemności 100 ml zawierającej próbkę.Używając mieszadła magnetycznego, mieszaj roztwór przez pięć minut. Następnie przelej mieszaninę do rozdzielacza. Pozostaw surowy ekstrakt do odstania przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie odrzuć warstwę dolną, a warstwę wodną zbierz do czystego zlewki. Do zlewki dodaj dwie objętości octanu etylu. Za pomocą mieszadełka magnetycznego mieszaj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie, używając schłodzonego lejka Buchnera z ssaniem próżniowym, przefiltruj mieszaninę przez papier filtracyjny nr 2. Przenieś przefiltrowaną próbkę do kolby okrągłodennej. Odparuj octan etylu przez 30 minut za pomocą rotacyjnego odparowacza w temperaturze 62 °C i przy 50 rpm.Następnie liofilizuj próbkę w temperaturze -50 °C przez osiem godzin. Przenieś próbkę do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Po wyhodowaniu komórek mięśni gładkich naczyń, odlej pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyj komórki roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.Następnie dodaj 4 ml PBS oraz 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubuj w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37°C przez pięć minut. Po tym czasie przenieś komórki do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 2 ml pożywki kompletnej.Wiruj przy 1 100 ×g przez pięć minut. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 1 ml PBS. Policz komórki, korzystając z komory countingowej (hemocytometru).Następnie, w sześciodołkowych płytkach hodowlanych, wysiej 50 000 komórek na dołek. Hoduj komórki do osiągnięcia 90% konfluencji w pełnym medium zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej. Przygotuj medium do traktowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie dodaj 10 mg ekstraktu surowego lub oczyszczonego do 1 ml zwykłego DMEM, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml. Przechowuj roztwór zapasowy w alikwotach po 200 µl w temperaturze -20°C. Po tym kroku dodaj do komórek 2 ml medium traktującego, zawierającego 0,5% fetal bovine serum oraz pożądane stężenie roztworu zapasowego.Inkubować przez trzy dni w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2. Następnie, w przypadku traktowania hormonami lub czynnikami wzrostu, poddać komórki głodzeniu przez co najmniej 24 godziny, inkubując je w medium do traktowania zawierającym 0,5% płodowej surowicy bydlęcej. Po głodzeniu dodać wybrany hormon, wymieniając medium do traktowania co 24 godziny przez trzy dni, zgodnie ze szczegółowym protokołem tekstowym.Następnie potraktowane komórki należy dwukrotnie przemyć zimnym PBS. Komórki lizuje się, używając 200 µL buforu do lizy w temperaturze lodu. Za pomocą skrobaków do komórek należy zebrać lizat komórkowy i przenieść go do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.Inkubuj zebrany lizat przez 20 minut na lodzie, mieszając w wirówce typu vortex co pięć minut. Następnie poddaj ekstrakty komórkowe sonikacji, stosując trzy impulsy o mocy 125 watów, każdy przez 10 sekund, z dwusekundową przerwą między impulsami. Za pomocą odczynnika do oznaczania białek przy długości fali 595 nanometrów zmierz stężenie białka.Wymieszaj 50 µg białka z buforem do lizy, aby uzyskać maksymalną objętość całkowitą 50 µL. Dodaj 16 µL 4x buforu do próbek Laemmli. Następnie inkubuj próbki przez pięć minut w temperaturze 75 °C.Rozdziel próbki w żelach SDS-PAGE 10% i przenieś je na membrany PVDF w celu przeprowadzenia analizy Western blot z użyciem specyficznych przeciwciał. W niniejszym badaniu zastosowano ekstrakcję na bazie etanolu w celu określenia zawartości różnych kwasów fenolowych i flawonoidów obecnych w surowych i oczyszczonych ekstraktach polifenolowych z jeżyn. Podczas gdy proces oczyszczania nie zmienił znacząco poziomu kwasu galowego ani kwasu p-kumarowego, zwiększył on stężenie kwasu 3-O-kofeoilochinowego ze 170,5 do 235,3 ppm oraz kwercetyny z 24,5 do 95 ppm.Z kolei kwas ferulowy i rutyna zostały utracone podczas oczyszczania surowego ekstraktu. Po ekstrakcji VSMC inkubowano przez trzy dni w obecności 50 do 500 µg/mL surowego lub oczyszczonego ekstraktu z jeżyn w pożywce zawierającej 0,5% płodowej surowicy bydlęcej. Obie formy ekstraktu okazały się skuteczne w redukcji podstawowego poziomu fosforylacji ERK.Zauważono jednak, że oczyszczony ekstrakt silnie hamuje ten proces przy stężeniu 100 µg/mL, podczas gdy w przypadku ekstraktu surowego wymagane stężenie wynosi od 400 do 500 µg/mL. Sugeruje to, że większa skuteczność oczyszczonego ekstraktu w hamowaniu fosforylacji ERK wynika z wyższego stężenia związków polifenolowych. Następnie VSMCs poddano 24-godzinnej inkubacji z oczyszczonym ekstraktem z jeżyn w stężeniu 200 µg/mL przed dodaniem 100 nM angiotensyny II. Jak wykazano we wcześniejszych doniesieniach, ekstrakt polifenolowy z jeżyn redukuje indukowaną przez angiotensynę II fosforylację ERK, lecz nie wykazuje wpływu na ekspresję katalazy lub SOD2.Po opanowaniu metody, ekstrakcja polifenoli może zostać przeprowadzona w ciągu kilku godzin. Technika ta może pomóc badaczom z dziedziny żywności funkcjonalnej w badaniu roli polifenoli in vitro oraz w modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo potrafić wyekstrahować i oczyścić polifenole z owoców i warzyw oraz wykorzystać otrzymane ekstrakty polifenolowe do traktowania komórek w kulturze.Wykorzystaliśmy tę metodę, aby wykazać rolę polifenoli z jeżyn w zapobieganiu starzeniu się komórek mięśni gładkich naczyń aorty. Jest to istotne, biorąc pod uwagę, że starzenie się układu naczyniowego stanowi główny czynnik ryzyka rozwoju chorób sercowo-naczyniowych.

