Name: Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologiczną całokomórkowych zapisów cęgów napięcia w fotoreceptorach Drosophila melanogaster. Technika umożliwia pomiar prądów światłowrażliwych i badanie mechanizmów fototransdukcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymentalna część tych badań była wspierana przez granty z amerykańsko-izraelskiej Bi National Science Foundation (dla B.M. i I.L.), Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (do B.M.) oraz Rady ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (numery grantów BBSRC: BB/M007006/1 i BB/D007585/1) dla R.C.H.

<ol><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/245/1314/203">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calphotin%3A+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+and+Ca2%2B+buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15694324">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li>
<li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Lond%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li>
<li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li>
<li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li>
<li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li>
<li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/252/1335/223">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li>
<li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li>
<li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10747191">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li>
<li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li>
<li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://elsc.huji.ac.il/minke/publications/excess-g%16betae%13-over-g%16qalphae%13-%10-vivo%11-prevents-dark-spontaneous-activity-%10droso">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li>
<li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein%2C+phospholipase+C%2C+and+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li>
<li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels%2C+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17234592">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li>
<li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18786361">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li>
<li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23066080">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00709805">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9003779">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li>
<li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li>
<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+transform+glucose+to+alanine%2C+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
<li>Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+block+by+Ca2%2B+underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie zapisów z całych komórek do fotoreceptorów D. melanogaster pozwoliło na odkrycie i funkcjonalne wyjaśnienie nowych białek sygnałowych, takich jak kanały TRP 27,28,29 i białko rusztowania INAD 30,31,32. Od czasu pierwszego wprowadzenia tej techniki, umożliwiła ona rozwiązanie długoterminowych podstawowych pytań dotyczących mechanizmu jonowego i zależności napięciowej odpowiedzi świetlnej. Stało się tak ze względu na przyznaną zdolność do dokładnej kontroli napięcia błony oraz zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego składu jonowego19,28.
Główną przeszkodą w technice zaciskania plastrów u D. melanogaster była kruchość izolowanego preparatu ommatidia. Szczegółowe badania wykazały, że integralność maszyn fototransdukcyjnych krytycznie zależy od ciągłego dostarczania ATP, zwłaszcza podczas ekspozycji na światło, co prowadzi do dużego zużycia ATP. Niestety, mechaniczne paskowanie komórek barwnikowych (tj. glejowych), które jest wymagane, aby dotrzeć do błony fotoreceptora za pomocą pipety z plastrem, eliminuje główne źródło metabolitów niezbędnych do produkcji ATP33. Zastosowanie egzogennego ATP do pipety rejestrującej tylko częściowo spełnia wymagania dotyczące dużych ilości ATP. Niedobór ATP prowadzi do spontanicznej aktywacji kanałów TRP i do dysocjacji maszynerii fototransdukcji od kanałów aktywowanych światłem, powodując duży wzrost komórkowego Ca2+ i zniesienie normalnej odpowiedzi na światło34,35. Ta sekwencja zdarzeń nie jest spowodowana uszkodzeniem fotoreceptorów przez procedurę sekcji, ale raczej zubożeniem komórek ATP. Aby zapobiec wystąpieniu tej sekwencji zdarzeń i utrzymać normalne reakcje świetlne, fotoreceptory nie powinny być wystawiane na intensywne światło, które zużywa duże ilości ATP. Ponadto, NAD musi być włączony do pipety rejestrującej, przypuszczalnie w celu ułatwienia produkcji ATP w mitochondriach18,36. W przypadku pomiarów spontanicznych i kwantowych wybrzuszeń powyższa trudność jest minimalna, ponieważ używane są tylko słabe światła. W praktyce stabilny zapis całej komórki może być utrzymany przez ~20-25 minut, chociaż istnieje tendencja do spowolnienia kinetyki odpowiedzi w tym okresie. Pojedynczy preparat zdysocjowanej ommatydii może zachować żywotność do 2 godzin.
Dodatkowym mankamentem izolowanego preparatu ommatidia jest niedostępność mikrokosmków, co przekłada się na brak dostępu kanałów TRP i TRPL do pipety rejestrującej, uniemożliwiając zapisy jednokanałowe. Korzystając z opracowanej przez siebie metody, Bacigalupo i jego współpracownikom udało się bezpośrednio zarejestrować jednokanałową aktywność rabdomeru37. Jednak ta aktywność kanału różni się od aktywności kanałów TRPL heterologicznie wyrażanych w komórkach hodowli tkankowej38 oraz od aktywności kanału TRP wynikającej z analizy szumu strzału uzyskanej z izolowanej ommatydii34. Przypuszczalnie procedura preparacji znacznie uszkodziła komórki fotoreceptorów podczas stosowania tej metody.

