Name: In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in ovo w słuchowym pniu mózgu kurczaka, umożliwiającą kontrolę ekspresji genów. Technika ta pozwala badać rozwój neuronów słuchowych i zaburzenia związane z układem słuchowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować doktorom Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andresowi Barrii i Pani Ximenie Optiz-Araya za wstępną pomoc w ustaleniu protokołu i za dostarczenie plazmidów. Prace te były wspierane przez DC013841 grantowe NIH/NIDCD (JTS).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Obchodzenie się z jajkami
<ol>
	<li>Kup zapłodnione jaja od lokalnego sprzedawcy. Jaja należy przechowywać w temperaturze 13 °C w lodówce nie dłużej niż 5 dni przed inkubacją. Żywotność zarodka znacznie spada po 1 tygodniu.</li>
	<li>Wymaz z każdego jajka 70% etanolu przed umieszczeniem w inkubatorze.</li>
	<li>Ustaw 1-2 tuziny jaj na boku w inkubatorze o temperaturze ustawionej na 38 °C przy wilgotności ~50%. Zapewnia to prawidłowe pozycjonowanie zarodka do elektroporacji i optymalną żywotność. 
	UWAGA: Po 48-52 godzinach inkubacji jaja będą w fazie Hamburger-Hamilton (HH) ~12-13 i gotowe do elektroporacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie
<ol>
	<li>Mieszanie plazmidów
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl 0,1% fast green (0,1% w 18 MΩ dejonizowanego i destylowanego H2O [ddH2O]) na każde 7 μl mieszaniny DNA.</li>
		<li>W celu koelektroporacji wielu plazmidów należy wymieszać plazmidy w stosunku 1:1. Końcowe stężenie DNA powinno wynosić 5-8 μg/μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij pipetę iniekcyjną
	<ol>
		<li>Pociągnij pipety na ściągaczu do mikropipet. Napełnij pipetę plazmidami o pojemności 1-2 μl za pomocą igły strzykawkowej 28G.</li>
		<li>Rozbić końcówkę pipety na 10 - 20 μm za pomocą kleszczy. Użyj mikroskopu, aby pomóc w określeniu rozmiaru złamanej końcówki pipety. Przymocuj pipetę do uchwytu na pipety pikospritzera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Okienka
UWAGA: Procedura okienkowania została opublikowana wcześniej13. Patrz odniesienie 13, aby uzyskać dodatkowe informacje wizualne.
<ol>
	<li>Przetrzyj wszystkie instrumenty i obszar roboczy 70% etanolem.</li>
	<li>Wyjmij żądaną liczbę załączonych jaj z inkubatora (między 6-10), pozostaw w temperaturze pokojowej i ponownie indywidualnie przetrzyj jajka 70% etanolem. Jaja zachowują żywotność przez co najmniej 2 godziny po wyjęciu z inkubatora.</li>
	<li>Umieść jajo na iluminatorze świetlnym, aby określić położenie zarodka. Zakreśl ołówkiem środek ciemnego obszaru (tj. zarodka).</li>
	<li>Za pomocą igły 19G zrób dziurę w końcu jajka.</li>
	<li>Zrób kolejny otwór w pobliżu narysowanego okręgu po spiczastej stronie jajka. Usuń mały kawałek zewnętrznej skorupki jajka (około 16 mm2) za pomocą igły 19G, a następnie usuń mały kawałek wewnętrznej skorupki jajka (około 8 mm2) za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę 19G pobrać 1,5-2,5 ml albuminy z jaja przez otwór. Upewnij się, że igła jest ustawiona pod kątem 45°.</li>
	<li>Zakryj koniec otworu małym kawałkiem taśmy (1 cm x 1 cm). Zakryj narysowane koło i drugi otwór taśmą (2,5 cm x 4 cm).</li>
	<li>Zakrzywionymi nożyczkami (krawędź tnąca = 2,5 cm) wytnij okno w okręgu. Nożyczki powinny być równoległe do skorupki jajka, a średnica okna powinna być mniejsza niż 2 cm.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie plazmidu
<ol>
	<li>Włącz pikospritzer. Ustaw ciśnienie na 18 psi, a czas trwania na 5 μs. Włącz zbiornik powietrza i lampę do mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Przygotować 30 ml roztworu podstawowego z rozcieńczonego w stosunku 1:10 indyjskiego atramentu zakupionego w sklepie zmieszanego ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Wstrzyknięcie indyjskiego atramentu jest ważnym krokiem w celu uzyskania lepszej wizualizacji zarodka kurczaka.