extraction-purification-polyphenols-from-freeze-dried-berry-powder

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Tutaj opisane są testy biologiczne przeznaczone do monitorowania rozwoju patogenu grzybowego, Colletotrichum fioriniae, w obecności ekstraktów z kwiatów borówki lub żurawiny na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Techniki ekstrakcji kwiatów na bazie wody, chloroformu i wody deszczowej są szczegółowe, a także wgląd w to, jak można zastosować te informacje.

Colletotrichum fioriniae Rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Celem tego protokołu jest wykrywanie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą metody częściowo ukierunkowanej chromatografii i spektrometrii mas.

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Reakcje naczyniowe tętniczego krążenia płucnego można badać za pomocą komórek tętnicy śródpłucnej (IPA) i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). W niniejszym badaniu szczegółowo opisano izolację IPA oraz protokoły stosowane do badania wazorelaksacji w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne.

Izolacja komórek tętnic wewnątrzpłucnych i mięśni gładkich w celu zbadania odpowiedzi naczyniowych

Obecny protokół opisuje zintegrowaną strategię badania kluczowych celów i mechanizmów Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii w oparciu o przewidywania farmakologiczne sieci i weryfikację metabolomiczną.

Sieciowa farmakologia, przewidywanie i metabolomika: walidacja mechanizmu działania Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii

Tutaj wprowadzamy metodę oceny stabilności opartą na technologii wielokrotnego rozpraszania światła, aby ocenić stabilność ekstraktów tradycyjnej medycyny chińskiej.

Wykorzystanie wielokrotnego rozpraszania światła do zbadania stabilności ekstraktów Phyllanthus emblica L. otrzymanych różnymi metodami ekstrakcji

Ten protokół szczegółowo opisuje wykorzystanie metody ekstrakcji mikrofalowej na bazie poliolu do ekstrakcji związków fenolowych i naturalnych przeciwutleniaczy, reprezentując praktyczne i przyjazne dla środowiska podejście do rozwoju gotowych do użycia ekstraktów.

Ekstrakcja mikrofalowa związków fenolowych i przeciwutleniaczy do zastosowań kosmetycznych z wykorzystaniem technologii poliolowej

Ten protokół opisuje metodę kolorymetryczną o wysokiej przepustowości, która opiera się na tworzeniu kompleksu pomiędzy jodem a łańcuchami cząsteczek glukozy w skrobi. Jod tworzy kompleksy zarówno z amylozą, jak i długimi łańcuchami w amylopektynie. Po dodaniu jodu do próbki skrobi maksymalne wchłanianie amylozy i amylopektyny następuje odpowiednio przy 620 i 550 nm. Stosunek amylozy do amylopektyny można oszacować na podstawie stosunku wartości absorbancji 620 i 550 nm i porównać je z krzywą...

Szybkie, wysokoprzepustowe oznaczanie amylozy w liofilizowanych próbkach bulw ziemniaka

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Poznaj metodę ekstrakcji i oczyszczania polifenoli z liofilizowanych jagód przy użyciu ultradźwięków i rozpuszczalników organicznych. Technika ta umożliwia badanie wpływu związków na komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro.

Ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro

Przeglądaj więcej filmów