Name: Pomiar wiązania białek z F-aktyną przez kosedymentację (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Naucz się metody kosedymentacji do badania wiązania białek z F-aktyną i pomiaru powinowactwa interakcji. Protokół wykorzystuje ultrawirówkę i analizę SDS-PAGE do ilościowego określenia siły wiązania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant HL127711 dla AVK.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Test kosedymentacji aktyny jest prostą techniką, która pozwala szybko określić, czy białko wiąże F-aktynę. Po pewnych modyfikacjach technika ta może być również używana do pomiaru powinowactwa interakcji. Oprócz punktów poruszonych w powyższym protokole, podczas projektowania, przeprowadzania i interpretacji testu należy wziąć pod uwagę następujące kwestie.
Białko będące przedmiotem zainteresowania
W teście można użyć świeżo przygotowanego lub zamrożonego białka. Jeśli stosuje się białko mrożone, zdecydowanie zaleca się porównanie wyników ze świeżym (nigdy nie mrożonym) białkiem, aby upewnić się, że zamrażanie nie wpływa na wiązanie F-aktyny.
Źródło G-aktyny
W wielu eksperymentach z granulowaniem stosuje się G-aktynę wyizolowaną z mięśni ze względu na jej względną obfitość. Istnieją trzy główne izotypy aktyny u ssaków – alfa, beta i gamma – które są niezwykle podobne (>90% identyczności sekwencji). Niemniej jednak istnieją różnice funkcjonalne między izotypami12,13. Jeśli to możliwe, izotyp G-aktyny użyty w teście wiązania powinien być zgodny z izotypem in vivo. Na przykład, jeśli testujesz białko ulegające ekspresji w mięśniach szkieletowych, alfa-aktyna jest najlepszym wyborem; W przypadku badania białka ulegającego ekspresji w fibroblastach zaleca się beta-aktynę.
Stosowanie falloidyny
Ponieważ falloidyna wiąże F-aktynę, może zakłócać lub nawet blokować wiązanie niektórych białek wiążących F-aktynę (np. falloidyna blokuje wiązanie kofiliny z włóknami aktyny)14. Dlatego falloidynę należy stosować ostrożnie, a wyniki porównać z próbkami nietraktowanymi falloidyną, jeśli to możliwe.
Wysokie tło
Nierzadko zdarza się, że białka osadzają się pod nieobecność F-aktyny (Figura 1A, brak próbek osadów F-aktyny). Jednak wysoki poziom sedymentacji tła może maskować prawdziwą kosedymentację aktyny i utrudniać, jeśli nie uniemożliwiać, określenie, czy białko wiąże F-aktynę lub zmierzenie powinowactwa interakcji. Dodanie polidikanolu do buforu reakcyjnego (krok 4.1) może znacznie zmniejszyć tło i jest łatwym rozwiązaniem. Jeśli to nie zmniejszy tła, pomocne może być dostosowanie bufora reakcyjnego, stężenia soli i/lub temperatury inkubacji.
Krzywa wiązania
Aby wygenerować krzywą wiązania, konieczne jest zmienianie stężenia białka będącego przedmiotem zainteresowania lub F-aktyny w serii reakcji. W praktyce łatwiej i lepiej jest utrzymywać F-aktynę w stałym stężeniu i zmieniać stężenie interesującego nas białka. Utrzymanie F-aktyny w ustalonym stężeniu (np . 