Szeroko zakrojone badania genetyczne muszki owocowej, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), rozpoczęte ponad 100 lat temu, ustaliły, że mucha D. melanogaster jest niezwykle użytecznym modelem eksperymentalnym do genetycznej analizy złożonych procesów biologicznych. Opisana poniżej metodologia łączy skumulowaną moc genetyki molekularnej D. melanogaster z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w nagraniach z użyciem klamer krosowych całych komórek. Połączenie to pozwala na badanie fototransdukcji D. melanogaster jako modelu sygnalizacji inozytolowo-lipidowej oraz regulacji i aktywacji kanału TRP, zarówno w środowisku natywnym, jak i przy najwyższej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek.
Zastosowanie metody zapisu całej komórki do fotoreceptorów D. melanogaster zrewolucjonizowało badania nad fototransdukcją u bezkręgowców. Metoda ta została opracowana przez Hardie1 i niezależnie przez Ranganathana i współpracowników2 ~26 lat temu i została zaprojektowana w celu wykorzystania obszernych narzędzi manipulacji genetycznej D. melanogaster i wykorzystania ich do odkrycia mechanizmów fototransdukcji i sygnalizacji inozytolowo-lipidowej. Początkowo technika ta cierpiała z powodu szybkiego zmniejszenia wrażliwości na światło i niskiej wydajności ommatidiów podczas procesu sekcji, co uniemożliwiało przeprowadzenie szczegółowych badań ilościowych. Później dodanie ATP i NAD do pipety punktowej znacznie zwiększyło przydatność preparatu do długotrwałych zapisów ilościowych. Następnie przeprowadzono obszerną charakterystykę mechanizmu transdukcji sygnału na poziomie molekularnym.
Obecnie, fototransdukcja D. melanogaster jest jednym z niewielu systemów, w których sygnalizacja fosfoinozytydu i kanały TRP mogą być badane ex vivo w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki. To sprawia, że fototransdukcja D. melanogaster i metodologia opracowana do badania tego mechanizmu są bardzo czułym systemem modelowym. Protokół ten opisuje, jak wypreparować siatkówkę D. melanogaster i mechanicznie usunąć izolowaną ommatydię z otaczających komórek barwnikowych (glejowych). Umożliwia to utworzenie giga-seal i klamry krosowej całej komórki na ciałach komórek fotoreceptorów. Na szczęście większość białek sygnałowych jest ograniczona do rabdomeru i nie ulega dyfuzji. Ponadto istnieje nieruchomy bufor Ca2+ o nazwie kalfotyna, znajdujący się między przedziałem sygnalizacyjnym a ciałem komórki3,4, oraz wysoki poziom ekspresji wymiennika Na+/Ca2+ (CalX) w microvilli5. Łącznie uwięzienie białek w rabdomerze, buforze kalfotyny i wysoka ekspresja CalX pozwalają na stosunkowo wydłużone (tj. do ~20 min) zapisy całych komórek, bez utraty istotnych składników procesu fototransdukcji i przy zachowaniu wysokiej wrażliwości na światło. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób uzyskać izolowaną ommatydię i wykonać zapisy całych komórek, które wydają się zachowywać natywne właściwości kaskady fototransdukcji. Eksperymenty z klamrą całokomórkową na zdysocjowanym karaluchu (Periplaneta americana)6 i świerszczu (Gryllus bimaculatus)7 ommatidia przeprowadzono podobnie jak opisano dla D. melanogaster. Ponadto, eksperymenty z klamrą łatową na zdysocjowanych fotoreceptorach małża (scabra) i przegrzebka (Pecten irradians) zostały przeprowadzone w nieco inny sposób niż te przeprowadzone na D. melanogaster, umożliwiając zarówno pomiary całokomórkowe8, jak i jednokanałowe9. W tym miejscu opisano główne osiągnięcia uzyskane u D. melanogaster przy użyciu tej techniki. Dyskusja zawiera opis niektórych pułapek i ograniczeń tej techniki.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 10 ml</td> Strzykawka <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml</td> Strzykawka <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml z wydłużoną końcówką</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka</td><td></td><td></td> Petriego <td>60 mm</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &micro; m Filtr PVDF&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary (do separacji omatidiów)</td><td></td><td></td><td>Szkło, 1,2 x 0,68 mm (~7,5 cm każda)</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1,57 x 1,14 mm (35 cm)</td></tr><tr><td>&nbsp; 2 małe zlewki</td><td></td><td></td><td>50 ml lub mniej</td></tr><tr><td>2 arkusze folii parafinowej</td><td>Parafilm M</td><td></td><td>~5 x 5 cm</td></tr><tr><td>Komora kąpielowa</td><td>domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td> nakrywkowe <td>22 x 22 mm Nr 0</td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma</td><td>Parafina &ndash; mieszanina poliizobutylenu</td><td>Do przyklejenia szkiełka nakrywkowego na dnie komory kąpielowej</td></tr><tr><td>Ziemia</td><td>Instrumenty Warnera&nbsp;</td><td>64-1288</td><td>Zespół hybrydowy Zespół drutu Ag-AgCl</td></tr><tr><td>Bezgłowa igła do mikropreparacji</td><td></td><td></td><td>Entomologia, 12 mm</td></tr><tr>Uchwyt <td></td><td></td><td></td><td>na igłę do mikropreparacji</td></tr><tr><td>Imadło</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 cienkie pęsety + 1 szorstka pęseta</td><td></td><td>Dumont #5, Biologia&nbsp;</td><td>0,05 x 