Name: Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny autofagii poprzez kolokalizację markerów LC3, p62 i LAMP1 przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego w komórkach Jurkat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chciałbym podziękować moim współpracownikom z MilliporeSigma, Philipowi J. Morrisseyowi i Sherree L. Friend, za ich wsparcie i wskazówki przez te wszystkie lata. Chciałbym również podziękować Vidyi Venkatachalam i Bryanowi R. Davidsonowi za ich pomoc w tworzeniu funkcji BDC3 w oprogramowaniu IDEAS, Ryanowi P. Jessupowi za pomoc w edycji tego rękopisu, Raymondowi Kongowi za pomoc w dniu zdjęć oraz specjalne podziękowania dla wizażystki Cynthii Xamonthiene.

<ol><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+should+autophagic+flux+be+assessed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Why should autophagic flux be assessed?</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li>
<li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18425443">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li>
<li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li>
<li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li>
<li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li>
<li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li>
<li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li>
<li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li>
<li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008(2015).</li>
<li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li>
<li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li>
<li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
<li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li>
<li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li>
<li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li>
<li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagy%3A+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li>
<li>IDEAS. <a target="_blank" href="https://www.amnis.com/images/PN_780-00959-00_RevC_IDEAS_User_Manual.pdf">Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2</a>. , (2015).</li>
</ol>

Jestem zatrudniony przez firmę MilliporeSigma, producenta marki Amnis ImageStream, która została wykorzystana w tym badaniu.

Podczas wykonywania tej analizy należy wziąć pod uwagę kilka rzeczy. Ważne jest, aby mieć odpowiednie próbki kontrolne. W tym eksperymencie użyto dwóch różnych grup kontrolnych: Kontrola i Kontrola + Chlorochina. Próba kontrolna została wykorzystana do wyznaczenia progu dla regionów. Reprezentuje podstawowy poziom autofagii bez zatrzymywania degradacji lizosomalnej i jest kontrolą dla próbki głodzonej. Jednak próbka kontrolna nie jest odpowiednią kontrolą do porównania z wynikami próbki głodowej + chlorochiny, ponieważ sama chlorochina wpływa na próbkę kontrolną. W związku z tym konieczne było posiadanie próbki Control + Chlorochina.
Przed wykonaniem jakiejkolwiek analizy autofagii ważne jest, aby analizować/bramkować tylko pojedyncze komórki, które są ostre (tj. gradient RMS większy niż 60), ponieważ wyniki mogą ulec pogorszeniu, jeśli jest więcej niż jedna komórka lub obrazy są nieostre. Bardzo ważne jest, aby autofagosomy i lizosomy były w centrum uwagi dla prawidłowego zliczania plamek i analizy BDC3. Komórki apoptotyczne muszą zostać usunięte przed analizą autofagii, ponieważ mogą zniekształcić wyniki i nie powinny być uwzględniane. Powinno być odpowiednie barwienie dla wszystkich trzech markerów (tj. LC3, p62 i LAMP1). Na przykład wszystkie trzy markery są wewnątrzkomórkowe i powinny mieć sygnał punktowy; Jeśli sygnał nie jest punktowy lub jeśli znajduje się na powierzchni komórki, barwienie nie byłoby odpowiednie i eksperyment/barwienie powinno zostać powtórzone. Ponadto, aby BDC3 był dokładny, konieczne jest skupienie się na komórkach, które są jasne dla wszystkich trzech interesujących markerów fluorescencyjnych. Bramkowanie w przypadku pozytywnych zdarzeń jest konieczne, aby zapobiec pomiarowi BDC3 na niespecyficznym wiązaniu, artefaktach obrazowania i/lub szumie. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ BDC3 może potencjalnie wzmacniać artefakty, które nie są prawdziwymi sygnałami. Ponieważ BDC3 można wykonać tylko w przypadku jasnych dodatnich zdarzeń, wiele komórek może nie zostać uwzględnionych w końcowej analizie; jest to szczególnie prawdziwe w przypadku komórek kontrolnych, które nie mają żadnej akumulacji LC3, p62 i / lub LAMP1. Tak więc ograniczeniem tego testu jest to, że BDC3 bada tylko komórki, które są dodatnie dla wszystkich trzech markerów, co może nie być odpowiednie dla wszystkich eksperymentów z autofagią.
Podobnie jak BDS, który został wcześniej opisany 15,16,17,20,21,22,23,24,25,26, sam BDC3 nie bierze pod uwagę liczby organelli autofagii, które kolokalizują, co powoduje dużą zmienność liczby autofagosomów. W związku z tym zastosowano podejście dwuwymiarowe zaprezentowane przez Rajana i wsp. Patrząc na wykresy dwuwymiarowe, można zapytać, czy komórki muszą być dodatnie dla LC3, p62 i LAMP1; Dlaczego jest tak wiele komórek, które mają plamki 0? Dzieje się tak dlatego, że sygnał LC3 może być wystarczająco jasny do kolokalizacji, ale może nie spełniać progu ustawionego przez maskę piku (Szczyt (M11, Ch11-LC3-AF647, Jasny, 4)) niezbędnego do uznania go za plamkę.
