Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie zapisów cęgów napięcia całej komórki z pojedynczej komórki fotoreceptorowej w celu zmierzenia prądów indukowanych światłem powstających w wyniku absorpcji pojedynczych fotonów i powtarzających się reakcji na intensywne światło. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych zagadnień związanych z dziedziną transdukcji sensorycznej, takich jak transdukcja wzrokowa zarówno dla fizycznych, jak i jonowych mechanizmów, które leżą u podstaw fototransdukcji oraz właściwości kanałów TRP. Do zalet stosowania tej techniki należy pełna kontrola napięcia membrany i niezwykle wysoki stosunek sygnału do szumu oraz możliwość wprowadzenia specyficznych wskaźników do pomiarów optycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą zmagać się z niewielkim rozmiarem preparatu i koniecznością szybkiego przeprowadzenia sekcji ze względu na podatność metaboliczną w czasie. W tej procedurze hoduj muchy o gęstości około 20 na fiolkę. W czasie eksperymentu należy mieć kilka fiolek z poczwarkami, które mają zostać zamknięte i znajdowały się w ciągłej ciemności przez co najmniej 24 godziny.

Dwie godziny przed zabraniem dorosłych osób należy usunąć wszystkie zamknięte osoby dorosłe. Zawsze obchodź się z ciemnymi muchami w chusteczkach przy czerwonym oświetleniu. Czekając na świeżo zamknięte muchy, przygotuj komorę nagraniową.

Na dnie komory przymocuj szkiełko nakrywkowe za pomocą stopionej parafiny lub wysokopróżniowego smaru silikonowego, aby zakończyć kąpiel. Następnie zamontuj wannę do stopnia mikroskopu odwróconego. W wannie umieść rurkę systemu perfuzji, rurkę systemu ssącego i przewód uziemiający do konfiguracji elektrofizjologii.

Przed rozpoczęciem sekcji przygotuj kilka roztworów na odwrocie 60-milimetrowej szalki Petriego. Zdeponuj cztery oddzielne krople bezwapniowego ES i jedną kroplę TS. Teraz za pomocą szorstkiej pęsety złap muchę, która niedawno zamknęła się za skrzydła lub ciało. Następnie za pomocą cienkiej pęsety odczep głowę i szybko przenieś głowę do pierwszej kropli bezwapniowego ES. Pod stereoskopem przeciąć głowę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej za pomocą drugiej pary cienkich pęset.

Upewnij się, że oba oczy pozostają nienaruszone. Teraz przenieś 1/2 głowy do drugiej kropli ES bez wapnia, a drugą połowę głowy do trzeciej kropli ES bez wapnia. Następnie przystąp do sekcji jednego z dwojga oczu.

Za pomocą cienkiej pęsety usuń jak najwięcej tkanki otaczającej oko, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia siatkówki. Następnie mocno chwyć krawędź rogówki delikatną pęsetą i wyjmij siatkówkę. Rezultatem powinna być pusta, nienaruszona rogówka oddzielona od nienaruszonej siatkówki.

Pipety są przechowywane w etanolu, dlatego w przypadku korzystania z nowej pipety do trójki należy ją zawsze najpierw przepłukać wodą. Teraz napełnij przepłukaną pipetę niewielką objętością bezwapniowego ES z czwartej kropli. Następnie, za pomocą delikatnego zasysania jamy ustnej, wciągnij izolowaną siatkówkę do pipety.

Należy zachować szczególną ostrożność w celu uwięzienia pęcherzyków powietrza. Następnie umieść siatkówkę w kropli TS. Następnie powtórz izolację siatkówki na drugim oku, tak aby obie znalazły się teraz w kropli TS. Następnie delikatnie zetrzyj tylko bezwapniowy ES z szalki Petriego i dodaj sześć kolejnych kropli TS na powierzchnię szalki.

Przenieś obie siatkówki do nowych kropli TS. Następnie wymień pipetę do rozcierania na taką, która ma otwór o małej średnicy. Po wypłukaniu napełnij pipetę kroplą TS. Za pomocą tej pipety szybko i wielokrotnie odsysaj i wydychaj obie siatkówki, aby oddzielić niektóre ommatydia od komórek pigmentowych. TS zachmurzy się, gdy to się stanie.

Następnie przenieś resztki obu siatkówk do kolejnej kropli TS. Następnie naładować pipetę mętną kroplą TS zawierającą wyizolowaną ommatidia. Wlać roztwór do komory kąpieli. Powtórz tę procedurę z pipetami do zmniejszania średnicy o mniejszej średnicy, aż do całkowitego rozpuszczenia siatkówki.

Teraz poczekaj chwilę. Podczas tej przerwy izolowane ommatidia zwiążą się z dnem komory. Po minucie zacznij płynąć ES zawierający 1,5 milimolowy wapń za pomocą systemu perfuzyjnego.