0,02 mm, długość 110 mm, Inox</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z zoomem&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła</td><td>Schott</td><td>KL1500 Filtr LCD</td><td></td></tr><tr><td>(kolor) do źródła zimnego światła</td><td>Schott</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne wycieraczki</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-T10P</td><td>Q series Uchwyty kompatybilne ze wzmacniaczami Axon, prosty styl korpusu</td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>o średnicy 0,25 mm, musi być chlorowany</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP 85</td><td>Mikromanipulator Huxley-Wall Style</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Elektromagnetyczna osłona przed hałasem i kurtyna przednia</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Osyloskop</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-8P</td><td>System sterowania zaworem zaciskowym</td></tr><tr><td>Sterownik zaworu perfuzyjnego</td><td>Instrumenty naukowe</td><td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>System ssący</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenie molekularne</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie molekularne</td><td>stopnia głównego</td><td>CV - 4</td><td>Wzmocnienie: x 1/100</td></tr><tr><td>A / D konwerter</td><td>Urządzenie molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Oprogramowanie Molecular Device</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła (lampa ksenonowa)</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda LS</td><td></td></tr><tr><td>Detektor światła</td><td>domowy</td><td></td><td>fototranzystor</td></tr><tr><td>Koło filtrów i kontroler migawki</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda 10-2 z migawką</td><td></td>Uniblitz</tr><tr><td>Filtry (filtr o naturalnej gęstości)</td><td>Filtr Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>(Kolor)</td><td>Schott</td><td>OG590, Filtr</td><td></td>krawędziowy</tr><tr><td>Ksenonowa lampa błyskowa System lamp</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód</td><td></td><td></td><td>kwarcowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>IX71, Filtr podświetlenia odwróconego</td><td></td></tr><tr><td>czerwonego (mikroskop)</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645 &oslash; Obiektyw mikroskopowy 45 mm</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>X60/0.9 UplanFL N air lub X60/1.25 UplanFI olejowa</td><td></td></tr><tr><td>kamera CCD</td><td></td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>Element&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie Nikon</td><td>AR</td></tr><tr><td>Wskaźnik Ca+2</td><td>Invitrogen</td><td>Calcium green 5N</td><td></td></tr><tr><td>Filtry wzbudzenia i emisji oraz lustro dichroiczne</td><td>Chroma</td><td>19002 - AT - GFP/FITC Zestaw</td><td></td>longpassów</tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>Narishige&nbsp;</td><td>Model PP83</td><td>Użyj ściągacza pionowego lub poziomego, zgodnie z preferencjami.</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>poziomych Sutter Instrument&nbsp;</td><td>Model P-1000 Płonący / brązowy ściągacz</td><td></td>do mikropipet</tr><tr><td>Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>3 mm koryto lub kwadratowe pudełko</td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>Aparat Harvarda</td><td>kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>1 x 0,58 mm</td></tr></tbody></table>

metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów drosophila

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila melanogaster zrewolucjonizowały dziedzinę transdukcji wzrokowej u bezkręgowców, umożliwiając wykorzystanie genetyki molekularnej D. melanogaster do badania sygnalizacji inozytolowo-lipidowej i kanałów Przejściowego Potencjału Receptora (TRP) na poziomie pojedynczej cząsteczki. Kilka laboratoriów opanowało tę potężną technikę, która umożliwia analizę fizjologicznych reakcji na światło w ściśle kontrolowanych warunkach. Technika ta umożliwia kontrolę nad pożywkami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi; napięcie membrany; oraz szybkie stosowanie związków farmakologicznych, takich jak różne wskaźniki jonowe lub pH, do pożywek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Dzięki wyjątkowo wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu, metoda ta umożliwia pomiar ciemnych prądów jednostkowych spontanicznych i indukowanych światłem (tj. spontanicznych i kwantowych wybrzuszeń) oraz makroskopowych prądów indukowanych światłem (LIC) z pojedynczych fotoreceptorów D. melanogaster. Protokół ten bardzo szczegółowo określa wszystkie kluczowe kroki niezbędne do wykonania tej techniki, która obejmuje zarówno zapisy elektrofizjologiczne, jak i optyczne. Opisano procedurę preparowania siatkówki muchy w celu uzyskania nienaruszonej i żywotnej ommatydii izolowanej ex vivo w komorze kąpielowej. Szczegółowo opisano również sprzęt potrzebny do wykonywania pomiarów obrazowania całych komórek i fluorescencji. Na koniec wyjaśnione są pułapki związane ze stosowaniem tego delikatnego preparatu podczas dłuższych eksperymentów.