	<ol>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml rozcieńczonym roztworem atramentu indyjskiego. Założyć igłę 27G i usunąć wszelkie pęcherzyki znajdujące się w strzykawce.</li>
		<li>Wbić igłę tuż pod błonę żółtka w odległości ~2 - 3 mm od zarodka i delikatnie wstrzyknąć ~0,2 ml tuszu indyjskiego pod zarodek. Nie należy wstrzykiwać więcej niż 0,5 ml tuszu indyjskiego, ponieważ może to zmniejszyć przeżywalność zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść jajko z okienkiem na uchwycie na jajka pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj największego powiększenia, aby uzyskać najlepszą wizualizację miejsca wstrzyknięcia plazmidu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków usunąć membranę z obszaru wstrzyknięcia. Słuchowe obszary pnia mózgu będące przedmiotem zainteresowania (tj. NM i NL) powstają z rombomerów 5 i 6 (R5/R6). R5 / R6 znajdują się w sąsiedztwie otocyst (struktura embrionalna u kręgowców, która rozwija się w ucho wewnętrzne), które służą jako punkty orientacyjne dla iniekcji plazmidu R5 / R6.</li>
	<li>Opuść pipetę wypełnioną DNA do rurki nerwowej leżącej nad regionem R5/R6 i między otocystami za pomocą mikromanipulatora. Schemat idealnego rozmieszczenia pokazano na rysunku 1A.</li>
	<li>Zastosuj ciśnienie powietrza (18 psi, czas trwania 5 μs) z pikospritzera, aby wyrzucić DNA z cewy neuronowej.</li>
</ol>
5. Elektroporacja
<ol>
	<li>Włączyć stymulator prądu/napięcia.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml PBS i podłącz filtr strzykawkowy. Dodaj 1-2 krople PBS na zarodek.</li>
	<li>Opuść elektrodę bipolarną do zarodka za pomocą mikromanipulatora z elektrodą ujemną powyżej miejsca wstrzyknięcia (przyśrodkową), a elektrodą dodatnią bocznie do R5/R6 (ryc. 1A). Unikaj bezpośredniego kontaktu z zarodkiem. Używaj elektrod bipolarnych, w których materiałem elektrody jest platyna-iryd. Dostosuj odstęp między końcówkami do 0,5 mm za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą stymulatora prądu/napięcia pulsuj 20 razy przy napięciu 50 V przez 1 ms w odstępach 1 s.</li>
	<li>Po elektroporacji dodaj jedną kroplę PBS na odsłonięty obszar. Delikatnie wyjmij elektrodę i wyczyść ją chusteczką laboratoryjną i 70% etanolem. Zamknij okno, odsłaniając zarodek taśmą.</li>
	<li>Oznacz skorupkę jajka typem wstrzykniętego plazmidu i datą wylęgu.</li>
	<li>Umieść jaja z powrotem w inkubatorze oknem do góry. Inkubować w temperaturze 38 °C przy wilgotności 50%, aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju.</li>
	<li>Jeśli wektor tet-on jest elektroporowany w celu czasowej kontroli ekspresji genów, należy stosować doksycyklinę (Dox) co 24 godziny w celu wywołania ekspresji genu (patrz punkt 6).</li>
</ol>
6. Tet-on System do czasowej kontroli ekspresji genów
<ol>
	<li>Użyj następujących plazmidów: 
	pCAGGS-T2TP: transpozaza eksprymująca plazmid. 
