Name: Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu w komórkach ssaków. Protokół łączy immunofluorescencję i FISH do identyfikacji SG w liniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratoriów Iwanowa i Andersona za ich pomocną dyskusję i opinie na temat tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia [GM111700 i CA168872 do PA, NS094918 do PI], Narodowe Centrum Nauki [grant UMO-2012/06/M/NZ3/00054 dla WS]. WS dziękuje również Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa Wyższego w Polsce (Program Mobilność Plus) oraz Polsko-Amerykańskiej Komisji Fulbrighta za wsparcie finansowe jego badań w USA.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Dodać autoklawowane szkiełka nakrywkowe do 12 dołków na płytce 24-dołkowej, jak pokazano na rysunku 1A; można to zrobić za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do próżni, aby pobrać każde szkiełko nakrywkowe. Delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe z boku studzienki, aby uwolnić ssanie, pozwalając szkiełku nakrywkowemu wpaść do studzienki.</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek kostniakomięsaka U-2 OS (U2OS) na studzienkę w końcowej objętości 500 μL pożywki. Przesuń płytkę z boku na bok oraz kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij szkiełka nakrywkowe czystą końcówką P1000, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe znajduje się na dnie studzienki i że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków.</li>
</ol>
2. Komórki stresujące
<ol>
	<li>Następnego dnia należy przeprowadzić wzrokową kontrolę płytki, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozproszone i równomiernie zlewają się na szkiełku nakrywkowym, ponieważ różnice między próbkami mogą niekorzystnie wpłynąć na odtwarzalność wyników. Użyj obiektywu 10X w odwróconym mikroskopie do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Podgrzej pożywkę do 37 °C. Unikaj nakładania na ogniwa zimnych lub gorących mediów, ponieważ powodują one odpowiednio szok zimny lub szok cieplny.</li>
	<li>Rozcieńczyć leki w podgrzanym podgrzanym podłożu. Dla każdego innego stężenia leku przygotuj 2 studzienki zawierające 500 μl pożywki. Przygotować dodatkowe 500 μl, aby zapobiec stratom podczas pipetowania. Podwielokrotność 4 probówek, z których każda zawiera 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Dla arsenianu sodu: do każdej studzienki zawierającej 500 μl dodać 1,5 μl 100 mM arsenianu sodu (stężenie końcowe: 100 μM) lub dodać 0,75 μl 100 mM arsenianu sodu (stężenie końcowe: 50 μM).</li>
		<li>Dla winorobbiny: do każdej studzienki zawierającej 500 μl dodać 22,5 μl 10 mM winorebbiny (stężenie końcowe: 150 μM) lub dodać 18,75 μl 10 mM winorelbiny (stężenie końcowe: 100 μM). 
		UWAGA: Arsenin sodu jest dobrze scharakteryzowanym i powszechnie stosowanym induktorem granulek stresu i dlatego jest klasycznie stosowany jako kontrola pozytywna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij i wyrzuć media z dołków B1 - 4 i C1 - 4. Dodaj pożywkę z lekami i odczekaj 60 minut (Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Dodać 500 μl pożywki ze 100 μM arsenianem sodu do studzienek B1 i B2. Dodać 500 μl pożywki z 50 μM arsenianem sodu do studzienek B3 i B4.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki ze 150 μM winorealbiną do studzienek C1 i C2. Dodać 500 μl pożywki ze 125 μM winorelbiną do studzienek C3 i C4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30 minut przed utrwaleniem potraktować studzienki w kolumnie 2 5 μl cykloheksymidu (1 mg/ml zapasu), a studzienki w kolumnie 4 2 μl puromycyny (1,25 mg/ml bulionu). Delikatnie kołysz płytką, aby wymieszać przed ponownym umieszczeniem płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Utrwalanie komórek i immunofluorescencja
UWAGA: Przed eksperymentem upewnij się, że metanol jest schłodzony do -20 °C. Przygotuj, w tym sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 5% normalnej surowicy końskiej (NHS) w PBS i 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.
<ol>
	<li>Wyrzucić pożywkę i umyć studzienki zawierające szkiełka nakrywkowe PBS. W zależności od stosowanych leków ważne może być prawidłowe wyrzucenie pożywek zawierających leki; Skontaktuj się z lokalnym urzędem ds. bezpieczeństwa środowiska w celu uzyskania szczegółowych instrukcji. Aby skutecznie umyć, napełnij butelkę do wyciskania PBS, odetnij końcówkę, aby umożliwić delikatny przepływ, a nie ciasny strumień, i użyj tego, aby dodać PBS do każdej studzienki po zassaniu oryginalnego PBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą ~250 μL 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem. Całkowicie przykryj górną część szkiełka nakrywkowego PFA; 250 μL powinno wystarczyć, ale jeśli nie, dodaj więcej. Należy zawsze unikać pipetowania bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe, ponieważ niektóre komórki (lub metody leczenia komórek pod wpływem stresu) mogą zmienić przyczepienie, a siła pochodząca z pipetowania może spowodować ich przemieszczenie.</li>
	<li>Usuń PFA i wyrzuć go w odpowiedni sposób. Skontaktuj się z lokalnym biurem ds. bezpieczeństwa środowiska, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat prawidłowego usuwania paraformaldehydu.</li>
	<li>Dodać ~250 μl metanolu (-20 °C) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym kołysaniem; to zarówno przepuszczalnie, jak i spłaszcza komórki.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć metanol i zablokuj komórki, stosując ~250 μL 5% NHS przez 1 godzinę w temperaturze RT O/N w temperaturze 4 °C. Skontaktuj się z lokalnym urzędem ds. bezpieczeństwa środowiska, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat prawidłowego usuwania metanolu.</li>
	<li>W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych należy rozcieńczyć przeciwciała w 5% NHS. 
	UWAGA: Użycie wielu markerów SG jest kluczem do potwierdzenia, czy zaobserwowane granulki są SG w dobrej wierze. Liczba markerów SG, które można zastosować, zależy od filtrów dostępnych w mikroskopie. Jeśli dostępne są standardowe zestawy filtrów zielonego, czerwonego i dalekiej czerwieni, należy użyć G3BP1, eIF4G i eIF3b w rozcieńczeniu 1/250.
	<ol>
		<li>W tym eksperymencie (12 szkiełek nakrywkowych po 250 μl każdy-Razem: 3 ml 5% NHS) dodaj 12 μl każdego z poniższych: anty-G3BP1, anty-eIF3b i anty-eIF4G. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyj studzienki 3x PBS i inkubuj każde płukanie przez 5 minut.</li>
	<li>W przypadku przeciwciał drugorzędowych należy rozcieńczyć wszystkie przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenie 1/250) i barwnik Hoechst (rozcieńczenie 1/1,000) w 5% NHS.
	<ol>