Opisana metoda umożliwiła dokładny zapis podstawowych prądów jednostkowych generujących spontaniczne i wywołane światłem kwantowe skoki (quantum bumps), które sumują się, tworząc makroskopową odpowiedź na światło w określonych warunkach. Pozwoliła ona również na porównanie much typu dzikiego z mutantami posiadającymi defekty w kluczowych cząsteczkach sygnałowych (Ryciny 3 i 5)14,15,16,17,18. Ponadto możliwość pomiaru potencjału odwrócenia w warunkach bi-jonowych ujawniła fundamentalne właściwości biofizyczne kanałów TRP i TRP-podobnych (TRPL)18,19. Umożliwiła ona także pomiar efektów substytucji aminokwasowych w regionie poru TRP, które zmodyfikowały jego przepuszczalność dla Ca2+20.
Odpowiedź na światło uzyskana za pomocą rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell zależy liniowo od natężenia światła w zakresie co najmniej 4 rzędów wielkości. Nie można było tego rozstrzygnąć, stosując ERG oraz metody rejestracji wewnątrzkomórkowej. W związku z tym seria odpowiedzi na krótkie błyski o rosnącym natężeniu oraz wykres funkcji odpowiedzi na natężenie wykazały ścisłą liniowość odpowiedzi na błysk wraz ze wzrostem natężenia światła. Ścisła liniowość utrzymuje się co najmniej do poziomu kilkuset pA, jednak kwestią sporną pozostaje, czy po tym progu następuje utrata liniowości, czy też utrata kontroli clampingu (Rysunek 6). Wyniki te sugerują, że makroskopowe odpowiedzi na światło są liniową sumą jednostkowych odpowiedzi na światło (t.j. quantum bumps).
Za pomocą pomiarów napięcia dobrze ustalono, że stymulacja słabym światłem indukuje dyskretne fluktuacje napięcia (t.j. kwantowe wypukłości, tzw. quantum bumps) u większości gatunków bezkręgowców. Kwantowe wypukłości u D. melanogaster wynikają z skoordynowanego otwarcia ok. 15 kanałów TRP i ok. 2 kanałów TRPL w szczycie wypukłości18. Każda wypukłość jest generowana przez absorpcję pojedynczego fotonu, podczas gdy odpowiedź makroskopowa na intensywniejsze światło jest sumą tych elementarnych odpowiedzi14,21. Wypukłości znacznie różnią się pod względem latencji, przebiegu czasowego i amplitudy, nawet gdy warunki stymulacji są identyczne. Generowanie wypukłości jest procesem stochastycznym opisanym statystyką Poissona, w którym każdy efektywnie zaabsorbowany foton wywołuje tylko jedną wypukłość. Relacja jeden foton – jedna wypukłość wymaga, aby każdy etap kaskady obejmował nie tylko wydajny mechanizm „włączania”, ale także równie skuteczny mechanizm „wyłączania”. Zaletą funkcjonalną jest stworzenie bardzo czułego licznika fotonów z szybką odpowiedzią przejściową, bardzo dobrze dostosowaną zarówno do czułości, jak i rozdzielczości czasowej wymaganej przez system wzrokowy. Konieczność istnienia wydajnego mechanizmu wyłączania ujawnia się, gdy albo aktywny fotopigment (t.j. metarhodopsyna, M), albo jego cel, Gqα, nie ulegają inaktywacji, co prowadzi do ciągłego generowania wypukłości długo po wyłączeniu światła (Rycina 3)15,2,23,24.
Wypukłość reprezentuje kooperatywną aktywność kanałów TRP/TRPL w mikrokosmkach. W związku z tym każda hipoteza dotycząca aktywacji kanałów powinna wyjaśniać również kooperatywną aktywację kanałów. Niedawno Hardie i współpracownicy wykazali, że światło wywołuje szybkie skurcze fotoreceptorów, co sugeruje, że kanały światłoczułe (TRP/TRPL) mogą być bramkowane mechanicznie25. Ta aktywacja mechaniczna, wraz z obserwowanymi protonami uwalnianymi podczas hydrolizy PIP2 zależnej od PLC, sprzyja otwieraniu kanałów TRP/TRPL i wyjaśnia kooperatywny charakter powstawania wypukłości26. Obecnie fotoreceptory D. melanogaster są jednym z niewielu systemów, w których sygnalizacja fosfoinozytidowa i kanały TRP mogą być badane in vivo, co czyni fototransdukcję u D. melanogaster oraz metodologię opracowaną do badania tego mechanizmu niezwykle wartościowym systemem modelowym.