Przedstawiony tutaj protokół wykorzystywał MIFC do liczenia LC3 puncta i kolokalizacji trzech markerów autofagii do pomiaru strumienia autofagicznego. W warunkach podstawowych (próbka kontrolna) liczba autofagosomów była niska, a w niewielu komórkach znaleziono "wysokie punkty". Po dodaniu chlorochiny, która hamuje fuzję autofagosomu / lizosomów, nastąpił wzrost liczby plamek LC3. Ponieważ lizosom nie jest w stanie rozbić autofagosomu i p62, który znajduje się w autofagosomie, prowadzi to do wzrostu kolokalizacji akumulacji autolizosomów LC3, p62 i LAMP1. Efekt ten został wzmocniony pod wpływem głodu składników odżywczych, co indukuje autofagię. Jednak bez dodatku chlorochiny nie nastąpił znaczący wzrost liczby autofagosomów, najprawdopodobniej ze względu na wzrost tempa obrotu autofagicznego. Kiedy komórki były głodzone w obecności chlorochiny, nastąpił wzrost kolokalizacji i liczby autofagosomów, co potwierdza wniosek, że głód zwiększa przepływ autofagiczny. EBSS jest znany jako silny induktor autofagii. W związku z tym oczekuje się, że wzrost będzie duży. Jeśli do indukcji autofagii stosuje się inną metodę, taką jak indukcja leku, różnica między próbkami kontrolnymi a leczonymi może być subtelniejsza.
Ten konkretny protokół został zaprojektowany do pomiaru autofagii w ludzkich liniach komórkowych, ale test można dostosować do innych gatunków, przełączając się na przeciwciała dla tego konkretnego gatunku. Ponadto metoda analizy może być stosowana do każdego zastosowania wewnątrzkomórkowego, które wymaga kolokalizacji trzech sond/markerów.

Makroautofagia, zwana dalej autofagią, to szlak kataboliczny, w którym uszkodzone lub dysfunkcyjne składniki, długożyciowe białka i organelle są degradowane przez lizosom i poddawane recyklingowi1. Autofagia to dynamiczny, wieloetapowy proces, który polega na tworzeniu autofagosomu; fuzja autofagosomu z lizosomem, tworząc autolizosom; oraz degradacja zawartości autolizosomu2. Kluczowym markerem biologicznym używanym do identyfikacji autofagii w systemach ssaków jest białko związane z mikrotubulami 1A/1B-łańcuch lekki 3 (LC3), które tworzy błonę autofagosomalną. Podczas autofagii cytozolowy LC3-1 jest sprzężony z fosfatydyloetanoloaminą, tworząc LC3-II; LC3-II jest następnie włączany do błony autofagosomalnej3. Innym szeroko stosowanym markerem strumienia autofagicznego jest sekwestrosom receptora autofagii 1 (SQSTM1, p62), który fizycznie łączy ładunek autofagiczny z błoną autofagiczną4,5.
Metody, które tradycyjnie były używane do pomiaru autofagii, to Western blot i mikroskopia fluorescencyjna7. Jednak żadna z tych metod nie jest uważana za "złoty standard"2,6, ponieważ istnieją wyzwania związane z obiema tymi technikami. Western blot daje tylko średnią, ponieważ używa jednorodnej próbki, więc obserwatorzy nie mogą zobaczyć, co dzieje się w poszczególnych komórkach. Z drugiej strony, mikroskopia fluorescencyjna dostarcza obserwatorowi informacji na poziomie pojedynczej komórki, ale brakuje jej możliwości przepustowych, co utrudnia uzyskanie obiektywnych i statystycznie rygorystycznych ocen. W ostatnich latach pomiar LC3 i p62 za pomocą obrazowania wielospektralnego cytometrii przepływowej (MIFC, patrz tabela materiałów) zyskuje na popularności ze względu na jego moc ilościową, wysokie możliwości przepustowe, potencjał multipleksowania i możliwość obrazowania każdej komórki. Jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru autofagii za pomocą MIFC, wraz z towarzyszącym mu oprogramowaniem do analizy (patrz Tabela materiałów), jest punktowe zliczanie LC3 puncta lub autofagosomów8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Jednak wzrost autofagosomów nie musi oznaczać, że następuje wzrost autofagii, ponieważ może to również stanowić blokadę w procesie2. Obrót LC3-II jest użytecznym parametrem do pomiaru strumienia autofagicznego poprzez analizę komórek w obecności i bez lizosomowego inhibitora degradacji, takiego jak chlorochina. Chlorochina hamuje fuzję autofagosomu z lizosomem, umożliwiając w ten sposób ilościowe określenie powstawania autofagosomu jako miary stopnia autofagii poprzez zatrzymanie strumienia autofagicznego, zanim dojdzie do degradacji lizosomalnej18. Ponadto p62 jest degradowany głównie przez autofagię, a jeśli lizosomalna degradacja autofagosomu i jego zawartości jest zablokowana, oczekuje się akumulacji p62 17,19.