		<li>W tym eksperymencie (12 szkiełek nakrywkowych po 250 μl każdy - Razem: 3 ml 5% NHS), dodaj 12 μl każdego z poniższych: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit i Cy5-Goat (rozcieńczenie 1/250 każdego) i dodaj 3 μl barwnika Hoechst.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas tego i następnych etapów należy chronić próbki przed światłem, przykrywając płytkę pudełkiem lub umieszczając folię na wierzchu naczynia do hodowli tkankowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj studzienki trzy razy PBS przez 5 minut każda.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na oznakowanych szkiełkach za pomocą medium montażowego. Podgrzewać materiał montażowy w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C przez 10 minut; Zmniejsza to lepkość i ułatwia pipetowanie. Za pomocą wyciętej końcówki P200 odpipetować 25 μl medium montażowego na szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe; Na jednym szkiełku podstawowym może zmieścić się 4-8 szkiełek nakrywkowych, zakładając, że stolik mikroskopowy na to pozwala. Za pomocą drobnych kleszczyków przenieś szkiełko nakrywkowe ze studzienki na szkiełko, upewniając się, że kładziesz komórkę do dołu na podłożu montażowym. Używając czystej końcówki P200, dociśnij szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Po zamontowaniu wszystkich szkiełek nakrywkowych użyj złożonej chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar podłoża mocującego, bardzo mocno dociskając tkankę laboratoryjną do szkiełka. Użyj wyciśniętej butelki zawierającejH2O, aby spłukać nadmiar podłoża mocującego, a następnie powtórz osuszanie złożoną tkanką laboratoryjną, aby usunąć wodę.</li>
</ol>
4. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
<ol>
	<li>Pokryć komórki metodą na płytkę i poddać je obróbce, stosując kroki 1 i 2.1-4 jako wskazówkę; konieczne jest jedynie umieszczenie komórek w kolumnie 1, ponieważ w następnym doświadczeniu potrzebne są tylko 3 szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie są przygotowane (tj. 4% PFA w PBS, 70% etanolu w wodzie, 2x cytrynian soli sodowej (SSC) i 5% NHS), że metanol jest schłodzony do -20 °C i że piec do hybrydyzacji jest rozgrzany do odpowiedniej temperatury.</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.1-3.3, aby umyć i naprawić komórki.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez dodanie metanolu o temperaturze -20 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć metanol i inkubować szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu. Umieść talerz w temperaturze 4 °C na noc. Uszczelnij płytkę za pomocą parafilmu, aby zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Następnego dnia usuń etanol i ponownie nawodnij komórki, dodając 500 μL 2x SSC. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 5 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 2x SSC i dodać 500 μL 2X SSC. Inkubować przez 5 minut pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Umieść kawałek parafilmu płasko na dnie pieca do hybrydyzacji. Odpipetować 25 μl buforu hybrydyzacyjnego na parafilm dla każdego szkiełka nakrywkowego. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia 24-dołkowego (w tym momencie szkiełka nakrywkowe są komórkami do góry) i umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na buforze hybrydyzacyjnym. Zrób to w temperaturze 42 °C lub opcjonalnie w 65 °C przez 15 minut 
	UWAGA: Wykonanie tego kroku w temperaturze 65 °C spowoduje denaturację komórkowego RNA; może to poprawić sygnał, jeśli poliA jest maskowany przez interakcje z białkami.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę biotynowo-oligo(dT) (100 ng/μl) w buforze hybrydyzacyjnym do stężenia 2 ng/μl; wystarczy 25 μl na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Dla każdego szkiełka nakrywkowego odpipetować 25 μl buforu hybrydyzacyjnego zawierającego biotynę-oligo(dT) na parafilm. Podnieś szkiełko nakrywkowe kleszkami i delikatnie dotknij krawędzi szkiełka nakrywkowego na tkance laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar buforu hybrydyzacyjnego. Przenieść szkiełko nakrywkowe do buforu hybrydyzacyjnego z biotyną-oligo(dT); Pamiętaj, aby trzymać komórkę stroną z dołu.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w pudełku do hybrydyzacji, aby ograniczyć parowanie. Inkubować szkiełka nakrywkowe z biotyną-oligo(dT) w buforze hybrydyzacyjnym przez 60 minut w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Umieścić 2x SSC w piecu do hybrydyzacji, aby umożliwić jego zrównoważenie do 42 °C.</li>
	<li>Dodaj ~ 500 μL podgrzanego 2x SSC do dołków w naczyniu 24-dołkowym i użyj kleszczy, aby przenieść szkiełka nakrywkowe do studzienki. Inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórzyć powyższy etap prania dwa razy w temperaturze 42 °C, a następnie dwukrotnie w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.5-3.10, upewniając się, że używasz fluorochromu streptawidyny do wykrywania biotyny-oligo(dT) zamiast jednego konwencjonalnego przeciwciała.</li>
</ol>
5. Test rybopuromycylacji w celu oceny statusu translacji
<ol>
	<li>Umieść komórki U2OS na szkiełkach nakrywkowych, jak wskazano w kroku 1, ale tylko na jedną płytkę na warunek (w tym przypadku 3 szkiełka nakrywkowe: niepoddane obróbce, 100 μM arsenianu sodu i 150 μM winorelbiny) (Rysunek 1A).</li>
	<li>Komórki stresu przy użyciu protokołu w kroku 2, wykonując kroki 2.1-2.4.</li>
	<li>5 minut przed utrwaleniem dodać 2 μl puromycyny (podstawowe: 1,25 mg/ml; rozcieńczyć 2 μl w 500 μl, aby uzyskać końcowe stężenie puromycyny 5 μg/ml) i 2,9 μl emetyny (zapas: 20 μg/ml; dodać 2,9 μl do tego samego roztworu już zawierającego puromycynę) do każdej studzienki zawierającej 0,5 ml.</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.1-3.10, jak wskazano powyżej, używając przeciwciała anty-puromycyny (rozcieńczenie 1/1000) w celu wykrycia puromycyny. Najlepiej użyć dwóch innych znaczników SG w pozostałych kanałach.</li>
	<li>Podczas ilościowego określania sygnału puromycyny należy wykonać wszystkie zdjęcia przy użyciu tej samej ekspozycji. Wybierz tę ekspozycję, używając najjaśniejszej (nieakcentowanej) próbki i wykonując zdjęcie tak jasne, jak to możliwe, bez nasycenia. 
	UWAGA: Intensywność sygnału fluorescencyjnego anty-puromycyny reprezentuje ciągłą translację, ponieważ puromycyna zastępuje aminokwas, włącza się do powstającego białka i wymusza przedwczesne zakończenie białka.</li>
</ol>
6. Akwizycja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Kwantyfikacja granulek stresu
	<ol>
		<li>Aby określić ilościowo SG, uzyskaj od 3 do 5 obrazów o łącznej liczbie >100 komórek na próbkę za pomocą obiektywu 40X. Alternatywnie, uzyskaj obrazy przy użyciu innych obiektywów, ale upewnij się, że >100 komórek jest policzonych na szkiełko nakrywkowe i że powiększenie jest wystarczająco duże, aby wyraźnie uwidocznić granulki. W tym celu należy podzielić szkiełko nakrywkowe na pięć mniej więcej równych regionów i losowo wybrać pole z każdego regionu (Rysunek 1B); Obrazy tego samego pola powinny zawierać wszystkie kanały do oceny kolokalizacji markerów.</li>