<img alt="Schematy odpowiedzi fotoreceptorów; elektrofizjologia, różne mutacje; porównanie aktywności synaptycznej." src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: inaCP209 oraz inaDP215 Mutanty ujawniają powolną terminację odpowiedzi makroskopowej na światło oraz pojedynczych skoków kwantowych. (APrezentowany jest preparat izolowanego ommatidium z pipetą patch wypełnioną fluorescencyjnym barwnikiem Lucifer Yellow CH (podbudzenie: 430 nm; emisja: 540 nm) podczas rejestracji w konfiguracji whole-cell. Należy zauważyć, że barwnik fluorescencyjny rozprzestrzenił się i oznakował ciało jednej komórki fotoreceptora oraz że ciała komórek fotoreceptorów są oddzielone od swoich wydłużonych aksonów, lecz wciąż zachowują żywotność. Preparat ten nadaje się do jednoczesnych rejestracji whole-cell i eksperymentów obrazowania.B-D) Górne panele: Odpowiedzi quantum bump w warunkach clampowania napięcia całej komórki na ciągłe słabe światło (otwarty pasek) w grupie WT, inaCP209i inaDP215 muchy mutanty. Obserwuje się powolne ustępowanie wybrzuszeń w inaCP209 i inaDP215 mutanty w stosunku do much typu dzikiego (WT). Wstawka poniżej przedstawia powiększony kształt pojedynczych wypukłości. Panele dolne: Znormalizowane makroskopowe odpowiedzi zarejestrowane metodą whole-cell w odpowiedzi na 50-msowy impuls świetlny (1,5 x 105 fotonów na sekundę) powyższych much typu dzikiego i mutantów. (E-G) Panele górne: Reakcje typu quantum bump przy zastosowaniu zaciskowego pomiaru napięcia w całej komórce w odpowiedzi na krótkie (1 ms), słabe światło wywołujące odpowiedzi jednofotonowe u osobników typu dzikiego, arr23i ninaCP235 muchy mutanty. Zwróć uwagę na szereg wybrzuszeń zaobserwowanych w arr23 i ninaCP235 much mutantów w odpowiedzi na absorpcję pojedynczego fotonu. Panele dolne: znormalizowane odpowiedzi w technice clampingu napięciowego całych komórek na impuls światła o czasie trwania 50 ms (1,5 x 104 fotony/s) w odpowiadających im mutantach. Należy zwrócić uwagę na powolne wygaszanie odpowiedzi makroskopowych zaobserwowanych w arr23 i ninaCP235 muchy mutanty w stosunku do typu dzikiego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna z rozdzielczością czasową WT w porównaniu z Cpn1% przy różnych czasach naświetlania; analiza emisji." src="/files/ftp_upload/55627/55627fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Komórkowe Ca2+2+ Dynamika po indukowaniu sygnałem Ca2+2+ Napływ jest modyfikowany przez Calphotin.  Szereg czasowy obrazów fotoreceptorów typu dzikiego oraz Cpn1% muchy wykazujące fluorescencję Ca2+ wskaźnik podczas stymulacji światłem. Surowe obrazy intensywności przedstawiono z zastosowaniem kodowania kolorami sztucznymi (pasek = 10 µm; groty strzałek wskazują pipetę). Rycina przedrukowana za zgodą Weissa i wsp.4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres elektrofizjologiczny zapisów prądów u much typu dzikiego w porównaniu do mutantów trp; protokół skoku napięcia." src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Właściwości elektrofizjologiczne mutantów WT, trp i trpl. (ARejestracje metodą clampowania napięcia w całej komórce obrazujące skoki kwantowe w odpowiedzi na ciągłe słabe światło (otwarty pasek) w typie dzikim (WT) oraz w mutantach trpl302, oraz trpP343 muchy z mutacją null. Znacznie zredukowane amplitudy trpP343 obserwuje się wypukłości. Wstawka: Powiększone pojedyncze wypukłości kwantowe typu dzikiego i trpP343 przedstawiono muchy z mutantem null. (B) Rejestracje metodą clampowania napięcia w całej komórce w odpowiedzi na 3-sekundowy impuls światła u typu dzikiego i odpowiadających mu mutantów. Przejściowa odpowiedź stanu stacjonarnego trpP343 obserwuje się mutanty. Wstawka: Powiększone reakcje na światło typu WT i trpP343wykazano mutanty. (C) Rodzina nałożonych na siebie prądów indukowanych światłem powyższych szczepów much, wywołanych w odpowiedzi na 20 ms impuls światła, przy skokach napięcia o 3 mV, mierzonych w okolicy potencjału odwrócenia (EPrzegląd). (D) Histogram przedstawiający średnią wartość Erewizja typu dzikiego oraz różnych mutantów. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (S.E.M.). Potencjał odwrócenia (Erew.) typu WT znajduje się pomiędzy dodatnim Eprzegląd z trpl302, który wykazuje ekspresję wyłącznie TRP, oraz Eprzegląd z/zauważone przez/z obszaru/z zakresu trpP343 mutant null, który wykazuje ekspresję wyłącznie TRPL. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres odpowiedzi fotonowej wykazujący sumowanie liniowe, z prądem w pikoamperach oraz liczbą fotonów." src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6: Odpowiedź na błysk jest ściśle liniowa wraz ze wzrostem natężenia światła. 
