Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie rejestracji metodą clampowania napięcia z całej komórki (whole-cell voltage clamp) z pojedynczej komórki fotoreceptora w celu pomiaru prądów indukowanych światłem, powstających w wyniku absorpcji pojedynczych fotonów oraz powtarzalnych odpowiedzi na intensywne światło. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych zagadnień z zakresu transdukcji sensorycznej, takich jak transdukcja wzrokowa w odniesieniu do mechanizmów fizycznych i jonowych leżących u podstaw fototransdukcji oraz właściwości kanałów TRP. Zalety zastosowania tej techniki obejmują pełną kontrolę nad napięciem błony, niezwykle wysoki stosunek sygnału do szumu oraz możliwość wprowadzania specyficznych wskaźników do pomiarów optycznych.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą miały trudności z niewielkim rozmiarem preparatu oraz koniecznością szybkiego przeprowadzenia sekcji ze względu na czasową podatność metaboliczną. W przypadku tej procedury należy hodować muchy w zagęszczeniu około 20 osobników na fiolkę. W momencie przeprowadzania eksperymentu należy przygotować kilka fiolek z poczwarkami, które są bliskie zamknięcia i przebywały w całkowitej ciemności przez co najmniej 24 godziny.

Na dwie godziny przed zbieraniem osobników dorosłych, usuń wszystkie muchy, które już się wykluły. Zawsze obchodź się z muchami zaadaptowanymi do ciemności w tkankach pod oświetleniem czerwonym. Oczekując na świeżo wyklute muchy, przygotuj komorę rejestracyjną.

Do dna komory przymocuj szkiełko nakrywkowe, używając roztopionej parafiny lub wysokopróżniowego smaru silikonowego, aby zamknąć wannę. Następnie zamocuj wannę na stoliku mikroskopu odwróconego. Do wnętrza wanny wprowadź rurkę systemu perfuzyjnego, rurkę systemu ssącego oraz przewód uziemiający dla zestawu do elektrofizjologii.

Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować roztwory na odwrotnej stronie płytki Petriego o średnicy 60 mm. Nanieść cztery oddzielne krople medium ES bez wapnia oraz jedną kroplę medium TS. Następnie, używając pęsety o szerokich końcach, chwycić za skrzydła lub ciało muchy, która niedawno przeszła proces eklozji. Następnie za pomocą pęsety precyzyjnej oddzielić głowę i szybko przenieść ją do pierwszej kropli medium ES bez wapnia. Pod stereomikroskopem przekroić głowę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, używając drugiej pęsety precyzyjnej.

Upewnij się, że oba oczy pozostały nienaruszone. Następnie przenieś 1/2 głowy do drugiej kropli ES bez wapnia, a pozostałą część głowy do trzeciej kropli ES bez wapnia. Następnie przystąp do wypreparowania jednego z dwóch oczu.

Używając precyzyjnej pęsety, usuń jak największą ilość tkanki otaczającej oko, aby upewnić się, że siatkówka nie została uszkodzona. Następnie mocno uchwyć krawędź rogówki precyzyjną pęsetą i wydobądź siatkówkę. Wynikiem powinna być pusta, nienaruszona rogówka oddzielona od nienaruszonej siatkówki.

Pipety są przechowywane w etanolu, dlatego przy użyciu nowej pipety do tryturacji należy ją najpierw zawsze wypłukać wodą. Następnie wypełnij wypłukaną pipetę niewielką objętością ES wolnego od wapnia, zaczynając od czwartej kropli. Po tym, delikatnie zasysając powietrze ustami, wciągnij wyizolowaną siatkówkę do pipety.

Z najwyższą ostrożnością należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza. Następnie siatkówkę należy przenieść do kropli TS. Kolejnie powtórzyć izolację siatkówki z drugiego oka, tak aby oba narządy znajdowały się w kropli TS. Następnie delikatnie usunąć z płytki Petriego wyłącznie bezwapniowe ES i dodać na powierzchnię płytki sześć kolejnych kropli TS.

Przenieś obie siatkówki do nowych kropel TS. Następnie zastąp pipetę do trituracji taką, która ma otwór o małej średnicy. Po wypłukaniu napełnij pipetę kroplą TS. Używając tej pipety, szybko i wielokrotnie aspiruj i wydmuchuj obie siatkówki, aby oddzielić część ommatidiów od komórek pigmentowych. W trakcie tego procesu roztwór TS zmętnieje.

Następnie przenieś pozostałości obu siatkówek do kolejnej kropli TS. Potem nabierz do pipety mętną kroplę TS zawierającą wyizolowane ommatidia. Wypuść roztwór do komory kąpielowej. Powtarzaj tę procedurę, używając pipet do tryturacji o coraz mniejszej średnicy, aż siatkówka zostanie całkowicie rozpuszczona.

Teraz odczekaj minutę. Podczas tej przerwy odizolowane ommatidia przywrą do dna komory. Po upływie minuty rozpocznij przepływ ES zawierającego 1,5 mM wapnia za pomocą systemu perfuzyjnego.