2 μM) w teście granulowania ogranicza niespecyficzne wychwytywanie przy wyższych stężeniach F-aktyny i zapobiega depolimeryzacji przy niższych (<0,5 μM) stężeniach F-aktyny. Depolimeryzacji można zapobiec za pomocą falloidyny, chociaż wprowadza to potencjalny czynnik komplikujący do systemu (patrz krok 3.3 i powyżej). Utrzymanie F-aktyny w ustalonym stężeniu pozwala również na porównanie (i normalizację) osadu F-aktyny w różnych próbkach oraz na zidentyfikowanie nieudanych eksperymentów (tj. Gdzie osad F-aktyny jest bardzo zmienny, co uniemożliwia analizę między stężeniami). Wreszcie, utrzymanie F-aktyny w ustalonym stężeniu pozwala określić, czy wiązanie z włóknem aktyny jest kooperatywne (ryc. 1C).
Wiązanie nasycone
Podobnie jak we wszystkich eksperymentach wiązania, bardzo ważne jest, aby wiązanie z F-aktyną było nasycone i aby stężenie białka i F-aktyny utrzymywało się na stałym poziomie (ryc. 1C). Bez plateau nie jest możliwe obliczenie dokładnej stałej równowagi dysocjacji. Dlatego ważne jest, aby dokładnie zaplanować serię rozcieńczeń, która ma być badana i zawsze uwzględniać wyższe stężenia białka (tj. co najmniej 5 do 10 razy wyższe niż oczekiwana Kd).
Analiza powiązań
Aby zmierzone stałe dysocjacji były rozstrzygające, test należy przeprowadzić przy użyciu stężenia F-aktyny, które pozwala na to, aby stężenie miejsc wiązania na F-aktynie dla białka będącego przedmiotem zainteresowania było znacznie niższe niż powinowactwo. Aby sprawdzić, czy kryterium to zostało spełnione, należy oszacować stężenie miejsc wiązania od Bmax. Na przykład, jeśli [F-aktyna] wynosiła 2 μM, a Bmax = 0,5, to [miejsca wiązania] ≈ 1 μM. Kd powinien być co najmniej 5 do 10 razy większy niż [miejsca wiązania]. Jeśli zmierzone Kd jest tego samego rzędu wielkości co [miejsca wiązania], to możliwe jest, że obserwowana krzywa wiązania reprezentuje miareczkowanie miejsc wiązania o wysokim powinowactwie, a nie rzeczywistą izotermę wiązania. Jeśli zostanie to zaobserwowane, powtórz test, stosując 10-krotnie niższe stężenie F-aktyny, aby zmierzyć dokładne powinowactwo. W przypadku interakcji o wysokim powinowactwie stabilizacja falloidyny (krok 3.3) może być konieczna, aby osiągnąć stężenie F-aktyny wystarczająco niskie, aby dokładnie zmierzyć powinowactwo.
Wreszcie, istnieją podstawowe ograniczenia testu kosedymentacji, o których badacze powinni wiedzieć podczas wykonywania i oceny testu. Co najważniejsze, test kosedymentacji nie daje prawdziwej stałej równowagi. Produkty wiązania (tj. białko plus F-aktyna) są oddzielane od reagentów podczas wirowania, po czym produkty mogą następnie dysocjować, tworząc nową równowagę. W rezultacie, test kosedymentacji może błędnie obliczyć lub nie wykryć interakcji o niskim powinowactwie. Ponieważ wiele białek wiążących aktynę ma niskie (tj. mikromolowe) powinowactwo do F-aktyny, ujemny wynik (tj. brak wykrywalnego wiązania) w teście niekoniecznie oznacza, że białko nie wiąże F-aktyny. Alternatywnie, oparte na mikroskopii TIRF testy wiązania pojedynczych włókien są bardziej czułe i dokładniejsze w określaniu stałej dysocjacji (przeglądy dotyczące tej techniki znajdują się w piśmiennictwie15,16). Pomimo tych ograniczeń, test granulowania jest w zasięgu możliwości większości badaczy i jest skutecznym narzędziem do określenia, czy białko wiąże F-aktynę i do pomiaru powinowactwa interakcji.