		<li>Po pobraniu wszystkich obrazów scal kanały. Niektóre programy aparatu zrobią to automatycznie, podczas gdy inne wymagają ręcznego scalenia; można to zrobić za pomocą ImageJ, otwierając wszystkie obrazy, a następnie wybierając [Obraz | Kolor | Scal kanały].</li>
		<li>Ręcznie policz całkowitą liczbę komórek, zliczając liczbę jąder, używając Hoechsta jako markera jąder. Ręczne zliczanie liczby komórek, które zawierają więcej niż dwa SG na komórkę. 
		UWAGA: Na przykład, używając scalonego obrazu trzykanałowego wyświetlającego G3BP1 (zielony), eIF4G (czerwony) i Hoechst (niebieski), policz jądra (lub liczbę komórek) za pomocą niebieskiego kanału. Następnie policz komórki SG-dodatnie jako te, które mają dwa lub więcej żółtych ognisk na komórkę. Granulki będą wyglądać na żółte, ponieważ zielony z G3BP1 i czerwony z eIF4G wydają się żółte, jeśli są kolokalizowane.</li>
		<li>Określ procent komórek, które są SG dodatnie, łącząc dane z 3-5 niezależnych regionów, a następnie oblicz: 
		liczba komórek SG dodatnich / liczba jąder) *100 = procent komórek SG-dodatnich</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena kolokalizacji za pomocą analizy skanowania liniowego – metoda ręczna
	<ol>
		<li>Otwórz plik ImageJ. Pobierz za darmo ze strony ()</li>
		<li>Otwórz menedżera ROI: [Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI...].</li>
		<li>Otwórz scalony obraz w ImageJ: [Plik | Otwórz].</li>
		<li>Korzystając z narzędzia linii znajdującego się na pasku narzędzi ImageJ, dodaj linię przechodzącą przez SG, upewniając się, że zawiera się przed i po SG. Dodaj tę linię do menedżera ROI, klikając [Dodaj] w oknie menedżera ROI.</li>
		<li>Podziel scalony obraz na osobne kanały, aby ocenić lokalizację każdego markera w granulce: [Obraz | Kolor | Podzielony kanał]; Spowoduje to podzielenie scalonego obrazu na trzy czarno-białe obrazy.</li>
		<li>Upewnij się, że na obrazie czarno-białym jest zaznaczona linia; linia jest zaznaczona, jeśli pojawia się na obrazie. Jeśli nie, w oknie menedżera ROI kliknij linię w panelu; Spowoduje to podświetlenie linii na niebiesko w oknie menedżera ROI i sprawi, że linia będzie widoczna na czarno-białym obrazie. Jeśli linia nadal się nie pojawia, upewnij się, że opcja "pokaż wszystko" jest zaznaczona w menedżerze ROI, a następnie kliknij linię na obrazie.</li>
		<li>Analizuj intensywność linii: [Analizuj | Profil działki]; spowoduje to wyświetlenie okna "Profil wykresu", w którym wykreślane jest natężenie sygnału w poprzek linii.</li>
		<li>W oknie "Profil wykresu" kliknij przycisk [Lista], co spowoduje wyświetlenie okna zawierającego nieprzetworzone dane z wykresu. Skopiuj wszystkie dane w tym oknie i wklej je do pliku arkusza kalkulacyjnego. W tym celu zaznacz wszystkie dane w oknie: [Edytuj | Zaznacz wszystko]. Skopiuj datę: [Edytuj | Kopiowanie]. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego i wklej dane: [Edytuj | Wklej].</li>
		<li>Wykonaj kroki 6.2.6 - 6.2.8 dla każdego kanału osobno. Pamiętaj, aby śledzić oceniany kanał</li>.
		<li>W arkuszu kalkulacyjnym wygeneruj wykres liniowy wyników. Wybierz kolumny zawierające dane, naciskając [control] i klikając literę u góry każdej kolumny. Następnie wybierz wykres liniowy: [Wstaw | Wykres liniowy].</li>
		<li>Powtórz tę analizę dla wielu granulek naprężeń w wielu niezależnych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena kolokalizacji za pomocą analizy skanowania liniowego – wtyczka ImageJ
	<ol>
		<li>Pobierz i zainstaluj narzędzie do tworzenia profili RGB ze strony internetowej ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); po prawidłowym zainstalowaniu na pasku narzędzi powinna pojawić się ikona z czerwonymi, zielonymi i niebieskimi liniami (RGB).</li>
		<li>Otwórz obraz (np. Tiff, JPG) w ImageJ: [Plik | Otwórz].</li>
		<li>Kliknij ikonę RGB znajdującą się na pasku narzędzi ImageJ.</li>
		<li>Kliknij i przeciągnij, aby dodać linię, która rozciąga się przez SG, upewniając się, że zawiera sąsiednie regiony; obraz histogramu pojawi się w wyskakującym okienku.</li>
		<li>Zapisz dane jako obraz: [Plik | Zapisz jako | Tiff]. Możesz też wyeksportować, a następnie wykreślić dane w innym programie do tworzenia wykresów, korzystając z kroku 6.2.8 powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mRNA+translation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li>
<li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNP+granules%3A+Assembly%2C+function%2C+and+connections+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li>
<li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li>
<li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%2C+P-bodies+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li>
<li>Aulas, A., Van de Velde,, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS%3A+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?</a> Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).</li>
<li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li>
<li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+protein+aggregation+run+amuck%3A+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li>
<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12(2010).</li>
<li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li>
<li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors%3A+role+of+reoxygenation%2C+free+radicals%2C+and+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li>
<li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li>
<li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li>
<li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+%28RPM%29+applied+to+inert+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li>
<li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li>
<li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li>
<li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li>
<li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+binding+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li>
<li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+%28TDP-43%29+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li>
<li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li>
<li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation%2Fdissolution+to+mTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak dowodzą badania immunohistologiczne w wielu chorobach, przewlekły stres prowadzi do powstawania różnych ognisk wewnątrzkomórkowych. Na przykład większość chorób neurodegeneracyjnych charakteryzuje się wewnątrzkomórkowymi agregatami nierozpuszczalnych białek. Obecność białek związanych z SG w takich agregatach jest często podstawą do stwierdzenia, że takie ogniska są SG. Podobny wniosek wyciąga się również, gdy w komórkach leczonych nowymi bodźcami stresowymi obserwuje się ogniska cytoplazmatyczne markera SG. Protokół...