Podczas napełniania komory należy upewnić się, że przewód uziemiający oraz rura ssawna są zanurzone. Pozostaw roztwór w przepływie przez 60 do 90 sekund przed kontynuowaniem procedury. Aby rozpocząć, użyj obiektywu 40x, aby dokładnie obejrzeć ommatidia w kąpieli.

Zauważcie, że wydłużone ciała komórek fotoreceptorów tworzące ommatidium są oddzielone od swoich aksonów, ale pozostają żywe. Teraz wybierzcie odpowiednie ommatidium do eksperymentu. Wybierzcie je, gdy spełnia następujące kryteria.

Błona zewnętrzna musi być gładka i nienaruszona. Długa oś musi znajdować się niemal pod kątem prostym względem podejścia elektrody od strony dystalnej. Ommatydium nie powinno być otoczone żadną nadmiarową tkanką.

Po wybraniu odpowiedniego ommatydium należy ustawić je w centrum pola widzenia. Następnie wypełnić pipetę odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym do przeprowadzenia eksperymentu i przymocować pipetę do uchwytu elektrody.

Następnie należy dmuchnąć do rurki pipety, aby wytworzyć nadciśnienie, a następnie zablokować je, zamykając zawór rurki. Dalej należy wprowadzić pipetę do komory kąpielowej i prowadzić ją w kierunku dystalnej części ommatidium, aż do momentu zaobserwowania w błonie niewielkiego wgłębienia, spowodowanego nadciśnieniem z pipety w miejscu styku. Teraz należy otworzyć moduł testowania błony w oprogramowaniu rejestrującym, aby przyłożyć ciągłe prostokątne impulsy napięcia o wartości 2 mV z częstotliwością 100 Hz.

Następnie, korzystając z elementów sterujących wzmacniacza patch clamp, ustaw potencjał złącza na zero, aby zredukować prąd podstawowy impulsu prostokątnego do zera. Następnie otwórz zawór, aby zwolnić ciśnienie w pipecie i ostrożnie aspiruj, tworząc podciśnienie. Pipeta powinna wówczas przylgnąć do błony komórkowej.

Gdy to nastąpi, zamknij zawór, aby utrzymać ciśnienie. Teraz sprawdź oporność elektrody. Powinna ona wzrosnąć do poziomu między 100 a 150 megaohms.

Następnie zwolnij podciśnienie w pipecie, ponownie otwierając zawór. Opór powinien teraz gwałtownie wzrosnąć do wartości między jednym a dwoma gigaohmom, co wskazuje na utworzenie kontaktu typu C pomiędzy pipetą a komórką. Następnie, korzystając z wzmacniacza patch-clamp, zrób offset prądu pojemnościowego pipety.

Aby uzyskać konfigurację whole-cell, należy przerwać błonę komórkową poprzez aspirację ustną. Należy wytworzyć szybkie, krótkie i silne impulsy podciśnienia w elektrodzie. Po uzyskaniu konfiguracji whole-cell nastąpi gwałtowny wzrost pojemności.

Następnie, używając wzmacniacza patch-clamp, ustaw potencjał podtrzymujący na wymagane napięcie i skompensuj prądy pojemnościowe oraz oporność szeregową. Teraz zamknij czarną zasłonę klatki Faradaya i rozpocznij eksperyment. Po uzyskaniu konfiguracji whole-cell za pomocą pipety patch zawierającej barwnik fluorescencyjny, Lucifer yellow, można zauważyć, że tylko jeden z fotoreceptorów tworzących ommatidium został załadowany barwnikiem.

Ten fotoreceptor zostanie również odizolowany elektrycznie od sąsiednich komórek w ommatidium. Ommatidia z clampingiem napięcia całej komórki u much typu dzikiego oraz u much z mutacjami w genach InaC lub InaD wykazały skoki kwantowe w odpowiedzi na ciągłe słabe światło. U obu mutantów zaobserwowano wolniejszą terminację skoków w porównaniu do much typu dzikiego.

Znormalizowane odpowiedzi na 500 milisekundowe impulsy świetlne dostarczane z natężeniem 150 000 fotonów na sekundę przejrzyście ilustrują zmienioną fizjologię. Z wykorzystaniem tej preparacji możliwe było nawet zmierzenie odpowiedzi typu „quantum bump” w konfiguracji clampowania napięcia całego komórki na krótkie, jednosekundowe przebłyski słabego światła. Takie odpowiedzi na pojedyncze fotony porównano u much dzikich, mutantów arrestyny oraz mutantów ninaC.

Oba mutanty odpowiedziały serią wypukłości. Znormalizowane odpowiedzi na 500 milisekundowy impuls światła dostarczony z natężeniem 15 000 fotonów na sekundę. Zatem powolna terminacja odpowiedzi makroskopowej jest obserwowana u mutantów arrestin-2 oraz ninaC.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać rejestrację całokomórkową z komórek fotoreceptorów Drosophila. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje jedną godzinę. Technika ta utorowała drogę badaczom do lepszego zrozumienia kanałów TRP i sygnalizacji lipidów inozytolowych, a także roli wewnętrznie światłoczułych zwojowych komórek siatkówki występujących u ssaków, które biorą udział w aktywnościach zależnych od światła, nietworzących obrazu.