Aktyna jest niezbędnym białkiem cytoszkieletu, które odgrywa kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w ruchliwości, skurczu, adhezji i morfologii1. Aktyna występuje w dwóch formach: monomerycznej aktyny globularnej (G-aktyna) i spolimeryzowanej aktyny nitkowatej (F-aktyna). W komórkach organizacja F-aktyny jest kontrolowana przez duży zbiór białek, które regulują zarodkowanie, wzrost, sieciowanie i demontaż włókien aktynowych2,3,4. Jednak sposób, w jaki wiele białek wiążących aktynę działa zgodnie w celu regulacji organizacji sieci aktyny, jest nadal w dużej mierze niejasne.
Pomiar oddziaływań białko-białko jest ważnym podejściem do zrozumienia, w jaki sposób białka wpływają na zachowanie komórek na poziomie biochemicznym. Do wykrywania interakcji między oczyszczonymi białkami można zastosować wiele różnych testów. Typowe podejścia do białek rozpuszczalnych obejmują pull-down, polaryzację fluorescencyjną, izotermiczną kalorymetrię miareczkowania i powierzchniowy rezonans plazmonowy. Co ważne, wszystkie te testy wymagają, aby białka były rozpuszczalne, a zatem trudno jest je przystosować do stosowania z polimerycznym, nitkowatym białkiem, takim jak F-aktyna. W tym miejscu opisujemy technikę – test kosedymentacji aktyny lub granulowania – w celu określenia, czy białko lub domena białkowa wiąże F-aktynę i zmierzenia powinowactwa interakcji.
Test granulowania aktyny jest stosunkowo prostą techniką, która nie wymaga specjalistycznego sprzętu, poza ultrawirówką. Wszystkie odczynniki można wykonać, zakładając znajomość podstaw biochemii, lub zakupić. Po ustaleniu wiązania z F-aktyną, test można użyć do pomiaru pozornego powinowactwa (tj. stałej równowagi dysocjacji)5. Ponadto, po ustaleniu powinowactwa, test granulowania jest użytecznym narzędziem do mierzenia, w jaki sposób zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania (tj. modyfikacje potranslacyjne, mutacje lub wiązanie ligandów) wpływają na jego interakcję z F-aktyną6. Technika ta ma ograniczenia (patrz Dyskusja), o których badacz powinien wiedzieć przed przystąpieniem do testu.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Mikroultrawirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 Rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Probówki ultrawirówkowe - 0,2 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr>Aktyna, <td>cytoszkielet</td><td>mięśni szkieletowych królika</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Faloidyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(&beta;-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey CLx</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Niebieski barwnik R-250</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia koloidalnego niebieskiego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wiązania białek z f-aktyną przez kosedymentację