	pT2K-CAGGS-rtTA-M2: plazmid, który stabilnie wyraża białko wiążące Dox. 
	pT2K-BI-TRE-EGFP: plazmid, który zawiera dwukierunkową ekspresję reportera EGFP napędzającą tet-on promotor (TRE) i drugi gen będący przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Powyższe trzy plazmidy muszą być współelektroporowane w stosunku 1:1:1.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego:
	<ol>
		<li>Rozpuścić Dox w sterylnym PBS, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aplikacja Dox:
	<ol>
		<li>Aby wywołać ekspresję interesującego genu na określonych etapach rozwoju, należy stosować Dox co 24 godziny.</li>
		<li>Podczas aplikacji Dox należy wyjąć jajko, otworzyć okienko, odpipetować 50 μl Dox na błonę kosmomówczwo-alogonową, zamknąć okienko i włożyć jajko z powrotem do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przygotowanie obszaru preparacyjnego dla wycinków pnia mózgu
UWAGA: Następujące sekcje (7 - 9) i procedury zostały opublikowane wcześniej14. Zapoznaj się z tymi odniesieniami, aby uzyskać dodatkowe informacje wizualne.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór agaru (40 mg/ml agarozy, tj. 4% w ddH2O). Wlej roztwór agaru na szalkę Petriego i pozwól mu zestalić się w temperaturze pokojowej. Przechowuj przykrytą płytkę agarową w lodówce do wykorzystania w przyszłości podczas krojenia tkanki pnia mózgu.</li>
	<li>Ciągłe bąbelkowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) o zawartości 95%O2 i 5% CO2 (pH 7,2-7,4 i osmolarność: 295-310 mOsm/L).</li>
	<li>Oczyść obszar roboczy i wibratom 70% EtOH i opłucz ostrze wodą destylowaną.</li>
	<li>Umieść czystą podkładkę absorpcyjną płynów na obszarze roboczym za pomocą odpowiednich narzędzi preparacyjnych.</li>
	<li>Wyjmij płytkę agarową z lodówki, pokrój małą kostkę agarową (10 mm x 10 mm x 8 mm). Przyklej blok agaru do etapu komory krojenia wibratomu za pomocą dostępnego w handlu kleju superglue.</li>
</ol>
8. Izolacja słuchowego pnia mózgu kurczaka
<ol>
	<li>Otwórz jajko w miejscu zaklejonym taśmą okna. Nakłuć worek błonowy skalpelem i usunąć głowę zarodka kurczaka.</li>
	<li>Odetnij głowę kurczaka ostrymi nożyczkami.</li>
	<li>Umieść końcówkę żyletki nieco z tyłu od oczu. Naciąć czaszkę na linii środkowej rostralno-ogonowej. Zastosuj lekki nacisk w zależności od wieku zarodka. Starsze zarodki wymagają większego nacisku.</li>
	<li>Delikatnie odsuń na bok skórę i pióra, aby odsłonić czaszkę i sprawdzić cięcie w linii środkowej.</li>
	<li>Wywierając silny nacisk, przetnij rostralną część czaszki żyletką. Natychmiast umieść ostrze z tyłu oczu i przetnij całą czaszkę i tkankę mózgową.</li>
	<li>Wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej nożyczkami w okolicy ogonowej czaszki, nieco przed mięśniami szyi po obu stronach głowy. Odsłoń mózg i móżdżek, odciągając czaszkę i nadmiar tkanki.</li>
	<li>Przetnij nożyczkami tkankę przyczepioną do pnia mózgu i usuń pień mózgu, który swobodnie odrywa się od czaszki.</li>
</ol>
9. Przygotowanie wycinków pnia mózgu do elektrofizjologii in vivo lub obrazowania
<ol>
	<li>Przypnij pień mózgu przez tektę optyczną.</li>
	<li>Usuń móżdżek, przecinając szypułki nożyczkami, odsłaniając podłogę czwartej komory.</li>
	<li>Za pomocą pęsety usuń wszelkie błoniaste tkanki i naczynia krwionośne z powierzchni pnia mózgu.</li>
	<li>Aby zablokować pień mózgu, wykonaj poziome cięcie na najbardziej rostralnym końcu podłogi czwartej komory, tuż doogonowo do kory. Wykonuj boczne nacięcia prostopadle przez tektę optyczną, aby odizolować pień mózgu.</li>