Autofagia jest procesem wieloetapowym, a sam pomiar LC3 lub p62 nie daje pełnego obrazu tego, co dzieje się w komórkach. Ostatnie publikacje podkreśliły potrzebę zbadania jednoczesnego powstawania autolizosomu2,17,20,21. MIFC jest wyjątkowo zdolny do pomiaru powstawania autolizosomu poprzez obrazowanie kolokalizacji autofagosomu do lizosomu 15-17,20,21,22,23,24,25,26. Ponadto zbadano kolokalizację p62 i LC3 za pomocą MIFC w celu pomiaru strumienia autofagicznego5. W oprogramowaniu do analizy, do którego się odwołujemy, "cecha" mierząca kolokalizację nazywa się "Bright Detail Similarity R3" (BDS) i została specjalnie zaprojektowana do porównywania małych, jasnych szczegółów obrazu na dwóch obrazach. BDS jest przekształconym logarytmicznie współczynnikiem korelacji Pearsona zlokalizowanych jasnych punktów o promieniu 3 pikseli lub mniejszym; innymi słowy, BDS oblicza stopień nakładania się pikseli z dwóch różnych kanałów fluorescencyjnych. Jasne plamy są albo skorelowane (tj. ta sama lokalizacja przestrzenna), albo nieskorelowane (tj. różne lokalizacje przestrzenne). W związku z tym współczynnik korelacji waha się od 0 (nieskorelowany) do 1 (korelacja doskonała). Współczynnik jest przekształcany logarytmicznie w celu zwiększenia zakresu od zera do nieskończoności26,27. Sam BDS może nie wystarczyć; Rajan i in. stwierdzili, że używanie tylko BDS może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych21. BDS ocenia kolokalizację dwóch markerów autofagii, ale nie bierze pod uwagę liczby autofagosomów. Aby uwzględnić liczbę autofagosomów, Rajan i in. uwzględnili zliczanie punktowe LC3 puncta21. Rajan i in. zaproponowali użycie dwuwymiarowego wykresu punktowego liczby plamek LC3 w porównaniu z BDS. Korzystając z tego wykresu dwuwymiarowego, najpierw zidentyfikowano dwie populacje: jedną z komórkami, które mają wysoki poziom plamek LC3, a drugą z komórkami, które mają niski poziom plamek LC3. Populacja plamkowa o wysokiej LC3 została następnie sklasyfikowana na dwie populacje: komórki o niskiej kolokalizacji (tj. akumulacji autofagosomów) i komórki o wysokiej kolokalizacji (tj. akumulacji autolizosomów). Ten wykres dwuwymiarowy pozwala odróżnić komórki z bardzo małą ilością autofagosomów od komórek z nagromadzeniem autofagosomów i/lub autolizosomów21.
Do tej pory jednoczesna kolokalizacja LC3, p62 i LAMP1 (marker lizosomalny) nie była możliwa przy użyciu pojedynczego "Typu Cechy" w oprogramowaniu do analizy towarzyszącej MIFC (patrz Tabela Materiałów). Jednak nowa funkcja, wprowadzona niedawno w wersji 6.1, nazywa się Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 porównuje jasne obrazy szczegółów z każdego z trzech obrazów (w tym przypadku LC3, p62 i LAMP1) i określa ilościowo kolokalizację trzech sond (tj. LC3, p62 i LAMP1). Funkcja BDC3 oblicza współczynnik korelacji Pearsona zmodyfikowany w celu rozszerzenia na trzy obrazy. Ponieważ jasne punkty na trzech obrazach są albo skorelowane, albo nieskorelowane, współczynnik korelacji waha się od 0 (nieskorelowany) do 1 (korelacja doskonała). Współczynnik jest przekształcany logarytmicznie w celu zwiększenia zakresu dynamicznego od 0 do nieskończoności. Poprzez zamianę funkcji BDS na funkcję BDC3, metoda analizy przedstawiona przez Rajana i wsp. może teraz obejmować trzy najczęściej używane markery do pomiaru autofagii w jednym systemie w tym samym czasie. Zdolność do kolokalizacji tych trzech markerów autofagii w jednym teście może prowadzić do nowych spostrzeżeń na temat indukcji i regulacji autofagii. Poniższy protokół przedstawia kroki indukcji autofagii w komórkach Jurkat; znakować komórki przeciwciałami LC3, p62 i LAMP1; pozyskać dane za pomocą cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego; i przeanalizuj dane, aby ocenić strumień autofagiczny.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 z oznaczeniem Donkey anti-Mouse - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim IgG (H+L) osła, Alexa Fluor 647. Stężenie 2 mg/ml. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>klon H4A3. Koncentracja 400 &mikro; g/ml. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>klon HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD45- PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Klon HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anty-LC3 (Ludzki) klon mAb 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Klon 4E+12.&nbsp; Stężenie 2 mg/ml. https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - Marker autofagosomów (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Klon EPR4844.&nbsp; Stężenie 0,5 mg/ml. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Sól difosforanu chlorochiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Środek czyszczący - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Napełnij pojemnik 200 ml środka czyszczącego.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Napełnij pojemnik 200 ml Debubbler.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ Wolny&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x</td><td>MiliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Wolne&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Roztwór soli 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon surowicy bydlęcej płodu</td><td></td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, bez metanolu, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>To jest to, co jest używane do 4% i 1% formaliny. UWAGA: Formalina/formaldehyd toksyczny przez drogi oddechowe i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Może powodować uczulenie przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Potencjalne zagrożenie rakiem.