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Organizacja aktyny nitkowatej (F-aktyny) w komórkach jest regulowana przez dużą liczbę białek wiążących aktynę, które kontrolują zarodkowanie, wzrost, sieciowanie i/lub rozkład aktyny. Protokół ten opisuje technikę – test kosedymentacji aktyny lub granulowania – w celu określenia, czy białko lub domena białkowa wiąże F-aktynę i zmierzenia powinowactwa interakcji (tj. stałej równowagi dysocjacji). W tej technice białko będące przedmiotem zainteresowania jest najpierw inkubowane z F-aktyną w roztworze. Następnie wirowanie różnicowe jest stosowane do sedymentacji włókien aktynowych, a granulowany materiał jest analizowany przez SDS-PAGE. Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże F-aktynę, będzie współosadzać się z włóknami aktyny. Produkty reakcji wiązania (tj. F-aktyna i białko będące przedmiotem zainteresowania) można określić ilościowo w celu określenia powinowactwa interakcji. Test granulowania aktyny jest prostą techniką określania, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże F-aktynę i oceny, w jaki sposób zmiany w tym białku, takie jak wiązanie ligandów, wpływają na jego interakcję z F-aktyną.

Zbadaliśmy wiązanie homodimeru αE-kateniny z F-aktyną w teście kowyprecypitacji (co-sedimentation assay). Ponieważ wcześniejsze eksperymenty wykazały, że powinowactwo homodimeru αE-kateniny do F-aktyny wynosi około 1 µM, a Bmax blisko 111, test przeprowadzono przy niskim stężeniu F-aktyny (0,2 µM zamiast 2 µM; patrz sekcja Dyskusja). Ponieważ 0,2 µM znajduje się poniżej stężenia krytycznego, dodano faloidynę w celu stabilizacji F-aktyny spolimeryzowanej z G-aktyny mięśni szkieletowych królika (krok 3.3). Rosnące stężenia homodimeru αE-kateniny (0,125-12,0 µM) inkubowano w obecności lub w nieobecności 0,2 µM F-aktyny. Próbki odwirowano, a otrzymane osady poddano analizie (Rycina 1A). Zgodnie z oczekiwaniami, homodimer αE-kateniny kowyprecypitował z F-aktyną powyżej poziomu tła (Rycina 1A, porównując próbki osadu z F-aktyną do próbek osadu bez F-aktyny). BSA zastosowano jako kontrolę negatywną (Rycina 1B). Ilość związanego białka oznaczono i wykreślono w funkcji ilości białka wolnego, aby obliczyć powinowactwo oddziaływania (Rycina 1C). Wykreślone dane najlepiej pasowały do równania Hilla. Obliczona wartość Kd wyniosła 2,9 µM, Bmax wyniosła 0,2, a współczynnik Hilla (h) wyniósł 4,8. Zatem homodimer αE-kateniny wiąże F-aktynę kooperacyjnie z niskim mikromolarnym powinowactwem, co jest zgodne z poprzednimi badaniami (Kd wynosząca 2,9 µM w porównaniu do ~1,0 µM)11.
<img alt="Analiza wiązania F-aktyny, wyniki SDS-PAGE, wykres KD, analiza oddziaływań homodimeru αE-kateiny." src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Szybki test współsedymentacji F-aktyny. (A) Rosnące stężenia (0,125-12,0 µM) homodimeru αE-kateiny inkubowano z (panele lewe) lub bez (panele prawe) 0,2 µM F-aktyny stabilizowanej faloidyną. Inkubację prowadzono przez 30 min w RT, a następnie próbki odwirowano. Materiał całkowity (7,5% materiału wyjściowego) oraz osad (50% osadu) rozdzielono metodą SDS-PAGE i barwiono barwnikiem Coomassie. (B) W качестве kontroli negatywnej wykorzystano 4 µM BSA. Próbki całkowite oraz osady, z (+) lub bez (-) F-aktyny, rozdzielono metodą SDS-PAGE i barwiono barwnikiem Coomassie. (C) Ilość związanej αE-kateiny (µM/µM aktyny) z punktu A naniesiono na wykres w funkcji wolnej αE-kateiny (µM), a dane dopasowano do równania Hilla (czerwona linia). Podano wartości Kd, Bmax oraz współczynnik Hilla (h). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu wirowania z analizą stężenia białek, wykresem intensywności i próbkami osadu." src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilościowe oznaczanie osadzania aktyny – schemat blokowy. Ten schemat przedstawia kluczowe kroki opisane w sekcji 5, wraz z przykładami próbek całkowitych (Total) i osadów (Pellet) (A, C-E) oraz krzywej wzorcowej (B) wykorzystywanej do ilościowego oznaczania. Kroki 5.13: 1) Pomiar ilości białka docelowego w próbkach całkowitych (A). 2) Wyznaczenie krzywej wzorcowej poprzez naniesienie intensywności prążka w funkcji masy białka (B). 3) Pomiar ilości białka docelowego, które współosadzało się z F-aktyną (C). 4) Pomiar ilości białka docelowego, które osadziło się w obecności F-aktyny (D). 5) Odjęcie wartości D od C w celu określenia ilości białka związanego z F-aktyną. 6) Pomiar ilości F-aktyny w każdym osadzie (E), obliczenie średniej ilości F-aktyny na próbkę i podzielenie każdej próbki przez tę średnią (liczby poniżej przedstawiają stosunek). 7) Dla każdej próbki podzielenie ilości białka związanego (obliczonej w kroku 5) przez stosunek osadu F-aktyny (obliczony w kroku 6) w celu skorygowania różnic w osadzie. 8) Wykorzystanie krzywej wzorcowej (B) do obliczenia ilości (masy) znormalizowanego białka związanego w każdej próbce (krok 7). 9) Wyznaczenie stężenia białka wolnego i białka związanego w celu stworzenia krzywej wiązania. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje metodę testowania zdolności białka do współosadzania z nitkowatą aktyną (F-aktyną) i, jeśli zaobserwowano wiązanie, do pomiaru powinowactwa interakcji.