	<li>Umieść niewielką ilość super kleju na stoliku wibratomu bezpośrednio przed blokiem agaru.</li>
	<li>Podnieś pień mózgu przy rdzeniu kręgowym za pomocą pęsety i umieść go na super kleju stroną rostralną do dołu i stroną grzbietową w kierunku ostrza wibratomowego. Usuń nadmiar kleju za pomocą chusteczki laboratoryjnej lub bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Wlej natleniony ACSF do etapu wibratomowego. Ustaw ostrze wibratomu pod kątem 20-22°. Rozpocznij wibratomium przy oscylacji o maksymalnej amplitudzie. Przesuń stolik w górę w kierunku ostrza, tak aby górna część tkanki była równoległa do ostrza.</li>
	<li>Szybko przesuń ostrze w kierunku tkanki pnia mózgu. Znacznie zwolnij ostrze przed kontaktem ostrza z tkanką.</li>
	<li>Pokrój tkankę z najmniejszą możliwą prędkością do przodu. Gdy ostrze znajdzie się w całym przekroju tkanki koronalnej, delikatnie usuń plasterek za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Obniż stopień o 200-300 μm i ponownie pokrój. Powtarzać tę czynność, aż staną się widoczne anatomiczne punkty orientacyjne jąder słuchowych, np. wyraźny grzbietowy/brzuszny obszar neuropilowy NL i przyśrodkowe położenie NM względem NL.</li>
	<li>Ostrożnie utrzymuj plasterki w ACFS. Można to zrobić w temperaturze pokojowej (22° C) lub zbliżonej do fizjologicznych (~41° C) przy użyciu ciepłej kąpieli wodnej. Zwróć uwagę na kolejność krojenia. Pierwszy wycinek odpowiada najbardziej ogonowemu obszarowi tkanki, a ostatni plasterek odpowiada najbardziej rostralnemu obszarowi. Z grubsza reprezentuje to tonotopową organizację słuchowego pnia mózgu, odpowiednio od regionów kodowania o niskiej i wysokiej częstotliwości.</li>
</ol>

<ol><li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664077">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li>
<li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li>
<li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li>
<li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+time+coding+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li>
<li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li>
<li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li>
<li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li>
<li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306(2007).</li>
<li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris%3A+a+light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li>
<li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730(2012).</li>
<li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis%3A+differences+between+low+and+high+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li>
<li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li>
<li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li>
<li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li>
<li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li>
<li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li>
<li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cochlear+potentials+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Elektroporacja in ovo jest metodą ekspresji lub obalania genów będących przedmiotem zainteresowania w celu analizy funkcji genów in vivo 8,9. W zarodku kurczaka jest to innowacyjna metoda ekspresji genów kodowanych plazmidem w różnych obszarach słuchowych pnia mózgu8. Aby zapewnić optymalną ekspresję, wymaganych jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, wstrzykuj tylko zarodki, których otocysty są wyraźnie widoczne. Jeś...

Szybkie kodowanie neuronowe dźwięku jest niezbędne dla normalnych funkcji słuchowych. Obejmują one zdolności lokalizacji dźwięku1, mowę w hałasie, dyskryminację2, oraz rozumienie innych sygnałów komunikacyjnych istotnych dla zachowania3. Analogiczne neurony zlokalizowane w słuchowym pniu mózgu zarówno ptaków, jak i ssaków są wysoce wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronowym4. Należą do nich odpowiednio jądro magnocellularis (NM), jądro blaszkowate (NL) i ich analogi ssaków, przednio-brzuszne jądro ślimaka (AVCN) i przyśrodkowa górna oliwka (MSO), odpowiednio5. Jednak mechanizmy rozwojowe regulujące szybkie kodowanie neuronalne są słabo poznane w słuchowym pniu mózgu. Dlatego korzystne jest badanie konkretnych genów, które są odpowiedzialne za szybkie kodowanie neuronalne, aby lepiej zrozumieć ich ekspresję, regulację i funkcję w rozwoju słuchowym.
Rozwijający się zarodek kurczaka jest skutecznym i dobrze znanym narzędziem badawczym do badania podstawowych biologicznych zagadnień rozwoju układu słuchowego6,7. Ostatnie postępy molekularne pozwoliły odpowiedzieć na te pytania biologiczne w rozwijającym się zarodku kurczaka poprzez ekspresję lub obalanie genów będących przedmiotem zainteresowania w celu analizy funkcji genów in vivo8,9. Badanie regulacyjnej roli określonych genów jest znaczącym postępem w zrozumieniu patologii związanych z deficytami słuchowymi. Tutaj prezentujemy in ovo elektroporację genów kodowanych plazmidem do słuchowego pnia mózgu kurczaka, gdzie zachodzi szybkie neuronalne kodowanie dźwięku10. Celując w słuchowe neuronalne regiony progenitorowe związane z rombomerami 5 i 611,12 (R5/R6), pokazujemy kontrolę przestrzenną transfekcji plazmidu w NM i NL. Ponadto pokazujemy czasową regulację ekspresji poprzez przyjęcie systemu wektorów tet-on. Jest to procedura indukowana lekiem, która wyraża interesujące geny w obecności doksycykliny (Dox)8.

<table><tbody><tr><td>Zapłodnione białe jaja kurze z rogami</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, jedno- lub dwukanałowy</td></tr><tr><td>Stymulator prądu/napięcia</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Igły do strzykawek Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm długości, (opakowanie 5 szt.)</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Seria: Zastosowania ciśnieniowe</td></tr><tr><td>nieelektryczne Mikroelektroda stymulująca</td><td>FHC</td><td></td><td>PBSA1075 PBSA1075</td></tr><tr><td>Zbiornik/regulator powietrza</td><td>NU Usługi</td><td></td> laboratoryjne <td>Suszenie na powietrzu 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma plastikowa</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Hyklalat doksycykliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka na jajka</td><td>Vissani Lodówka</td><td></td> na wino <td>13,3 - 16,1 &deg; C (56-61&deg; F)</td></tr> <tr><td>Inkubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &deg; C (100 &deg; F), ~50% wilgotności</td></tr><tr><td>Luneta preparcyjna</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, mikroskop V8, 50,4X</td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000</td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td> LED <td>Narishige Japonia</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Mikromanipulatory</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Grubościenny borokrzemian (wymiary)</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Igły</td><td>BD Precision Glide&nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Uchwyt na jajka</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Gliniana podstawa również działa</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0,22 &mu; mln</td></tr></tbody></table>

in ovo elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Elektroporacja to metoda, która wprowadza interesujące geny do biologicznie istotnych organizmów, takich jak zarodek kurczaka. Od dawna wiadomo, że zarodek kurczaka jest skutecznym modelem badawczym do badania podstawowych funkcji biologicznych rozwoju układu słuchowego. Ostatnio zarodek kurczaka stał się szczególnie cenny w badaniu ekspresji, regulacji i funkcji genów związanych ze słuchem. Elektroporacja in ovo może być stosowana do celowania w słuchowe obszary pnia mózgu odpowiedzialne za wysoce wyspecjalizowane funkcje słuchowe. Regiony te obejmują jądro wielkokomórkowe kurczaka (NM) i jądro blaszkowate (NL). Neurony NM i NL powstają z odrębnych prekursorów rombomerów 5 i 6 (R5 / R6). Tutaj prezentujemy elektroporację in ovo genów kodowanych plazmidem w celu zbadania właściwości związanych z genami w tych regionach. Pokazujemy metodę przestrzennej i czasowej kontroli ekspresji genów, która sprzyja wzrostowi lub utracie funkcjonalnych fenotypów. Celując w słuchowe neuronalne regiony progenitorowe związane z R5 / R6, pokazujemy transfekcję plazmidu w NM i NL. Czasową regulację ekspresji genów można osiągnąć poprzez przyjęcie systemu wektorów tet-on. Jest to procedura indukowana lekiem, która wyraża interesujące geny w obecności doksycykliny (Dox). Technika elektroporacji in ovo – wraz z testami biochemicznymi, farmakologicznymi i/lub funkcjonalnymi in vivo – zapewnia innowacyjne podejście do badania rozwoju neuronów słuchowych i związanych z tym zjawisk patofizjologicznych.

Wykazujemy tutaj, że elektroporacja in ovo umożliwia ekspresję genów w normalnie rozwijającym się systemie biologicznym. Geny kodowane przez plazmidy są wstrzykiwane ogniskowo do rurki neuralnej nad obszarem R5/R6. Schematyczny przykład rozmieszczenia elektrod i pipety względem ważnych markerów anatomicznych przedstawiono na Rysunku 1A. Prawidłowa lokalizacja wstrzyknięcia plazmidu zostaje potwierdzona 24 h po elektroporacji i pokazana na Rysunku 1B</stro...

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przestrzenna i czasowa kontrola ekspresji genów w pniu mózgu odpowiedzialnym za słuch u kurczaka. Zastosowanie elektroporacji in ovo stanowi innowacyjne podejście do badania rozwoju neuronów słuchowych oraz związanych z nimi zjawisk patofizjologicznych. Procedura ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju układu nerwowego odpowiedzialnego za słuch, takie jak to, w jaki sposób kontrola ekspresji genów sprzyja uzyskaniu lub utracie fenotypu niezbędnego do prawidłowego rozwoju pnia mózgu w obrębie dróg słuchowych.Procedury zaprezentuje doktor Ting Lu, pracownik podoktorski z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy przygotować roztwory plazmidów, dodając 1 µL roztworu Fast Green na każde 7 µL mieszaniny DNA. Następnie wymieszaj roztwory DNA w stosunku 1:1 w celu jednoczesnej elektroporacji wielu plazmidów.Po przygotowaniu roztworu plazmidu, wykonaj pipety za pomocą wyciągacza do mikropipet. Następnie użyj igły strzykawki o rozmiarze 28G, aby napełnić pipetę od 1 do 2 µL roztworu plazmidu. Za pomocą pęsety odłam końcówkę pipety do rozmiaru od 10 do 20 µm i określ wielkość złamania pod mikroskopem, a następnie podłącz pipetę do pikosprzymikacza za pomocą uchwytu do pipet.Przed przystąpieniem do procedury jaja zakupione u lokalnego dostawcy należy przechowywać w lodówce w temperaturze 13°C nie dłużej