Komórki wykorzystują wiele mechanizmów reagowania na stres. Niektóre reakcje zachodzą na poziomie potranskrypcyjnym i obejmują regulację translacji mRNA i/lub stabilności1,2. Modulowane stresem zatrzymanie i degradacja translacji mRNA są związane z tworzeniem specyficznych niebłoniastych ognisk komórkowych, z których najlepiej scharakteryzowane są granulki stresu (SG)3. SG to ogniska cytoplazmatyczne, które koncentrują nietranslujące mRNP w komórkach zatrzymanych translacyjnie reagujących na stres (np. utlenianie, szok cieplny, głód składników odżywczych i infekcja wirusowa)4. Oprócz nietranslujących mRNA, SG zawierają czynniki inicjacji translacji, białka wiążące RNA i różne białka sygnałowe5. SG są biomarkerami zahamowanej translacji białek i zmienionego metabolizmu RNA i zostały powiązane z przeżywalnością i apoptozą komórek, szlakami sygnałowymi i procesami jądrowymi5.
SG są dynamicznymi jednostkami, a ich powstawanie jest ściśle związane ze statusem translacji komórkowej6. Pomimo pozornie solidnego wyglądu, większość składników białka SG szybko przemieszcza się do i na zewnątrz, z czasem przebywania wynoszącym sekundy. Podczas gdy SG utrzymują się przez kilka minut do godzin, większość ich składników ulega szybkim zmianom. Hamowanie inicjacji translacji i wynikający z tego demontaż translujących polisosomów sprzyja tworzeniu się SG; w związku z tym SG są w równowadze z translującymi polisomami. Ta równowaga polisom/SG jest kluczem do odróżnienia SG w dobrej wierze od innych foci6,7.
Zatrzymanie inicjacji translacji pociąga za sobą konwersję kompleksów pre-inicjacyjnych kompetentnych do translacji, które zawierają mRNA, czynniki inicjacji translacji (eIF) i podjednostki rybosomalne 40S (tak zwane kompleksy 48S) w kompleksy zatrzymane translacyjnie (tzw. kompleksy 48S*), które mogą łączyć się w SGs4,6. SG są promowane przez zatrzymanie translacji na dwóch różnych etapach przed powstaniem kompleksu 48S: interferencja z funkcjami kompleksu eIF4F wiążącego czapeczkę (np. Celowanie w jego podjednostkę eIF4A) lub fosforylacja podjednostki α czynnika inicjującego translację eIF2, w której pośredniczy jedna lub więcej z czterech kinaz eIF2. Obecność zatrzymanych kompleksów 48S (tj. podjednostek rybosomalnych 40S i wybranych czynników inicjacji translacji) jest cechą charakterystyczną SGs8,9.
SGs zostały powiązane z różnymi stanami patologicznymi, takimi jak infekcje wirusowe, neurodegeneracja, autoimmunizacja i rak3,10,11,12,13. Zmutowane formy kilku składników SG są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi (np. stwardnieniem zanikowym bocznym), w których neurony wykazują wewnątrzkomórkowe patologiczne inkluzje, które mogą odgrywać aktywną rolę w śmierci neuronów13. Niektóre wirusy przejmują kontrolę nad komponentami SG, aby zahamować tworzenie SG i zwiększyć replikację wirusa14. Ostatnie badania łączą również SG z rakiem15 oraz z przeżywalnością komórek rakowych w przypadku chemioterapii i radioterapii10,16,17,18,19,20. Chociaż takie odkrycia pobudziły duże zainteresowanie biologią SG, w wielu opublikowanych raportach brakuje ważnych kontroli, które pozwoliłyby odróżnić powstawanie SG w dobrej wierze od innych ognisk wywołanych stresem.
SGs były początkowo opisywane jako niebłoniaste ogniska cytoplazmatyczne złożone z wybranych białek wiążących mRNA (RBP), w tym antygenu ntrakomórkowego 1 komórek T (TIA-1) i białka wiążącego poli-A (PABP); czynniki inicjacji translacji; poliadenylowane mRNA; i małe podjednostki rybosomalne4,6,21,22. Tradycyjnie, ich skład został określony za pomocą technik takich jak barwienie immunologiczne i ektopowa ekspresja fluorescencyjnie znakowanych białek23,24. Ze względu na ich wysoce dynamiczną naturę, immunolokalizacja białek SG i/lub mRNA pozostaje metodologią definiującą wykrywanie SGs23,24. Do tej pory wiele RBP i innych białek (ponad 120 różnych białek) jest opisanych jako składniki SG11. Ponieważ wiele białek zlokalizowanych w SG zmienia swoją lokalizację zarówno w sposób zależny od stresu, jak i niezależny i może gromadzić się w innych wewnątrzkomórkowych przedziałach i ogniskach, ważne jest, aby wybrać prawidłowe markery SG i zastosować kryteria funkcjonalne w celu odróżnienia SG od innych typów ognisk wywołanych stresem. prawdziwy SG zawierają mRNA, czynniki inicjacji translacji i małe podjednostki rybosomalne i są w dynamicznej równowadze z translacją.
Ten prosty przepływ pracy ma na celu określenie, czy ogniska wywołane stresem są prawdziwymi SG. Ten przepływ pracy obejmuje kilka podejść eksperymentalnych z wykorzystaniem komórek U2OS, komórek powszechnie używanych do badania SG. Komórki te są idealne, ponieważ mają dużą cytoplazmę, są stosunkowo płaskie i silnie przyczepiają się do szklanych szkiełek nakrywkowych. Inne typy komórek mogą być wykorzystywane do badania SG, ale ważne jest, aby mieć świadomość, że różnice w czasie, stężeniu leku i obfitości białek zarodkujących SG mogą zmieniać kinetykę i skład. Dodatkowo, niektóre komórki reagują na wiązanie paraformaldehydu, tworząc pęcherzyki na powierzchni komórki, nadając im potargany wygląd, który powoduje punktową lokalizację niektórych markerów SG; bez dokładnej analizy mogą one zostać błędnie sklasyfikowane jako SG. Podkreśla to konieczność oceny wszystkich kryteriów wymaganych do zidentyfikowania ognisk wywołanych stresem jako SG w dobrej wierze. Winorelbina (VRB), lek przeciwnowotworowy, który promuje SGs20, a także arsenit sodu (SA), solidny i dobrze scharakteryzowany induktor SG, są używane jako naprężenia w eksperymentach w tym protokole.
Canonical SGs zawierają wiele markerów SG (zarówno białek, jak i mRNA), które kolokalizują się w ogniskach cytoplazmatycznych. Protokół ten wykorzystuje zarówno immunofluorescencję, jak i fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wykrywania lokalizacji markerów białkowych i poliadenylowanych mRNA22, odpowiednio. Krótko mówiąc, immunofluorescencja pośrednia wykorzystuje przeciwciała (tj. przeciwciała pierwotne) specyficzne dla danego białka w celu wykrycia go w komórce. Następnie przeciwciała drugorzędowe (zwykle specyficzne dla gatunku) przyłączone do fluorochromów rozpoznają przeciwciało pierwszorzędowe i ujawniają lokalizację białka docelowego. Mikroskopia fluorescencyjna służy do wykrywania zlokalizowanego sygnału w komórce. Użycie przeciwciał wytwarzanych u różnych gatunków i wykrywanie ich za pomocą różnokolorowych przeciwciał drugorzędowych pozwala na wykrycie kolokalizacji wielu przeciwciał, co wskazuje, że ich cele białkowe znajdują się w tym samym miejscu23. Ważne jest, aby wybrać markery, które zostały zweryfikowane pod kątem kolokalizacji w SG w dobrej wierze.
FISH używa oznaczonej sondy, która łączy zasady z określoną sekwencją RNA lub DNA25. Do wykrywania mRNA protokół ten wykorzystuje biotynylowaną sondę oligo(dT)40, która hybrydyzuje (lub pary zasad) z ogonem poliA mRNA (tj. poliA FISH). Biotynylowana sonda jest następnie wykrywana za pomocą fluorescencyjnie sprzężonej streptawidyny, ponieważ streptawidyna ma wysokie powinowactwo do biotyny. Podczas oceny SG ważne jest, aby połączyć poliA FISH z immunofluorescencją wykrywającą marker SG, ponieważ w dobrej wierze SG te dwa sygnały powinny się kolokalizować.
Korzystając z tego protokołu, kolokalizacja jest oceniana na wiele sposobów. W obrazie wielokanałowym (tj. RGB: czerwonym, zielonym i niebieskim) kolokalizacja zmieni kolor nakładającego się sygnału (np. kolokalizowany czerwony i zielony wydają się żółte)23. Dodatkowo kolokalizacja jest określana graficznie za pomocą analizy skanowania linii, gdzie intensywność każdego koloru jest mierzona w poprzek danej linii8,20. Ten protokół opisuje dwie procedury analizy skanowania liniowego przy użyciu klasy ImageJ<sup="xref">26. Jedna procedura jest ręczna i przechodzi przez cały proces, podczas gdy druga wykorzystuje makro lub prosty program, który automatyzuje ręczne kroki. Ważne jest, aby przejść przez program ręczny, aby zrozumieć procedurę makra.
SGs tworzą się w komórkach, w których translacja jest tłumiona; dlatego komórki z SG powinny wykazywać obniżony poziom globalnej translacji w porównaniu do komórek nieleczonych. Eksperymentalnie stosuje się rybopuromycylację. Puromycyna i emetyna są dodawane do komórek na krótki czas przed utrwaleniem, co pozwala puromycynie na włączenie się do aktywnie tworzących się polipeptydów, powodując terminację27,28. Leczenie emetyną jest konieczne, aby zapobiec ponownemu zainicjowaniu29. Puromycyna może być następnie wykryta za pomocą przeciwciała anty-puromycyny, co daje obraz aktywnej translacji. Ta metoda jest stosowana, ponieważ jest szybka, nie wymaga wstępnego głodzenia pożywką pozbawioną określonego aminokwasu (i potencjalnie napinania komórek) i ujawnia subkomórkową lokalizację translacji białek. Inne metody, w szczególności wykorzystujące zmodyfikowane analogi aminokwasów, takie jak analog metioniny L-azydohomoalaina (AHA), w połączeniu z chemią "click-it" chemistry30, zostały wykorzystane do wykazania, że komórki zawierające SG wykazują znacznie niższą translację niż sąsiednie komórki31. Jednak ta technika wymaga głodzenia metioniny, a następnie znakowania impulsowego przez 15-30 minut. Głód metioniny stanowi dodatkowy stres, podczas gdy długi czas znakowania (tj. 15-30 minut) skutkuje pomiarem kumulatywnej, a nie ciągłej translacji, a także umożliwia nowo zsyntetyzowanym białkom przemieszczanie się z miejsca syntezy do miejsca docelowego w komórce. W przeciwieństwie do tego, rybopuromycylacja jest znacznie szybsza i jest kompatybilna z dowolnym podłożem, takim jak pożywka wolna od glukozy stosowana do indukowania SG poprzez głód glukozy.
Kanoniczne SG są w dynamicznej równowadze z aktywnie translującymi polisomami. Można to ocenić eksperymentalnie, traktując próbki lekami, które stabilizują lub destabilizują polisomy, przechylając w ten sposób równowagę między SG a polisomami23. Cykloheksymid (lub emetyna, która zachowuje się podobnie) blokuje wydłużenie poprzez "zamrażanie" rybosomów na mRNA, zmniejszając w ten sposób pulę dostępnych niepolisomalnych mRNP zdolnych do tworzenia SG. Eksperymentalnie można to wykorzystać na dwa sposoby: dodając cykloheksymid (lub emetynę) przed stresem, aby zapobiec tworzeniu się SG lub dodając cykloheksymid (lub emetynę) po utworzeniu SG, nawet bez usunięcia czynnika naprężającego, powodując demontaż SG, ponieważ zablokowane kompleksy preinicjacyjne są powoli wprowadzane do frakcji polisomowej. W przeciwieństwie do tego, puromycyna powoduje przedwczesne zakończenie i sprzyja rozkładowi polisomów, zwiększając pulę inicjujących mRNA zdolnych do łączenia się w SG. Eksperymentalnie, leczenie puromycyną zwiększa liczbę SG lub obniża próg, przy którym tworzą się w odpowiedzi na stopniowany stres lub dawkę leku. Oceniając działanie puromycyny, ważne jest, aby użyć submaksymalnego poziomu leku będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ oczekuje się, że puromycyna wzmocni działanie leku i zwiększy odsetek komórek wykazujących SG – nie może to nastąpić, jeśli lek/stres powoduje SG w 100% komórek początkowo. Kontrastuje to z leczeniem cykloheksymidem, które rozkłada SG i działa najlepiej, gdy ~95% komórek początkowo wykazuje SG, aby można było zaobserwować jak największy spadek i dokładnie określić ilościowo.
Ten protokół dostarcza ram do badania SG w komórkach ssaków. Metody obejmują: (1) barwienie immunofluorescencyjne i analizę ImageJ w celu oceny kolokalizacji klasycznych markerów związanych z SG eIF4G, eIF3b i białka wiążącego białko aktywujące GTPazę Ras 1 (G3BP1) w przypuszczalnych SG; (2) oligo(dT) fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (polyA FISH) w celu wykrycia poliadenylowanego mRNA; (3) leczenie cykloheksymidem i puromycyną w celu określenia, czy ogniska wywołane stresem są w dynamicznej równowadze z polisomami; oraz (4) rybopuromycylacja w celu oceny statusu translacyjnego komórek zawierających przypuszczalne SG. Razem testy te mogą określić, czy ogniska wywołane stresem można sklasyfikować jako SG w dobrej wierze.

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB-96 i handel;</td><td>Powszechnie pisane "U2OS" Kultura w 37 & stopniach; C poniżej 5% CO2 w 10% FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Zawiera 4,5 g/l glukozy, pirogronian i czerwień fenolową Uzupełniony 10% FBS, 10 mM HEPES i penicyliną/steptomycyną Podgrzewanie wcześniejszego leku (leków) Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Służy do uzupełniania pożywki</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Służy do uzupełniania pożywki</td></tr><tr><td>penicylina streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Służy do uzupełniania pożywki</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td> Chusteczki laboratoryjne <td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>(chusteczki kimwipe)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe do wzrostu Okulary nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoklawizowane przed użyciem Przechowywać w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkanek</td></tr><tr><td>(meta)arsenin sodu &ge; 90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Rozpuścić w wodzie do stężenia 1 M, następnie rozcieńczyć do 100 &mikro; M jako zapas roboczy</td></tr><tr><td>Winorelbina (VRB)</td><td>TSZ</td><td>CHEM RS055</td><td>Rozpuścić w wodzie do 10 mM</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Służy do oceny poziomu translacji (rybopuromycylacji) -Służy do oceny związku SG z aktywną translacją Rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek emetyny hydrat</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Stosowany w połączeniu z puromycyną do oceny ogólnego poziomu translacji Służy do oceny związku SG z aktywną translacją -Rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Cykloheksymid (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Służy do oceny związku SG z aktywną translacją Rozcieńczyć w wodzie do 10 mg/ml</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Bufor do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Klasa odczynnika paraformaldehydowego, krystalicznego (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Przygotować 4% roztwór w gorącym PBS w dygestorium, mieszać aż do rozpuszczenia Podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 &; C przez kilka miesięcy Niebezpieczne, stosować wentylację Wyrzucić do odpadów specjalnych</td></tr><tr><td>Metanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prechill do -20 &deg; C przed użyciem Wyrzucić do specjalnych odpadów</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Rozcieńczyć do 5% w PBS Dodać azydek sodu do przechowywania w temperaturze 4 &; C Roztwór blokujący do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Etanol, czysty, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Rozcieńczyć do 70% wodą</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus</td><td>Mysie</td> przeciwciało anty G3BP1 Fisherbrand <td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>(TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty eIF4G przeciwko eIF4G w rozcieńczeniu 1/100 (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C Koza o rozcieńczeniu 1:250</td></tr><tr><td>anty eIF3&eta; (N-20)</td> Santa <td>Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; jest również znane jako eIF3b Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C </td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty puromycyny 12D10</td> o rozcieńczeniu 1/250 <td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C Rozcieńczenie 1/1,000</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Rozpuszcza się w wodzie według producenta s instrukcje, a następnie przechowuj w 4 & stopni; C Rozcieńczenie 1/250</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Rozpuścić w wodzie zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje, a następnie przechowuj w 4&deg; C Rozcieńczenie 1/2,500</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Rozpuszczać w wodzie zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje, a następnie przechowuj w 4&deg; C Rozcieńczenie 1/250</td></tr><tr><td>Roztwór Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi Roztwór podstawowy 0,5 mg/ml w dH20, chronić przed światłem -Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Rozpuszcza się w wodzie według producenta s instrukcje, a następnie przechowywać w temperaturze 4 & deg; C 1/250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>oligo-(dT)40x sonda biotynilowana</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>/</td><td>Rozpuścić w wodzie do 100 ng/ml, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C Rozcieńczyć w buforze hybrydowym 1/50 przed użyciem Pudełko</td></tr><tr><td>do hybrydowania</td> na zamówienie /<td></td><td>/</td><td>Wykonaj komorę wilgotnościową z dowolnym pojemnikiem do przechowywania, dodając na dnie nawilżony papier - podgrzej pudełko przed użyciem</td></tr><tr><td>20x bufor SSC</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Rozcieńczyć do 2x SSC przy użyciu wody wolnej od RNaz (uzdatnionej DEPC) Przechowywać w RT Bufor do płukania FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Bufor inkubacyjny blokowy i sondowy do nośników do</td></tr><tr><td>montażu szkiełek</td> FISH <td>domowej roboty</td><td>/</td><td>Wymieszaj 5 g " Rozpuszczalny na zimno" poli(alkohol winylowy) w 20 ml PBS Wymieszać przez sonikację, a następnie wymieszać O/N przy RT Dodać 5 ml glicerolu i 0,2 ml 20 % azydku sodu i mieszać przez 16 godzin w temperaturze RT Wirowanie przy 20 000 g przez 20 minut, wyrzucić duże granulki Podwielokrotność lepkiej cieczy, długotrwałe przechowywanie w temperaturze -20 & C, 1 tydzień w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Odczynnik do produkcji winolu</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Odczynnik do produkcji</td></tr><tr><td>azydku winolu sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Środek konserwujący do blokowania roztworu i winylu Roztworem do 20% roztworu w wodzie</td></tr></tbody></table>

metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Komórki często są narażone na nagłe zmiany środowiskowe. Granulki stresu (SG), cytoplazmatyczne kompleksy rybonukleoproteinowe, które tworzą się w komórkach narażonych na warunki stresowe, są zaangażowane w różne aspekty metabolizmu i przeżycia komórek. SG modulują komórkowe szlaki sygnałowe, potranskrypcyjną ekspresję genów i programy odpowiedzi na stres. Tworzenie tych granulek zawierających mRNA jest bezpośrednio związane z translacją komórkową. Montaż SG jest wyzwalany przez zahamowaną inicjację translacji, a demontaż SG jest promowany przez aktywację translacji lub przez zahamowane wydłużenie translacji. Związek ten jest dodatkowo podkreślony przez skład SG. Podstawowymi składnikami SG są kompleksy preinicjacyjne z zatrzymaną translacją, mRNA i wybrane białka wiążące RNA (RBP). Celem składania SG jest oszczędzanie energii komórkowej poprzez sekwestrację mRNA zatrzymanych w translacji, co pozwala na zwiększoną translację białek reagujących na stres. Oprócz podstawowych składników, takich jak kompleksy preinicjacyjne z zatrzymaną translacją, SG zawierają mnóstwo innych białek i cząsteczek sygnałowych. Defekty w tworzeniu SG mogą upośledzać adaptację komórkową do stresu, a tym samym mogą sprzyjać śmierci komórki. SG i podobne granulki zawierające RNA zostały powiązane z wieloma chorobami ludzkimi, w tym zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i rakiem, co doprowadziło do niedawnego zainteresowania klasyfikacją i definicją podtypów granulek RNA. Protokół ten opisuje testy mające na celu scharakteryzowanie i ilościowe określenie SG ssaków.

Ogniska indukowane stresem niekoniecznie są ziarnistościami stresowymi (SGs). SGs klasyfikuje się jako cytoplazmatyczne ogniska zawierające mRNA, czynniki inicjacji translacji oraz białka wiążące RNA, które znajdują się w równowadze z aktywną translacją. Powyższy protokół może służyć jako szablon do charakterystyki tego, czy dany stres indukuje rzeczywiste bona fide SGs.
Granulki stresu (SGs) kolokalizują z innymi znany...

Granulki stresu (SGs) to niebłoniaste struktury cytoplazmatyczne, które tworzą się w komórkach narażonych na różne stresy. SG zawierają mRNA, białka wiążące RNA, małe podjednostki rybosomalne, czynniki związane z translacją i różne białka sygnalizacji komórkowej. Protokół ten opisuje przepływ pracy, który wykorzystuje kilka podejść eksperymentalnych do wykrywania, charakteryzowania i ilościowego określania SG w dobrej wierze.

Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Ogólnym celem tego schematu postępowania jest ustalenie, czy ogniska zidentyfikowane w cytoplazmie są rzeczywistymi ziarnistościami stresowymi, czyli ziarnistościami RNA, które odgrywają istotną rolę w fizjologii komórki. Główną zaletą tego schematu jest to, że pozwala on przetestować wszystkie podstawowe właściwości ziarnistości stresowych. Choć schemat ten został przedstawiony dla ludzkich komórek osteosarcoma U-2 OS, można go zastosować również do innych typów linii komórkowych oraz komórek pierwotnych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie wszystkie ogniska indukowane stresem są ziarnistościami stresowymi. Nasz schemat postępowania obejmuje wszystkie eksperymenty niezbędne do ich rozróżnienia. Procedurę tę zaprezentuję wraz z Anais Aulus.Jesteśmy stypendystami postdoktoranckimi w laboratorium Paula Andersona i Pavela Ivanova. Aby rozpocząć, wysiej komórki na szkiełka podstawowe umieszczone w płytkach 24-dołkowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po inkubacji nocnej odessaj pożywkę hodowlaną z dołków od B1 do B4 oraz od C1 do C4 w płytce 24-dołkowej.Do studni B1 i B2 dodaj 500 µL medium uzupełnionego o 100 µM arseniatu sodu, a następnie do studni B3 i B4 dodaj 500 µL medium uzupełnionego o 50 µM arseniatu sodu. Następnie do studni C1 i C2 dodaj 500 µL medium zawierającego 150 µM winorelbiny. Na koniec do studni C3 i C4 dodaj 500 µL medium uzupełnionego o 125 µM winorelbiny. Inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po 30 minutach inkubacji dodaj do komórek w drugiej kolumnie 5 µL roztworu cykloheksymidu o stężeniu 1 mg/mL, a do komórek w czwartej kolumnie 2 µL puromycyny o stężeniu 1,25 mg/mL. Delikatnie wstrząśnij płytkę, aby wymieszać roztwory, i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne 30 minut inkubacji.Aby utrwalić komórki, należy usunąć medium z dolków i przemyć komórki około 250 µL PBS. Następnie dodać około 250 µL buforowanego 4% roztworu paraformaldehydu w celu utrwalenia komórek, upewniając się, że górna część szkiełka cover-slip jest całkowicie przykryta. Płytkę pozostawić na kołysce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie usunąć i w odpowiedni sposób zutylizować paraformaldehyd. Dodać około 250 µL lodowatego metanolu w celu permeabilizacji i spłaszczenia komórek. Inkubować płytkę przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.Po zakończeniu permeabilizacji należy usunąć metanol i zablokować komórki, nakładając około 250 µL buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, dodając 12 µL przeciwciał przeciwko G3BP1, eIF4G i eIF3B do 3 mL buforu blokującego. Do każdego otworu płytki 24-dołkowej należy dodać 250 µL roztworu przeciwciał.Inkubuj płytkę na wytrząsarce przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie inkubacji usuń roztwór przeciwciał i przemyj komórki około 250 µl PBS przez pięć minut. Następnie, aby przygotować roztwór przeciwciał wtórnych, dodaj 12 µl przeciwciał Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 i Anti-Goat Cy5 wraz z 3 µl barwnika hooks do 3 ml buforu blokującego.Dodaj 250 µl roztworu przeciwciała wtórnego do każdej dołki i przykryj płytkę, aby chronić próbki przed światłem. Inkubuj płytkę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji usuń roztwór przeciwciał i przemyj komórki buforem PBS przez pięć minut.Podgrzewaj medium montażowe w bloku grzejnym o temperaturze 37°C przez 10 minut, aby zmniejszyć jego lepkość. Następnie, używając dociętego końcówki do pipety 200 µL, nanieś 25 µL medium montażowego na opisaną szkiełko przedmiotowe. Za pomocą precyzyjnej pęsety przenieś szkiełko nakrywkowe z dołka na szkiełko przedmiotowe, odwracając je tak, aby komórki stykały się z medium montażowym.Użyj czystego końcówki P200, aby docisnąć szkiełko nakrywkę. Po zamontowaniu wszystkich szkiełek nakrywczych usuń nadmiar medium montującego, mocno dociskając chusteczkę laboratoryjną do szkiełka przedmiotowego. Następnie wypłucz szkiełko wodą.Następnie należy natychmiast ponownie osączyć je ręcznikiem laboratoryjnym. Przeprowadź permeabilizację utrwalonych komórek, inkubując je z 250 microliters lodowatego metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie do opróżnionych dołków płytki dodaj około 250 microliters 70% ethanol i szczelnie zamknij płytkę za pomocą parafilmu, aby zapobiec odparowywaniu.Inkubować płytkę w temperaturze 4°C przez noc. Po inkubacji nocnej usunąć etanol i rehydratować komórki, dodając 500 µL 2XSSC. Inkubować szkiełka przykrywne przez pięć minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.Następnie wylać roztwór i ponownie dodać 500 µL SSC. Inkubować płytkę przez kolejne pięć minut przy delikatnym mieszaniu. Następnie wyłożyć dno pieca do hybrydyzacji paraf，ilmem i nanieść pipetą 25 µL buforu do hybrydyzacji na jego powierzchnię.Przenieś szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, odwracając górną część tak, aby komórki stykały się z buforem do hybrydyzacji. Inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze 42 °C przez 15 minut. Nanieś pipetą 25 µL roztworu biotynowanego oligo dT na parafilm w piecu do hybrydyzacji.Następnie, używając pincety, podnieś szkiełko cover-slip i osusz jego krawędź za pomocą chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar buforu do hybrydyzacji. Przenieś szkiełko do roztworu biotynowanego oligo dT, upewniając się, że komórki są skierowane twarzą w dół, i inkubuj w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Po zakończeniu hybrydyzacji dodaj około 500 µL uprzednio ogrzanego 2XSSC do dołków płytki 24-dołkowej.Następnie, używając pęsety, przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka i inkubuj je w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po ponownym barwieniu komórek roztworem przeciwciał, obejrzy preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przedstawione tutaj obrazy niepoddanych działaniu czynników komórek U-2 OS nie wykazują obecności żadnych granul ani ognisk zabarwionych markerami granul stresowych G3BP1, eIF4G i eIF3B.W komórkach U-2 OS traktowanych arsenitem sodu lub winorelbiną indukowano tworzenie ognisk cytoplazmatycznych zawierających G3BP1, eIF4G i eIF3B. Ko-lokalizacja tych markerów została potwierdzona za pomocą analizy skanowania liniowego wykonanej dla każdego kanału przy zwiększeniu powiększenia, a następnie poprzez nałożenie uzyskanych wykresów. Ponadto, zidentyfikowane w traktowanych komórkach ogniska cytoplazmatyczne zawierały mRNA, co wykazano za pomocą metody poly A FISH.Sygnał oligo dT współlokalizował z sygnałem G3BP1, co potwierdziło tożsamość ziarnistości stresowych. Po opanowaniu techniki cały ten proces może zostać przeprowadzony w ciągu trzech dni, jeśli jest wykonywany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać immunofluorescencję oraz hybrydyzację fluorescencyjną.Kroki krytyczne dla prawidłowej charakterystyki i identyfikacji ziarnistości stresowych. Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony indywidualnej oraz zapewnienie odpowiedniej wentylacji.

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Vonaesch, P. i in., Analiza immunofluorescencji powstawania ziaren stresowych po bakteryjnym wyzwaniu komórek ssaków. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje zakażenie komórek nabłonkowych patogenną bakterią Shigella flexneri oraz powstałą w wyniku tego odpowiedź komórkową gospodarza. Bakteryjne białka efektorowe zakłócają translację gospodarza, wywołując powstawanie organelli bez błony zwanej granulami stresowymi, które odzwierciedlają adaptacyjną odpowiedź komórki na infekcję.

Tworzenie ziaren stresowych podczas infekcji komórek nabłonka nowotworowego Shigella

Ten film demonstruje test do charakteryzowania i ilościowego oznaczania granulek stresu u ssaków, które składają się z mRNA, białek wiążących RNA (RBP) i różnych innych białek.

Test immunofluorescencyjny do charakterystyki i ilościowego oznaczania granulek stresu ssaków

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Granulki stresu (SGs) to granulki cytoplazmatycznego RNA zawierające zatrzymane cząstki rybonukleoproteiny (RNP) i ważne w odpowiedzi komórkowej na różne stresy. Dynamikę SG można śledzić w żywych komórkach, wizualizując lokalizację znakowanego składnika SG w transfekowanych komórkach pierwotnych po stresie.

Wizualizacja dynamiki granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych

Celem obecnego protokołu było opracowanie metody, która pozwoli na funkcjonalne analizy genomiczne wydzielania komórek tucznych. Protokół opiera się na ilościowej ocenie uwalniania fluorescencyjnego genu reporterowego skotransfekowanego z genem będącym przedmiotem zainteresowania oraz analizach morfologii granulki wydzielniczej w czasie rzeczywistym.

badanie granulek wydzielniczych komórek tucznych; od biosyntezy do egzocytozy

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Opisujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy tworzenia się granulek stresu w komórkach ssaków po tym, jak komórki są wystawione na działanie bakterii i wielu różnych stresów. Protokół ten można zastosować do badania odpowiedzi granulek stresu komórkowego w szerokim zakresie interakcji gospodarz-bakteria.

Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek tucznych otrzewnej. Opisujemy również dwa protokoły ich funkcjonalnej charakterystyki: obrazowanie fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego Ca2 + oraz test degranulacji oparty na kolorymetrycznej ocenie ilościowej uwolnionej β-heksozaminidazy.

Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca2+-obrazowania i testów degranulacji

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Poznaj metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu w komórkach ssaków. Protokół łączy immunofluorescencję i FISH do identyfikacji SG w liniach komórkowych.

Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków

Przeglądaj więcej filmów