Pomiar wiązania białek z F-aktyną przez kosedymentację

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Ogólnym celem tej techniki jest zbadanie zdolności białka do współosadzania z aktyną filamentową oraz, w przypadku zaobserwowania wiązania, zmierzenie powinowactwa tej interakcji. Metoda ta jest prostym sposobem na ustalenie, czy białko wiąże F-aktynę. Zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu poza ultrawirówką, a wszystkie odczynniki można przygotować samodzielnie lub zakupić.Na początek należy przygotować białko o wysokiej czystości zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Stężenie białka należy określić, mierząc absorbancję przy 280 nanometrach. Bezpośrednio przed użyciem białko należy poddać wirowaniu z wysoką prędkością w celu usunięcia agregatów nierozpuszczalnego białka.Jeśli istnieje problem z rozpuszczalnością, należy ponownie zmierzyć stężenie białka po wirowaniu. Następnie należy wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80°C alikwot aktyny globularnej (g-aktyny) i szybko go rozmrozić. Do G-aktyny należy dodać 10X bufor polimeryzacyjny i rozcieńczyć wodą do końcowego stężenia 1X.Mieszaninę inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić polimeryzację aktyny. Po polimeryzacji spolimeryzowaną aktynę filamentową, czyli F-actin, przechowywać w roztworze w temperaturze 4 °C, gdzie pozostanie stabilna przez kilka tygodni. Przed użyciem F-actin po przechowywaniu, delikatnie odwrócić lub potrząsnąć probówką kilka razy, aby upewnić się, że cała aktyna jest rozpuszczona i równomiernie rozprowadzona w roztworze.Potwierdź wiązanie badanego białka z F-aktyną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po potwierdzeniu wiązania z F-aktyną, wykonaj rozcieńczenia seryjne białka, aby przygotować serię stężeń obejmującą od siedmiu do ośmiu próbek, z dwukrotnością końcowego stężenia, które ma zostać przetestowane. Na przykład, jeśli zakres testowy wynosi od 0,1 do 8 µM, przygotuj w probówkach do wirówki rozcieńczenia białka o stężeniach 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 oraz 0,2 µM w 1X buforze reakcyjnym.Rozcieńczyć badane białko do stężenia końcowego w buforze reakcyjnym 1X w probówkach do ultrawirówki. Do odpowiednich próbek dodać F-aktynę. Następnie inkubować wszystkie próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po 30 minutach należy pobrać jedną piątą każdej próbki i wymieszać z buforem do próbek. Stanowią one próbki całkowite. Należy umieścić probówki do ultrawirówki w rotorze i wirować przez 20 minut przy 100 000 ×g i temperaturze 4 °C.Po wirowaniu należy usunąć trzy czwarte supernatantu z każdej probówki i wymieszać go z buforem do próbek 4X w osobnej probówce do wirówki mikrocentryfugowej. Są to próbki supernatantu. Pozostały supernatant należy usunąć za pomocą końcówki do nakładania próbek na żel, dbając o to, aby nie naruszyć osadu.Następnie dodaj do wszystkich probówek bufor do próbek 1X i inkubuj przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przeprowadź triturację próbki od ośmiu do dziesięciu razy za pomocą końcówki pipety p200, stale przemywając obszar osadu w probówce. Podczas trituracji delikatnie pocieraj końcówką pipety miejsce występowania osadu, aby ułatwić resuspensję.Przenieś resuspenderowane białko do probówki do wirówki mikrocentryfużowej. Są to próbki osadu. Na koniec przeanalizuj próbki całkowite oraz osadu za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.Wykonaj obrazowanie żeli barwionych błękitem Coomassie za pomocą systemu obrazowania, który mierzy intensywność prążków białkowych w szerokim i liniowym zakresie. Rosnące stężenia homodimeru alpha e catenin inkubowano w obecności lub w nieobecności 0,2 micromolar F-actin. Próbki odwirowano, a otrzymane osady poddano analizie.Zgodnie z oczekiwaniami, homodimer alpha e catenin osadzał się wspólnie z F-aktyną powyżej poziomu tła. W ramach kontroli negatywnej wykorzystano BSA. Ilość związanego białka została zmierzona i wykreślona w funkcji ilości wolnego białka, aby obliczyć powinowactwo oddziaływania.Tę technikę można przeprowadzić w cztery godziny lub krócej, jeśli F-aktyna jest już spolimeryzowana. Podczas wykonywania tej procedury kluczowe jest szybkie usunięcie supernatantu po wirowaniu oraz całkowite ponowne zawieszenie osadu. Jak w przypadku wszystkich eksperymentów z wiązaniem, krytyczne jest, aby wiązanie z F-aktyną było nasycone, a poziom czystości wraz z F-aktyną osiągnął plateau; bez plateau nie jest możliwe obliczenie dokładnej stałej równowagi asocjacji.Istnieją fundamentalne ograniczenia testu współsedymentacji, o których badacze powinni wiedzieć; najważniejszym z nich jest to, że metoda ta nie pozwala na wyznaczenie rzeczywistej stałej równowagi, a w konsekwencji może prowadzić do błędnych obliczeń lub braku wykrycia oddziaływań o niskim powinowactwie. Pomimo tych ograniczeń, test współsedymentacji jest przystępnym i skutecznym narzędziem do określenia, czy białko wiąże F-aktynę, oraz do pomiaru powinowactwa tego oddziaływania.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.

Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Stosujemy analizę oddziaływań białkowych bez użycia znaczników z wykorzystaniem systemu Biacore X100 do analizy struktura-funkcja wiązania kilku mutantów cystatyny B z papainą poprzez charakterystykę kinetyczną. Analiza stężenia bez kalibracji (CFCA) pozwala zmierzyć stężenie białka zachowującego aktywność wiązania bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. Wykazujemy, że potwierdzenie stężeń za pomocą CFCA zwiększa wiarygodność analizy kinetycznej oraz że stałe kinetyczne można rzetelnie...

Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla wyznaczania kinetyki i powinowactwa w analizie zależności struktura-funkcja

W tym filmie opisujemy technikę anizotropii fluorescencji do badania interakcji między białkiem zespołu Shwachmana-Diamonda (SBDS) oznaczonym fluoroforem a czynnikiem wydłużenia 1 GTPazą (EFL1). Podczas inkubacji białek SBDS ze stopniowo rosnącymi stężeniami EFL1 obserwuje się stały wzrost anizotropii, co wskazuje na udaną interakcję między tymi dwoma białkami.

Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

Polimeryzacja FtsZ jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. W tym raporcie szczegółowo opisujemy proste protokoły monitorowania aktywności polimeryzacji FtsZ i omawiamy wpływ składu buforu. Protokoły mogą być wykorzystywane do badania interakcji FtsZ z białkami regulatorowymi lub lekami przeciwbakteryjnymi, które wpływają na polimeryzację FtsZ.

Testy polimeryzacji FtsZ: proste protokoły i rozważania

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Niniejszy protokół opisuje regulowalny test ruchomości koralików z ogonami z aktyny w celu ilościowego zbadania, w jaki sposób aktywność motorów miozynowych wpływa na montaż rozgałęzionej aktyny oraz architekturę sieci na interfejsie przypominającym błonę.

Rekonstytucja rozgałęzionego montażu aktyny pośredniczonego przez miozynę I w kroplkowym teście ruchliwości ogonów kometowych aktyny

Naucz się metody kosedymentacji do badania wiązania białek z F-aktyną i pomiaru powinowactwa interakcji. Protokół wykorzystuje ultrawirówkę i analizę SDS-PAGE do ilościowego określenia siły wiązania.

Pomiar wiązania białek z F-aktyną przez kosedymentację

Przeglądaj więcej filmów