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, klon E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne 100x</td><td>Hyklon</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Zastosowano 2 kamery ImageStreamX Mark II wyposażone w lasery 405nm, 488nm i 642nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy MIFC - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Oprogramowanie towarzyszące MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp; IDEAS wersja 6.2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MIFC - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Jest to oprogramowanie, które uruchamia MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE wersja 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD107a (LAMP-1) Klon przeciwciała H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Roztwór Penicllin/Streptomycyny/Glutaminy 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Płukanie - Woda ultraczysta lub woda dejonizowana</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Możesz użyć dowolnej wody ultraczystej lub wody dejonizowanej.&nbsp; Napełnij pojemnik 900 ml płukania.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Osłona - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>To jest to samo, co sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1X&nbsp; Ca++MG++ za darmo.&nbsp; Napełnij pojemnik 900 ml pochwy.</td></tr><tr><td>Silikonowane probówki do mikrowirówek polipropylenowych</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Silikonowane mikrowirówki o niskiej retencji Fisherbran 1,5 mL.</td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 Roztwór pirogronianu sodu (100 mM)</td><td>Sterylizator HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>- 0,4 - 0,7% Podchloryn</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Jest to zdecydowanie 10% wybielacz Clorox, który można uzyskać, rozcieńczając wybielacz Clorox wodą.&nbsp; Napełnij pojemnik 200 ml sterylizatora.</td></tr><tr><td>Odczynnik do kalibracji systemu - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Każda probówka mieści ~10 ml.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, detergent PROTEIN GRADE, 10% roztwór, sterylnie filtrowany</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>woda, klasa hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji lc3, p62 i lamp1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autofagia to szlak kataboliczny, w którym normalne lub dysfunkcyjne składniki komórkowe, które gromadzą się podczas wzrostu i różnicowania, są degradowane przez lizosom i poddawane recyklingowi. Podczas autofagii cytoplazmatyczne białko LC3 jest lipidowane i rekrutowane do błon autofagosomalnych. Autofagosom następnie łączy się z lizosomem, tworząc autolizosom, w którym następuje rozpad pęcherzyka autofagosomu i jego zawartości. Białko p62 związane z ubikwityną, które wiąże się z LC3, jest również wykorzystywane do monitorowania strumienia autofagicznego. Komórki poddawane autofagii powinny wykazywać kolokalizację p62, LC3 i markerów lizosomalnych. Mikroskopia immunofluorescencyjna została wykorzystana do wizualnej identyfikacji LC3 puncta, p62 i / lub lizosomów w przeliczeniu na komórkę. Jednak uzyskanie obiektywnej i statystycznie rygorystycznej oceny może być trudne. Aby przezwyciężyć te problemy, zastosowano wielospektralną cytometrię przepływową wraz z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów z trzech markerów autofagii (LC3, p62 i lizosomalnej LAMP1) i określa ilościowo ich kolokalizację, w połączeniu z liczeniem plamek LC3 w celu pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ta metoda analizy wykorzystuje wiele cech do oceny strumienia autofagii. Aby w pełni zrozumieć końcowy wykres dwuzmienny, należy najpierw zbadać poszczególne cechy analizy. Zliczanie autofagosomów jest logicznym sposobem pomiaru autofagii; jednak wielkość, kształt i jasność punktów LC3 mogą się drastycznie różnić między komórkami. Ta zmienność może utrudnić ręczne zliczanie autofagosomów lub korzystanie z funkcji zliczania punktów w oprogramowaniu analitycznym. W związku z tym żadna funkcja zliczania punktów nie będzie idealna ze względu na tę dużą zmienność autofagosomów. Niemniej jednak, dobra funkcja zliczania punktów będzie działać w większości komórek26. Rysunek 3 przedstawia przykłady maskowania punktów LC3 w komórkach Jurkat przy użyciu różnych masek punktowych. Funkcja zliczania punktów wybrana dla tego zestawu danych to Spot Count_Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)_4, co oznacza, że funkcja ta zliczyła punkty zidentyfikowane przez maskę szczytową (peak mask) w domyślnej masce kanału 11 (M11) w kanale 11 (Ch11-LC3-AF647) przy stosunku jasności punktu do tła komórki wynoszącym 4 (Bright, 4). Rysunek 4 przedstawia histogramy zliczania punktów oraz reprezentatywne obrazy dla średniej liczby punktów w komórkach Jurkat w grupach: Kontrolnej, Kontrolnej + Chloroquina, Głodzonych oraz Głodzonych + Chloroquina, znakowanych przeciwciałem anti-LC3-AF647. Średnie liczby punktów w grupie Kontrolnej i Głodzonej nie różnią się znacząco; po dodaniu chloroquiny występuje duża różnica w średniej grupy Kontrolna + Chloroquina w porównaniu do grupy Głodzone + Chloroquina.
Kolejną cechą do zbadania jest BDC3. BDC3 jest pomiarem kolokalizacji trzech markerów/sond, w tym przypadku LC3, p62 i LAMP1. Rycina 5A-5D przedstawia histogramy BDC3 dla komórek Jurkat w grupach: kontrolnej, kontrolnej + chlorochina, głodzonej oraz głodzonej + chlorochina, znakowanych przeciwciałami anti-p62-AF488, anti-LAMP1-PE i anti-LC3-AF647. Widoczne jest przesunięcie między średnią dla grupy kontrolnej a średnią dla grupy głodzonej, a także między średnią dla grupy kontrolnej + chlorochina a średnią dla grupy głodzonej + chlorochina. Jednak analiza obrazów komórek o średnich wynikach BDC3 na Rycini 5E-5H wykazuje większe różnice między próbkami, niż mogłyby sugerować histogramy. Wynika to z faktu, że BDC3 nie uwzględnia liczby kolokalizujących organelli autofagii, co prowadzi do znacznej zmienności liczby autofagosomów przy tym samym wyniku BDC3. W większości przypadków występuje nakładanie się wszystkich trzech sond, ponieważ nawet na poziomach podstawowych p62, LAMP1 i LC3 powinny w pewnym stopniu kolokalizować lub znajdować się w podobnych regionach komórek. Dla kontrastu, przykładem trzech sond, które nie powinny kolokalizować, są anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 oraz barwnik jądrowy DAPI dla próbki głodzonej + chlorochina, przedstawiony na Rycini 6.
Po połączeniu funkcji liczenia punktów (spot-count) i funkcji BDC3, widoczne staje się istnienie różnych subpopulacji, co poprawia zdolność do rozróżniania poszczególnych próbek/warunków. Rysunek 7 przedstawia wykres dwuwymiarowy liczby punktów LC3 w stosunku do BDC3 p62/LAMP1/LC3 dla czterech próbek: Kontrolnej, Kontrolnej + Chloroquina, Głodzonej oraz Głodzonej + Chloroquina. Próbka Kontrolna została wykorzystana do ustalenia strategii bramkowania dla trzech populacji: Low Spots, High Spots/Low BDC3 oraz High Spots/High BDC3. Próbki Kontrolne wykazały, że ponad 98% komórek posiadało 1 lub mniej punktów. Granica między populacjami High Spots/Low BDC3 a High Spots/High BDC3 została ustalona na poziomie wyniku BDC3 równym 1, ponieważ ponad 91% próbki Kontrolnej miało wynik BDC3 mniejszy niż 1. Podsumowanie wyników dla wykresów dwuwymiarowych przedstawiono w Tabeli 1.
<img alt="Panel sterowania cytometrii przepływowej; ustawienia intensywności fluorescencji; ładowanie próbek; interfejs akwizycji danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ustawienia instrumentu MIFC. Zrzut ekranu ustawień instrumentu MIFC wykorzystanych w tym eksperymencie, opisanych w kroku 8 protokołu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej; wykresy i histogramy; dane o populacjach komórek; intensywność fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia bramkowania w oprogramowaniu analitycznym. Zrzut ekranu schematu bramkowania w oprogramowaniu analitycznym, opisany w kroku 9 protokołu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii konfokalnej, analiza fluorescencji komórkowej w badaniu lokalizacji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Maskowanie punktów LC3. Obrazy komórek Jurkat i maski użyte do stworzenia cechy liczby punktów. Przedstawiono obrazy BrightField (BF), LC3-AF647, Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,2), Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,4), Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,5), Spot(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,5,3,1) oraz Spot(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,6,2,1). Maską, która zadziałała najlepiej dla wszystkich pokazanych komórek, była Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,4). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkłady liczby punktów LC3; wykresy (A-D) i obrazy mikroskopowe (E-H) grupy kontrolnej w porównaniu z chlorochiną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Histogramy liczby punktów LC3. Zastosowanie funkcji zliczania punktów Spot Count_Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)_4 i histogramy liczby punktów LC3-AF647 dla grupy kontrolnej (A, jasnoniebieski), kontrolnej + chlorochina (B, niebieski), głodzonej (C, różowy) oraz głodzonej + chlorochina (D, czerwony). Średnia liczba punktów dla grupy kontrolnej, kontrolnej + chlorochina, głodzonej oraz głodzonej + chlorochina wynosi odpowiednio 0,07, 1,13, 0,10 i 2,77. Przedstawiono obrazy BF, LC3-AF647 (czerwony), barwnik jądrowy DAPI (niebieski) oraz obraz kompozytowy LC3-AF647 i DAPI reprezentatywnych komórek dla średniej liczby punktów dla grupy kontrolnej (E, 0 punktów), kontrolnej + chlorochina (F, 1 punkt), głodzonej (G, 0 punktów) oraz głodzonej + chlorochina (H, 3 punkty). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy analizy autofagii przedstawiające częstotliwość BDC3 p62/LAMP1/LC3 oraz obrazy mikroskopowe z chlorochiną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Histogramy BDC3 dla p62/LAMP1/LC3. Histogramy BDC3 p62/LAMP1/LC3 dla grupy kontrolnej (A, jasnoniebieski), kontrolnej + chlorochina (B, niebieski), głodzonej (C, różowy) oraz głodzonej + chlorochina (D, czerwony). Średnie wyniki BDC3 dla grupy kontrolnej, kontrolnej + chlorochina, głodzonej i głodzonej + chlorochina wynoszą odpowiednio 0,57, 0,82, 0,74 i 0,98. Przedstawiono obrazy BF; p62-AF488 (zielony); LAMP1-PE (żółty); LC3-AF647 (czerwony) oraz obraz złożony z p62-AF488, LAMP1-PE i LC3-AF647 dla reprezentatywnych komórek odpowiadających średniej BDC3 dla grupy kontrolnej (E), kontrolnej + chlorochina (F), głodzonej (G) oraz głodzonej + chlorochina (H). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza markerów autofagii; wykres stosunku BDC3 p62/LC3/DAPI, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Histogramy BDC3 dla p62/LC3/DAPI dla próbki głodzonej z dodatkiem chlorochiny. (A) Przedstawiono histogram BDC3 p62/LC3/DAPI dla próbki głodzonej z dodatkiem chlorochiny. Średni wynik BDC3 wynosi 0,07. (B) Przedstawiono BF; p62-AF488 (zielony); LC3-AF647 (czerwony); DAPI (niebieski) oraz obraz kompozytowy p62-AF488, LC3-AF647 i DAPI reprezentatywnych komórek dla średniej wartości BDC3 dla próbki głodzonej z dodatkiem chlorochiny. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dane dotyczące autofagii komórkowej; wykresy punktowe; liczba punktów LC3; analiza BDC3 i p62/LAMP1/LC3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Wykresy dwumianowe liczby punktów LC3 w stosunku do BDC3 p62/LAMP1/LC3. (A) Wykresy dwumianowe liczby punktów LC3 w stosunku do BDC3 p62/LAMP1/LC3 dla komórek Jurkat w grupach: Kontrola, Kontrola + chlorochina, Głodzone i Głodzone + chlorochina. (B) Przedstawiono obrazy BF; p62-AF488 (zielony); LAMP1-PE (żółty); LC3-AF647 (czerwony) oraz obraz kompozytowy p62-AF488, LAMP1-PE i LC3-AF647 z trzech regionów (tj. mała liczba punktów, duża liczba punktów/niski BDC3 oraz duża liczba punktów/wysoki BDC3) dla próbki Głodzone + chlorochina. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td>Liczba komórek</td>
			<td>Średnia kolokalizacji Bright Detail Colocalization 3</td>
			<td>Średnia liczba punktów LC3</td>
			<td>% niskich punktów</td>
			<td>% wysokich punktów/niskiego BDC3</td>
			<td>% wysokich punktów/wysokiego BDC3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Kontrola</td>
			<td>439</td>
			<td>0.57</td>
			<td>0.07</td>
			<td>98.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>0.0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Kontrola + chlorochina</td>
			<td>1432</td>
			<td>0.82</td>
			<td>1.13</td>
			<td>68.9</td>
			<td>19.5</td>
			<td>11.7</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Głodzone</td>
			<td>1204</td>
			<td>0.74</td>
			<td>0.10</td>
			<td>98.4</td>
			<td>0.6</td>
			<td>1.0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Głodzone + chlorochina</td>
			<td>1811</td>
			<td>0.98</td>
			<td>2.77</td>
			<td>32.1</td>
			<td>36.9</td>
			<td>31.0</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Podsumowanie liczby plamek LC3 w komórkach Jurkat w stosunku do dwumianowego wykresu BDC3 p62/LAMP1/LC3

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe określenie kolokalizacji trzech markerów autofagii wraz z kwantyfikacją punktów LC3 w celu pomiaru autofagii w sposób obiektywny, ilościowy i statystycznie wiarygodny. Metoda ta pozwala na pomiar kolokalizacji trzech markerów autofagii w ramach jednego testu, co może prowadzić do nowych spostrzeżeń w zakresie indukcji i regulacji autofagii. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego pomiaru trzech markerów autofagii w sposób obiektywny, ilościowy i statystycznie wiarygodny.Zacznij od dodania 2×10⁶ komórek Jurkat do poszczególnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, oznakowanych odpowiednimi nazwami próbek. Następnie dodaj do każdej probówki wystarczającą ilość buforu do mycia, aby uzyskać końcową objętość 15 ml dla każdej próbki, a następnie odwirowuj próbki w celu uzyskania osadu. Resuspenduj osady w 100 µl 4% formaliny, po czym przenieś próbki do oznakowanych, silikonizowanych polipropylenowych probówek do mikrowirowania.Po 10 minutach w temperaturze pokojowej przemyj próbki w jednym mililitrze świeżego buforu do płukania. Ponownie zawieś osady w 100 µl pierwszego przeciwciała w buforze do permeabilizacji i inkubuj przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj znakowane i permeabilizowane komórki w jednym mililitrze świeżego buforu do permeabilizacji, a następnie znakuj je kolejnym przeciwciałem w sposób przedstawiony powyżej.Po oznakowaniu wszystkich próbek końcowym przeciwciałem, ponownie zawiesić osady w 1% roztworze formaliny, a następnie dodać 10 µL 10x barwnika jądrowego DAPI. Pomieszać komórki za pomocą lekkiego wstrząsania w wirówce (vortex), a następnie inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Po zakończeniu inkubacji wczytać domyślny szablon do wielospektralnego cytometru przepływowego z obrazowaniem i wybrać odpowiednie lasery.Wprowadź żądaną moc lasera w oknie obok każdego przycisku lasera, a następnie kliknij przycisk załaduj, aby wprowadzić probówkę o pojemności 1,5 milliliter do urządzenia. Utwórz wykres kropkowy area M01 względem aspect ratio M01 dla całej populacji i wyznacz obszar wokół komórek. Nazwij ten obszar Cell.Ustaw parametry akwizycji. Określ folder docelowy oraz nazwę pliku i zmień liczbę zdarzeń na 5 000, następnie wybierz populację komórek i kliknij „acquire”, aby pobrać plik; pozostałe próbki analizuj w ten sam sposób, stosując te same ustawienia laserów. Po zakończeniu zbierania danych kliknij „return”, aby wycofać probówkę z próbką.Aby przeanalizować dane z multispektralnej obrazującej cytometrii przepływowej, kliknij „start analysis”, aby uruchomić kreator otwierania plików w oprogramowaniu do analizy obrazów, a następnie kliknij ikonę kreatora apoptozy oraz przycisk „select wizard”, aby otworzyć kreator apoptozy. Po usunięciu wszystkich komórek apoptotycznych z analizy, wyznacz obszar wokół komórek nieapoptotycznych i oznacz tę populację jako „cells”. Następnie kliknij ikonę bloków budulcowych.Wybierz fluorescencyjne próbki pozytywne dla jednego koloru, następnie wybierz populację komórek i intensywność kanału MC trzy. Oznacz oś X jako intensywność lampy jeden i wyznacz obszar obejmujący komórki o intensywności większej niż 10 000. Oznacz ten obszar jako lampa jeden pozytywna.Po wyznaczeniu bramki dla komórek pozytywnych pod kątem P62 i LC3 w ten sam sposób, kliknij kartę analizy i wybierz maskę. Kliknij nowa, a następnie funkcja. W sekcji funkcja wybierz szczyt.W sekcji maska (mask) wybierz M11. W sekcji kanał (channel) wybierz kanał 11. Ustaw stosunek sygnału z plamki do tła komórki (spot to cell background ratio) na cztery.Następnie kliknij OK, aby zamknąć okno funkcji definiowania maski, a następnie OK, aby dodać maskę do listy masek. Kliknij Zamknij, aby wyjść z menedżera masek, po czym ponownie kliknij kartę Analiza i wybierz Cechy. Kliknij Nowy.W polu typ cechy (feature type) wybierz liczbę plamek (spot count), a następnie wybierz nowo utworzoną maskę piku. Jako nazwę wprowadź spot count LC3 i kliknij OK. Ponownie kliknij nowy (new).W polu typ funkcji wybierz kolokalizację jasnych szczegółów trzy lub BDC3. W polu maska wybierz MC. W polu obraz jeden wybierz kanał dwa dla P62. W polu obraz dwa wybierz kanał trzy dla lampy jeden.Pod obrazem trzy wybierz kanał 11 dla LC3. W polu nazwy wprowadź BDC3p62/LAMP1/LC3, a następnie kliknij OK oraz Zamknij, aby wyjść z menedżera funkcji. Kliknij ikonę nowego wykresu rozproszonego i wybierz populację LAMP1-dodatnią, p62-dodatnią i LC3-dodatnią.Wybierz BDC3/p62/LAMP1/LC3 dla osi X oraz funkcję liczby plamek (spot count) LC3 dla osi Y i kliknij OK. W menu plików wybierz opcję zapisu pliku analizy danych, a następnie kliknij zapisz i tak, aby zapisać dane z grupy głodzonej z dodatkiem chlorochiny jako plik analizy danych i zastąpić poprzednią wersję pliku. Następnie otwórz plik kontrolny i wybierz odpowiednią macierz kompensacyjną oraz plik analizy danych grupy głodzonej z dodatkiem chlorochiny jako szablon.Kliknij OK. Aby utworzyć obszary dla akumulacji autofagosomów i akumulacji autolizosomów, otwórz próbkę kontrolną i narysuj prostokątny obszar od współrzędnych osi X 0,1 do 3 oraz współrzędnych osi Y 1,5 do 0,3. Nazwij ten obszar low spots.Następnie zaznacz obszar od współrzędnych 0,1 do 1 na osi X oraz od 17,5 do 1,5 na osi Y i nazwij ten obszar „high spot low BDC3”, a następnie zaznacz obszar od współrzędnych 1 do 3 na osi X oraz od 17,5 do 1,5 na osi Y i nazwij ten obszar „high spots/high BDC3”. Zapisz plik kontrolny, aby mógł służyć jako szablon, a następnie otwórz pozostałe pliki, w tym plik „starved plus chloroquine”, wykorzystując plik kontrolny jako szablon, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Rozmiar, kształt i jasność punktów LC3 mogą znacznie różnić się pomiędzy komórkami, co widać na tych maskach punktów LC3 w komórkach Jurkat przy zastosowaniu różnych masek punktowych.Maską, która sprawdziła się najlepiej w tym eksperymencie, była maska szczytowa (peak) z zastosowaniem stosunku sygnału plamki do tła komórkowego wynoszącego cztery. W tych reprezentatywnych obliczeniach liczby plamek w komórkach Jurkat znakowanych przeciwciałami anty-LC3, średnie liczby plamek dla grupy kontrolnej i grupy głodzonej nie różnią się znacząco. Po dodaniu chlorochiny obserwuje się dużą różnicę w średniej dla grupy kontrolnej z chlorochiną w porównaniu do średniej dla grupy głodzonej z chlorochiną.W tym eksperymencie zaobserwowano przesunięcie między średnią kolokalizacji BDC3 dla grupy kontrolnej a średnią dla grupy głodzonej, a także między średnią dla grupy kontrolnej z chlorochiną a średnią dla grupy głodzonej z chlorochiną. BDC3 nie uwzględnia liczby kolokalizujących się organelli autofagii, co skutkuje dużym stopniem zmienności liczby autofagosomów przy tym samym wyniku BDC3. Rzeczywiście, w większości przypadków występuje nakładanie się wszystkich trzech sond, ponieważ nawet na poziomach Beyza p62, LAMP1 i LC3 powinny w pewnym stopniu kolokalizować w podobnych obszarach komórek.Dla kontrastu, oto przykład cechy BDC3 dla trzech sond, które nie powinny kolokalizować: P62, LC3 i DAPI. Gdy liczba plamek zostanie połączona z cechami BDC3, staje się oczywista obecność różnych subpopulacji, co poprawiło zdolność rozróżniania poszczególnych próbek i warunków.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w około osiem godzin. Jeśli jednak wymagana jest inna funkcja zliczania plamek, konieczny będzie dodatkowy czas na analizę. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie o zastosowaniu odpowiednich kontroli.Na przykład należy wykorzystać próbkę kontrolną do ustalenia progów poziomu Beyza, a próbkę kontrolną z chlorochiną jako kontrolę dla próbki głodzonej z chloroquiną. Niniejszą procedurę można zastosować również w innych zastosowaniach wewnątrzkomórkowych wymagających kolokalizacji trzech różnych markerów, zmieniając po prostu przeciwciała na odpowiednie dla danej analizy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak znakować komórki markerami autofagii, pozyskiwać dane na wielospektralnym cytometrze przepływowym z obrazowaniem oraz analizować dane w celu oceny przepływu autofagicznego.Należy pamiętać, że praca z formaliną może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej.

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Tutaj opisany jest prosty i dobrze sprawdzony protokół pomiaru masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Metoda opiera się na ilościowym określeniu proporcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) we frakcjach komórek sedymentacyjnych w porównaniu z całkowitymi poziomami LDH w komórkach.

Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Opisujemy nasz protokół pomiaru rytmów biologicznych w katabolizmie białek poprzez autofagię i proteasom w wątrobie myszy.

Pomiar rytmów dobowych w strumieniu autofagicznym i proteasomalnym

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę ilościowej oceny autofagii poprzez kolokalizację markerów LC3, p62 i LAMP1 przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego w komórkach Jurkat.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Przeglądaj więcej filmów