Gdy komora jest napełniona, upewnij się, że przewód uziemiający i rura ssąca są zanurzone. Pozwól roztworowi płynąć przez 60 do 90 sekund przed kontynuowaniem. Na początek użyj obiektywu 40x, aby dokładnie sprawdzić ommatidia w wannie.

Zauważ, że wydłużone ciała komórek fotoreceptorów tworzące ommatidium są oderwane od swoich aksonów, ale pozostają żywotne. Teraz wybierz odpowiednie ommatidium do eksperymentu. Wybierz, gdy spełnia następujące kryteria.

Membrana zewnętrzna musi być gładka i nienaruszona. Oś długa musi być prawie pod kątem prostym w stosunku do podejścia elektrody od strony dystalnej. A ommatidium nie powinno być otoczone nadmiarem tkanki.

Po wybraniu wyśrodkuj ommatidium w polu widzenia. Teraz napełnij pipetę odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym do eksperymentu. I zaokrąglij pipetę do uchwytu elektrody.

Następnie dmuchnij w rurkę pipety, aby wytworzyć dodatnie ciśnienie i zablokuj ciśnienie, zamykając zawór probówki. Następnie włóż pipetę do komory kąpielowej i poprowadź ją blisko dystalnej części ommatidium, aż do zaobserwowania niewielkiego wgłębienia w membranie, co jest spowodowane dodatnim ciśnieniem z załatanej pipety. Teraz otwórz moduł testowy membrany w oprogramowaniu rejestrującym, aby zastosować ciągłe impulsy napięcia kwadratowego o wartości dwóch miliwoltów z częstotliwością 100 herców.

Następnie, korzystając ze sterowników wzmacniacza patch clamp, ustaw potencjał złącza na zero, aby ustawić podstawę impulsu kwadratowego na prąd zerowy. Następnie otwórz zawór, aby uwolnić ciśnienie w pipecie i delikatnie zassać, aby wytworzyć podciśnienie. Pipetę należy następnie przymocować do błony komórkowej.

Gdy to nastąpi, zamknij zawór, aby zablokować ciśnienie. Teraz sprawdź rezystancję elektrody. Powinien być podniesiony do zakresu od 100 do 150 megaomów.

Następnie zwolnij podciśnienie w pipecie, ponownie otwierając zawór. Rezystancja powinna teraz wzrosnąć do wartości od jednego do dwóch gigaomów, co oznacza, że między pipetą a kuwetą utworzyło się C. Następnie, za pomocą wzmacniacza patch clamp, zrównoważ prąd pojemnościowy pipety.

Aby uzyskać konfigurację całej komórki, przerwij błonę komórkową za pomocą aspiracji ustnej. Wytwarzaj szybkie, krótkie, silne napady podciśnienia w elektrodzie. Po uzyskaniu konfiguracji całego ogniwa nastąpi nagły wzrost pojemności.

Następnie za pomocą wzmacniacza patch clampowego ustaw potencjał podtrzymania na wymagane napięcie i zrównoważ prądy pojemnościowe w rezystancji szeregowej. Teraz zamknij czarną francuską kurtynę klatki Faradaya i rozpocznij eksperyment. Po uzyskaniu konfiguracji całej komórki za pomocą pipety z plastrem zawierającej barwnik fluorescencyjny, Lucyfer żółty, można zauważyć, że tylko jeden z fotoreceptorów tworzących ommatidium został załadowany barwnikiem.

Ten fotoreceptor będzie również elektrycznie odizolowany od swoich sąsiadów w ommatidium. Ommatidia z zaciśniętym napięciem w całych komórkach od much typu dzikiego i much z mutacjami w genach InaC lub InaD wykazywały guzy kwantowe w odpowiedzi na ciągłe słabe światło. U obu mutantów zaobserwowano powolne wygaszanie guzków w porównaniu z muchami typu dzikiego.

Znormalizowane reakcje na 500-milisekundowe impulsy świetlne dostarczane z prędkością 150 000 fotonów na sekundę, zgrabnie ilustrują zmienione fizjologie. Korzystając z tego preparatu, udało się nawet zmierzyć reakcje guzków kwantowych z zaciśniętym napięciem całego ogniwa na krótkie światło o milisekundowym słabym świetle. Takie odpowiedzi pojedynczych fotonów porównano u much z mutacją typu dzikiego i zmutowaną ninaC.

Oba mutanty odpowiedziały serią uderzeń. Znormalizowane reakcje na 500-milisekundowy impuls świetlny dostarczony z prędkością 15 000 fotonów na sekundę. Tak więc powolne zakończenie odpowiedzi makroskopowej obserwuje się w mutantach arrestin-2 i ninaC.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć nagrania całych komórek z komórek fotoreceptorowych Drosophila. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Technika ta utorowała naukowcom drogę do lepszego zrozumienia kanałów TRP i sygnalizacji lipidowej inozytolu, a także roli wewnętrznie światłoczułych komórek zwojowych siatkówki występujących u ssaków, które są zaangażowane w czynności zależne od światła nietworzące obrazu.