Seria odpowiedzi prądowych na krótkie błyski o rosnącym natężeniu światła oraz wykres zależności amplitudy szczytowej odpowiedzi świetlnej od rosnącego natężenia krótkich błysków światła. Zależność ta wykazuje ścisłą liniowość między odpowiedzią na błysk a rosnącym natężeniem światła. Ścisła liniowość ta utrzymuje się co najmniej do poziomu kilkuset pA, przy natężeniu światła obejmującym ponad 4 rzędy wielkości, podczas gdy kwestią dyskusyjną pozostaje, czy po tym zakresie następuje załamanie liniowości, czy też kontroli clampowania. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >pH</td>
			<td >7.15 (dostosować za pomocą NaOH)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Stężenie (mM)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >120</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TES</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prolina</td>
			<td >25</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Alanina</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Przechowywać w -20 °C.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">Uwaga: Roztwór ten jest nominalnie wolny od Ca2+, ale nie dodano do niego buforów Ca2+, w związku z czym zawiera on około 5 - 10 µM śladowych ilości Ca2+. Roztwór zewnątrzkomórkowy (ES) = ES-0Ca2+ z dodatkiem 1.5 mM CaCl2, przygotowany poprzez dodanie CaCl2 z roztworu zapasowego o stężeniu 0.5 lub 1 M do ES-0Ca2+.</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Pozakomórkowy roztwór (ES) wolny od Ca+2.Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania ES wolnego od Ca+2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytki surowicy bydlęcej</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sacharoza</td>
			<td>1,5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Podzielić na 150 µL rozdzielić na aletikwoty w probówkach 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do tryturacji (TS)</td>
			<td>Napełnić 1 fiolkę o pojemności 150 ml roztworem zapasowym przygotowanym z 1 350 ml ES lub ES-0Ca2+, aby dopasować go do roztworu używanego podczas sekcji.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Surowica z płodu bydlęcego (FBS) + sacharoza - roztwór zapasowy. Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania roztworu zapasowego surowicy z płodu bydlęcego (FBS) + sacharozy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >pH</td>
			<td >7,15 (skorygować za pomocą KOH)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Stężenie (mM)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Gluconian potasu (Kglu)</td>
			<td >140</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TES</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Sól magnezowa ATP (MgATP)</td>
			<td >4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Sól sodowa GTP (Na2GTP)</td>
			<td >0,4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Hydrat β-nikotynamidoadeninowych dinukleotydów (NAD)</td>
			<td >1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Przechowywać w temperaturze -20 °C.</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Roztwór wewnątrzkomórkowy (IS1). Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania roztworu IS1, który jest stosowany głównie do pomiarów odpowiedzi intensywności oraz przesunięcia kwantowego (quantum bump).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7,15 (skorygować za pomocą CsOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sól magnezowa ATP (MgATP)</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sód GTP (Na2GTP)</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-Nikotynamidoadeninodynukleotyd hydrat (NAD)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek tetraetyloamoniowy (TAE)</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Przechowywać w temperaturze -20 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Roztwór wewnątrzkomórkowy (IS2). Opis chemiczny i konkretne ilości niezbędne do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego IS2, wykorzystywanego głównie do pomiarów potencjału odwrócenia prądu indukowanego światłem.

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie rejestracji metodą clampowania napięcia z całej komórki (whole-cell voltage clamp) z pojedynczej komórki fotoreceptora w celu pomiaru prądów indukowanych światłem, powstających w wyniku absorpcji pojedynczych fotonów oraz powtarzalnych odpowiedzi na intensywne światło. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych zagadnień z zakresu transdukcji sensorycznej, takich jak transdukcja wzrokowa w odniesieniu do mechanizmów fizycznych i jonowych leżących u podstaw fototransdukcji oraz właściwości kanałów TRP. Zalety zastosowania tej techniki obejmują pełną kontrolę nad napięciem błony, niezwykle wysoki stosunek sygnału do szumu oraz możliwość wprowadzania specyficznych wskaźników do pomiarów optycznych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą miały trudności z niewielkim rozmiarem preparatu oraz koniecznością szybkiego przeprowadzenia sekcji ze względu na czasową podatność metaboliczną. W przypadku tej procedury należy hodować muchy w zagęszczeniu około 20 osobników na fiolkę. W momencie przeprowadzania eksperymentu należy przygotować kilka fiolek z poczwarkami, które są bliskie zamknięcia i przebywały w całkowitej ciemności przez co najmniej 24 godziny.Na dwie godziny przed zbieraniem osobników dorosłych, usuń wszystkie muchy, które już się wykluły. Zawsze obchodź się z muchami zaadaptowanymi do ciemności w tkankach pod oświetleniem czerwonym. Oczekując na świeżo wyklute muchy, przygotuj komorę rejestracyjną.Do dna komory przymocuj szkiełko nakrywkowe, używając roztopionej parafiny lub wysokopróżniowego smaru silikonowego, aby zamknąć wannę. Następnie zamocuj wannę na stoliku mikroskopu odwróconego. Do wnętrza wanny wprowadź rurkę systemu perfuzyjnego, rurkę systemu ssącego oraz przewód uziemiający dla zestawu do elektrofizjologii.Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować roztwory na odwrotnej stronie płytki Petriego o średnicy 60 mm. Nanieść cztery oddzielne krople medium ES bez wapnia oraz jedną kroplę medium TS. Następnie, używając pęsety o szerokich końcach, chwycić za skrzydła lub ciało muchy, która niedawno przeszła proces eklozji. Następnie za pomocą pęsety precyzyjnej oddzielić głowę i szybko przenieść ją do pierwszej kropli medium ES bez wapnia. Pod stereomikroskopem przekroić głowę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, używając drugiej pęsety precyzyjnej.Upewnij się, że oba oczy pozostały nienaruszone. Następnie przenieś 1/2 głowy do drugiej kropli ES bez wapnia, a pozostałą część głowy do trzeciej kropli ES bez wapnia. Następnie przystąp do wypreparowania jednego z dwóch oczu.Używając precyzyjnej pęsety, usuń jak największą ilość tkanki otaczającej oko, aby upewnić się, że siatkówka nie została uszkodzona. Następnie mocno uchwyć krawędź rogówki precyzyjną pęsetą i wydobądź siatkówkę. Wynikiem powinna być pusta, nienaruszona rogówka oddzielona od nienaruszonej siatkówki.Pipety są przechowywane w etanolu, dlatego przy użyciu nowej pipety do tryturacji należy ją najpierw zawsze wypłukać wodą. Następnie wypełnij wypłukaną pipetę niewielką objętością ES wolnego od wapnia, zaczynając od czwartej kropli. Po tym, delikatnie zasysając powietrze ustami, wciągnij wyizolowaną siatkówkę do pipety.Z najwyższą ostrożnością należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza. Następnie siatkówkę należy przenieść do kropli TS. Kolejnie powtórzyć izolację siatkówki z drugiego oka, tak aby oba narządy znajdowały się w kropli TS. Następnie delikatnie usunąć z płytki Petriego wyłącznie bezwapniowe ES i dodać na powierzchnię płytki sześć kolejnych kropli TS.Przenieś obie siatkówki do nowych kropel TS. Następnie zastąp pipetę do trituracji taką, która ma otwór o małej średnicy. Po wypłukaniu napełnij pipetę kroplą TS. Używając tej pipety, szybko i wielokrotnie aspiruj i wydmuchuj obie siatkówki, aby oddzielić część ommatidiów od komórek pigmentowych. W trakcie tego procesu roztwór TS zmętnieje.Następnie przenieś pozostałości obu siatkówek do kolejnej kropli TS. Potem nabierz do pipety mętną kroplę TS zawierającą wyizolowane ommatidia. Wypuść roztwór do komory kąpielowej. Powtarzaj tę procedurę, używając pipet do tryturacji o coraz mniejszej średnicy, aż siatkówka zostanie całkowicie rozpuszczona.Teraz odczekaj minutę. Podczas tej przerwy odizolowane ommatidia przywrą do dna komory. Po upływie minuty rozpocznij przepływ ES zawierającego 1,5 mM wapnia za pomocą systemu perfuzyjnego.Podczas napełniania komory należy upewnić się, że przewód uziemiający oraz rura ssawna są zanurzone. Pozostaw roztwór w przepływie przez 60 do 90 sekund przed kontynuowaniem procedury. Aby rozpocząć, użyj obiektywu 40x, aby dokładnie obejrzeć ommatidia w kąpieli.Zauważcie, że wydłużone ciała komórek fotoreceptorów tworzące ommatidium są oddzielone od swoich aksonów, ale pozostają żywe. Teraz wybierzcie odpowiednie ommatidium do eksperymentu. Wybierzcie je, gdy spełnia następujące kryteria.Błona zewnętrzna musi być gładka i nienaruszona. Długa oś musi znajdować się niemal pod kątem prostym względem podejścia elektrody od strony dystalnej. Ommatydium nie powinno być otoczone żadną nadmiarową tkanką.Po wybraniu odpowiedniego ommatydium należy ustawić je w centrum pola widzenia. Następnie wypełnić pipetę odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym do przeprowadzenia eksperymentu i przymocować pipetę do uchwytu elektrody.Następnie należy dmuchnąć do rurki pipety, aby wytworzyć nadciśnienie, a następnie zablokować je, zamykając zawór rurki. Dalej należy wprowadzić pipetę do komory kąpielowej i prowadzić ją w kierunku dystalnej części ommatidium, aż do momentu zaobserwowania w błonie niewielkiego