niż przez pięć dni. Na początek należy zdezynfekować jajo 70% etanolem, a następnie, aby uzyskać właściwe ułożenie zarodka, inkubować jajo na boku w temperaturze 38°C i wilgotności około 50%, co zapewni optymalną żywotność. Po 48 do 52 godzinach inkubacji, gdy jajo osiągnie stadium Hamburgera-Hamiltona około 12 do 13, należy zdezynfekować obszar roboczy oraz wszystkie instrumenty 70% etanolem.Następnie wyjmij jajo z inkubatora, pozostaw je w temperaturze pokojowej i przetrzyj po raz drugi 70% ethanol. Używając iluminatora, zlokalizuj położenie zarodka, widocznego jako ciemny obszar, i zaznacz go ołówkiem, rysując okrąg wokół jego centrum. Wykonaj otwór w tępym końcu jaja za pomocą igły 19-gauge, a następnie zrób drugi otwór w pobliżu narysowanego okręgu na ostrym końcu jaja.Użyj igły o rozmiarze 19G, aby usunąć niewielki fragment zewnętrznej skorupy jaja, a następnie za pomocą pęsety usuń niewielki fragment wewnętrznej błony skorupowej. Następnie wprowadź igłę 19G przymocowaną do strzykawki o pojemności 3 ml przez otwór w tępym końcu jaja i pobierz od 1,5 do 2,5 ml albuminy. Zaklej otwór w tępym końcu jaja kawałkiem taśmy o wymiarach 1 cm na 1 cm, a następnie zaklej wycięty okrąg oraz drugi otwór kawałkiem taśmy o wymiarach 2,5 cm na 4 cm.Używając zakrzywionych nożyczek o krawędzi tnącej 2,5 cm, prowadząc je równolegle do skorupki jaja, wycina się okienko w obrębie zaznaczonego koła. Aby wstrzyknąć plazmid, należy włączyć pikospritzer i ustawić urządzenie tak, aby zastosować ciśnienie 18 PSI przez pięć mikrosekund, a następnie włączyć butlę z powietrzem oraz lampę mikroskopu sekcyjnego. Następnie należy przygotować 30 ml roztworu stokowego zakupionego komercyjnie tuszu indyjskiego (India Ink) w sterylnym PBS.Nabrać roztwór tuszu indyjskiego do strzykawki o pojemności jednego mililitra, następnie przymocować igłę 27G i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które pojawiły się w strzykawce. Aby zwizualizować zarodek, wprowadzić igłę tuż pod błonę żółtka, w odległości około dwóch do trzech milimetrów od zarodka i wstrzyknąć około 0,2 mililitra tuszu indyjskiego. Następnie przenieść jajko z wyciętym okienkiem do uchwytu na jajka, umieszczonego pod mikroskopem sekcyjnym, i przełączyć na najwyższe powiększenie, aby uzyskać najlepszą widoczność miejsca wstrzyknięcia plazmidu.Usuń pęsetą błonę pokrywającą obszar wstrzykiwania. Zlokalizuj otocysty i wykorzystaj je jako punkty orientacyjne do zidentyfikowania pobliskich rombomerów pięciu i sześć, z których wywodzą się nucleus magnocellularis oraz nucleus laminaris. Za pomocą micromanipulatora umieść pipetę zawierającą DNA w rurze nerwowej nad obszarem R5-R6 pomiędzy otocystami.Wstrzyknij DNA do rurki nerwowej za pomocą picospritzera. Aby rozpocząć elektroporację, włącz stymulator napięcia, następnie załóż filtr strzykawkowy 0,22 micron do strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej wcześniej PBS i nanieś jedną lub dwie krople przefiltrowanego PBS na embrion. Następnie, przesuwając mikromanipulatorem elektrodę bipolarą w kierunku embrionu, ustaw elektrodę ujemną nad miejscem wstrzyknięcia, utrzymując elektrodę dodatnią bocznie w stosunku do R5-R6.Za pomocą stymulatora napięcia podaj 20 impulsów o wartości 50 V przez jedną milisekundę w odstępach jednosekundowych. W pobliżu końcówki elektrody pojawią się pęcherzyki powietrza. Po elektroporacji nanieś jedną kroplę PBS na odsłonięty obszar, ostrożnie wyjmij elektrodę i oczyść ją za pomocą chusteczki laboratoryjnej oraz 70% etanolu, a następnie zaklej okienko nad embrionem taśmą.Na koniec należy odnotować typ wstrzykniętego plazmidu oraz datę inkubacji na skorupce jaja, a następnie umieścić jajo w inkubatorze oknem skierowanym do góry. Jaja należy inkubować w temperaturze 38 °C przy 50% wilgotności do momentu osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju. 24 godziny po elektroporacji należy wyjąć jajo z inkubatora, otworzyć okno i przy użyciu stereomikroskopu potwierdzić prawidłową lokalizację wstrzykniętego plazmidu.Jeśli użyto wektorów tet-on, należy nanieść pipetą 50 µL doksycykliny do błony chorioallantoicznej, zamknąć okienko i umieścić jajo z powrotem w inkubatorze. Przedstawione tutaj fotografie przekroju pnia mózgu przygotowanego z zarodka kurczaka w 12. dniu inkubacji zostały wykonane przy użyciu kontrastu interferencyjnego oraz oświetlenia fluorescencyjnego. W przekroju pnia mózgu można rozpoznać nucleus magnocellularis oraz nucleus laminaris.Pod oświetleniem fluorescencyjnym w obu strukturach widoczna jest ekspresja żółtego białka fluorescencyjnego, co potwierdza efektywną przestrzenną ekspresję genów wprowadzonych drogą elektroporacji. Ekspresję genu poddanego elektroporacji można również zaobserwować w przekroju pnia mózgu zawierającym jądro magnocelularne, pobranym od zarodka kurczaka w 18. dniu inkubacji. Przy 80-krotnym powiększeniu, pod oświetleniem w kontraście interferencyjnym, widoczne są klasyczne, bezdendrytyczne ciała komórek.Ciała komórek adendrytycznych wykazują ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego, co dodatkowo dowodzi, że elektroporacja in ovo może indukować ekspresję genów w specyficznych obszarach pnia mózgu odpowiedzialnych za słuch, co umożliwia badania nad rozwojem neuronów słuchowych. Po opanowaniu techniki i przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od dwóch do trzech godzin dla około 12 żywotnych jaj. Po zastosowaniu tej metody można przeprowadzić inne analizy, takie jak badania biochemiczne, farmakologiczne oraz funkcjonalne testy in vitro i in vivo, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób fenotypy ekspresji genów regulują prawidłowy rozwój słuchowych obszarów pnia mózgu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kontrolować ekspresję genów w przestrzeni i czasie w obrębie pnia słuchowego mózgu kurczaka. Elektroporacja in ovo umożliwia genetyczną kontrolę specjalizacji anatomicznych i fizjologicznych, a także ściśle określonych okresów czasu w rozwoju pnia słuchowego mózgu.

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Słuchowy pień mózgu kurczaka składa się z jąder odpowiedzialnych za binauralne przetwarzanie dźwięku. Pojedyncza preparacja w przekroju wieńcowym zachowuje cały układ obwodów, podczas gdy podejście z wykorzystaniem kultur komórkowych zapewnia unikalną możliwość badania rozwoju struktury neuronalnej i funkcji słuchowej na poziomach molekularnym, komórkowym i sieciowym.

Przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Użyliśmy standardowych technik słuchowej reakcji pnia mózgu (ABR) i zastosowaliśmy je do piskląt piskląt, przedwcześnie rozwiniętego ptasiego modelu funkcji słuchowych. Protokół szczegółowo opisuje techniki przygotowania zwierząt i pozyskiwania ABR, wraz z krokami, które mogą przełożyć się na inne modele ptaków lub gryzoni.

Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Poznaj metodę elektroporacji in ovo w słuchowym pniu mózgu kurczaka, umożliwiającą kontrolę ekspresji genów. Technika ta pozwala badać rozwój neuronów słuchowych i zaburzenia związane z układem słuchowym.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Przeglądaj więcej filmów