wgłębienia, spowodowanego nadciśnieniem z pipety w miejscu styku. Teraz należy otworzyć moduł testowania błony w oprogramowaniu rejestrującym, aby przyłożyć ciągłe prostokątne impulsy napięcia o wartości 2 mV z częstotliwością 100 Hz.Następnie, korzystając z elementów sterujących wzmacniacza patch clamp, ustaw potencjał złącza na zero, aby zredukować prąd podstawowy impulsu prostokątnego do zera. Następnie otwórz zawór, aby zwolnić ciśnienie w pipecie i ostrożnie aspiruj, tworząc podciśnienie. Pipeta powinna wówczas przylgnąć do błony komórkowej.Gdy to nastąpi, zamknij zawór, aby utrzymać ciśnienie. Teraz sprawdź oporność elektrody. Powinna ona wzrosnąć do poziomu między 100 a 150 megaohms.Następnie zwolnij podciśnienie w pipecie, ponownie otwierając zawór. Opór powinien teraz gwałtownie wzrosnąć do wartości między jednym a dwoma gigaohmom, co wskazuje na utworzenie kontaktu typu C pomiędzy pipetą a komórką. Następnie, korzystając z wzmacniacza patch-clamp, zrób offset prądu pojemnościowego pipety.Aby uzyskać konfigurację whole-cell, należy przerwać błonę komórkową poprzez aspirację ustną. Należy wytworzyć szybkie, krótkie i silne impulsy podciśnienia w elektrodzie. Po uzyskaniu konfiguracji whole-cell nastąpi gwałtowny wzrost pojemności.Następnie, używając wzmacniacza patch-clamp, ustaw potencjał podtrzymujący na wymagane napięcie i skompensuj prądy pojemnościowe oraz oporność szeregową. Teraz zamknij czarną zasłonę klatki Faradaya i rozpocznij eksperyment. Po uzyskaniu konfiguracji whole-cell za pomocą pipety patch zawierającej barwnik fluorescencyjny, Lucifer yellow, można zauważyć, że tylko jeden z fotoreceptorów tworzących ommatidium został załadowany barwnikiem.Ten fotoreceptor zostanie również odizolowany elektrycznie od sąsiednich komórek w ommatidium. Ommatidia z clampingiem napięcia całej komórki u much typu dzikiego oraz u much z mutacjami w genach InaC lub InaD wykazały skoki kwantowe w odpowiedzi na ciągłe słabe światło. U obu mutantów zaobserwowano wolniejszą terminację skoków w porównaniu do much typu dzikiego.Znormalizowane odpowiedzi na 500 milisekundowe impulsy świetlne dostarczane z natężeniem 150 000 fotonów na sekundę przejrzyście ilustrują zmienioną fizjologię. Z wykorzystaniem tej preparacji możliwe było nawet zmierzenie odpowiedzi typu „quantum bump” w konfiguracji clampowania napięcia całego komórki na krótkie, jednosekundowe przebłyski słabego światła. Takie odpowiedzi na pojedyncze fotony porównano u much dzikich, mutantów arrestyny oraz mutantów ninaC.Oba mutanty odpowiedziały serią wypukłości. Znormalizowane odpowiedzi na 500 milisekundowy impuls światła dostarczony z natężeniem 15 000 fotonów na sekundę. Zatem powolna terminacja odpowiedzi makroskopowej jest obserwowana u mutantów arrestin-2 oraz ninaC.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać rejestrację całokomórkową z komórek fotoreceptorów Drosophila. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje jedną godzinę. Technika ta utorowała drogę badaczom do lepszego zrozumienia kanałów TRP i sygnalizacji lipidów inozytolowych, a także roli wewnętrznie światłoczułych zwojowych komórek siatkówki występujących u ssaków, które biorą udział w aktywnościach zależnych od światła, nietworzących obrazu.

electrophysiological-method-for-whole-cell-voltage-clamp-recordings

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę izolacji całych mózgów dorosłych muszek Drosophila w celu przygotowania do rejestracji z pojedynczych neuronów przy użyciu standardowej techniki whole-cell. Materiał zawiera obrazy komórek i neuronów znakowanych GFP, zarejestrowane podczas pomiarów.

Rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy Drosophila

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

In situ rejestracje metodą patch clamp są wykorzystywane do charakterystyki elektrofizjologicznej neuronów w nienaruszonych obwodach. W modelu genetycznym Drosophila technika patch clamp jest trudna, ponieważ OUN jest mały i otoczony wytrzymałą osłoną. Niniejszy artykuł opisuje procedurę usuwania osłony oraz oczyszczania neuronów w celu przeprowadzenia późniejszych rejestracji metodą patch clamp.

Przygotowanie neuronów ośrodkowych Drosophila do metody in situ patch clamp

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Film demonstruje rejestrowanie aktywności elektrycznej w neuronach fotoreceptorowych ommatidium Drosophila poprzez ustanowienie konfiguracji całej komórki. Podkreśla on aktywację przejściowych kanałów potencjału receptora przez impulsy świetlne, co skutkuje mierzalnymi wstrząsami kwantowymi.

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Poznaj metodę elektrofizjologiczną całokomórkowych zapisów cęgów napięcia w fotoreceptorach Drosophila melanogaster. Technika umożliwia pomiar prądów światłowrażliwych i badanie mechanizmów fototransdukcji.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów