Name: Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania błony mózgowej do izolacji białek z różnych kompartmentów synaptycznych mózgu myszy. To podejście ex vivo umożliwia badanie funkcji synaptycznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Ministerio de Economìa y Competitividad/Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 i PIE14/00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010), oraz Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) do F. C. Również X. M, V. F.-D. i F. C. należą do akredytowanej grupy badawczej "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251). Prace były również wspierane przez "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" z CAPES (Brazylia) do F.C.

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Barcelonie (CEEA), zgodnie z wytycznymi opisanymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych11 i zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej, prawem 86/609/CCE, FELASA i wytycznymi ARRIVE. W związku z tym myszy są trzymane w standardowych klatkach, z dostępem ad libitum do pożywienia i wody, i są utrzymywane w kontrolowanych standardowych warunkach (12-godzinny cykl ciemności/światła rozpoczynający się o 7:30, temperatura 22 °C i wilgotność 66%).
1. Uzyskiwanie synaptosomów mózgu myszy za pomocą nieciągłego gradientu sacharozy
Uwaga: Ta metoda została zgłoszona wcześniej10.
<ol>
	<li>Przygotować świeży bufor izolacyjny (IB) o pH 7,4, 2 M sacharozy, 1 M sacharozy/0,1 mM CaCl2 i 0,1 mM CaCl2 (patrz Tabela 1). Schłodzić roztwory na lodzie.</li>
	<li>Poświęć pięć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Odetnij głowę i szybko usuń mózg każdego zwierzęcia. Wypreparuj obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania (tj. hipokamp, 0,25-0,35 g świeżej tkanki) i umieść go w 5 ml szklanej probówki Pottera-Elvehjema na lodzie z 1 ml IB.</li>
	<li>Homogenizować tkankę za pomocą mieszadła homogenizującego (10 uderzeń przy 700-900 obrotach na minutę), najlepiej w łaźni lodowej, aby wykluczyć podgrzanie próbki.</li>
	<li>Umieścić homogenizowaną tkankę (1 ml) w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 6 ml 2 M sacharozy i 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 w temperaturze 4 °C. Mieszać powoli, odwracając probówkę. 
	Uwaga: Dodatek wapnia jest niezbędny do utrzymania interakcji adhezyjnych między organellami, a tym samym do zachowania struktury różnych "gęstości".</li>
	<li>Umieść roztwór w probówce wirówkowej o pojemności 12 ml i powoli dodaj 2,5 ml 1 M sacharozy/0,1 mM CaCl2 na wierzch każdej probówki, aby utworzyć gradient sacharozy. 
	Uwaga: Oznacz położenie interfejsu gradientu na probówce wirówki za pomocą trwałego markera.</li>
	<li>Zważyć i zrównoważyć probówki wirówkowe z roztworem IB w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi się pokrywami.</li>
	<li>Odwirowywać probówki przez 3 godziny w temperaturze 100 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem wahadłowym. Całkowicie napełnij wirnik wszystkimi stalowymi wspornikami (w razie potrzeby nawet pustymi).</li>
	<li>Odrzuć górną warstwę zawierającą mielinę. Za pomocą pipety Pasteura zebrać biały pierścień między interfazą sacharozy 1,25-M i 1-M odpowiadającą frakcji synaptosomu.</li>
	<li>Rozcieńczyć synaptosomy 9-krotnością ich objętości za pomocą IB w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Zważyć i zrównoważyć probówki wirówkowe z roztworem IB w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi się pokrywami.</li>
	<li>Odwirowywać probówki przez 30 minut przy 15 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,1 ml roztworu IB. Zebrać 100 μl tego roztworu synaptosomalnego i wirować przez 5 minut w temperaturze 11 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad synaptosomalny w 5% dodecylosiarczanie sodu (SDS) i przechowywać tę próbkę w temperaturze -20 ºC. 
	Uwaga: Ta próbka będzie odpowiadać całkowitej frakcji synaptosomu do dalszej analizy Western-blot. Pozostała frakcja synaptosomalna (~1 ml) może być albo zamrożona w temperaturze -20 ºC do czasu użycia, albo przetworzona w celu późniejszego frakcjonowania subsynaptycznego. Synaptosomy lub oczyszczone synapsy stanowią od 1 do 2% całkowitej objętości hipokampa12.</li>
</ol>
2. Izolacja przed, po- i pozasynaptyczna
<ol>
	<li>Przygotować 2x świeży bufor do solubilizacji, pH 6,0; 1x bufor do solubilizacji, pH 6,0; bufor do solubilizacji, pH 8,0; i 0,1 mM CaCl2 (patrz Tabela 1). Schłodzić roztwory na lodzie. 
	Uwaga: pH tych roztworów należy dokładnie dostosować, aby uzyskać dobre frakcjonowanie subsynaptyczne.</li>
	<li>Powoli rozcieńczyć 1 ml zawieszonej frakcji synaptosomalnej (patrz krok 1.12) 5 ml 0,1 mM CaCl2.</li>
	<li>Dodać taką samą objętość (5 ml) lodowatego buforu do rozpuszczania 2x o pH 6,0 i inkubować przez 50 minut na lodzie pod dużym mieszaniem w zlewce na lodzie. 
	Uwaga: Podczas gdy 1% Triton X-100 o pH 6,0 rozpuszcza wszystkie białka błony plazmatycznej, zachowuje białka w kontaktach lub połączeniach synaptycznych (tj. strukturach pre- i postsynaptycznych)4.</li>
	<li>Umieść roztwór w probówce wirówkowej. Zważyć i zrównoważyć probówki z równoważnymi objętościami 0,1 mM CaCl2 i 2x roztworem buforowym do solubilizacji, pH 6,0, w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi pokrywkami.</li>
	<li>Odwirowywać probówki przez 30 minut przy 40 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem wahadłowym. Otrzymany supernatant reprezentuje frakcję pozasynaptyczną, a osad odpowiada połączeniom synaptycznym (tj. frakcjom pre- i postsynaptycznym).</li>
	<li>Zagęścić supernatant zawierający frakcję pozasynaptyczną do końcowej objętości 200 μl za pomocą 15 ml 10K probówki filtracyjnej odwirowanej w temperaturze 4 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Otrzymaną stężoną frakcję pozasynaptyczną (200 μl) wytrącić 5 objętościami (1 ml) wstępnie schłodzonego (-20 °C) acetonu przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Następnego dnia odwirować frakcję pozasynaptyczną przez 30 minut w temperaturze 18 000 x g i temperaturze -15 °C. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant acetonu i wysuszyć osad, aby usunąć wszelkie ślady acetonu.</li>
	<li>Na koniec ponownie zawiesić osad zawierający białka pozasynaptyczne z 200 μl 5% SDS. W razie potrzeby poddać sonikację osadu.</li>
	<li>Nie przerywając go, ostrożnie przemyć osad zawierający frakcje pre- i postsynaptyczne 2 ml 1x buforu do rozpuszczania o pH 6,0. Odrzuć bufor.</li>
	<li>Zawiesić osad z 10 ml 1x buforu do rozpuszczania o pH 8,0, używając szklanej pipety Pasteura. 
	Uwaga: Podczas gdy 1% Triton X-100 przy pH 8,0 rozpuszcza specjalizację presynaptyczną, zachowuje nierozpuszczalną gęstość postsynaptyczną4.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę przez 50 minut na lodzie przy silnym mieszaniu w zlewce na lodzie.</li>
	<li>Umieść roztwór w probówce wirówkowej. Zważyć i zrównoważyć probówki z 1x roztworem buforowym do solubilizacji, pH 8,0, w odpowiednich stalowych wspornikach i z zamykającymi się pokrywkami.</li>
	<li>Odwirowywać probówki przez 30 minut przy 40 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym; otrzymany supernatant odpowiada frakcji presynaptycznej, a osad frakcji postsynaptycznej.</li>
	<li>Przetwarzać supernatant zawierający frakcję presynaptyczną, jak opisano w krokach 2.6-2.9.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający frakcję postsynaptyczną w 200 μl 5% SDS. W razie potrzeby poddać sonikację osadu.</li>
</ol>
3. Analizuj próbki za pomocą immunoblot, aby potwierdzić frakcjonowanie błony
<ol>
	<li>Określ ilość białka w każdej frakcji (tj. frakcję całkowitą, dodatkową, pre- i postsynaptyczną) za pomocą testu białka kwasu bicinchoninowego.</li>
	<li>Pobrać 20 μg białka z każdej frakcji i rozcieńczyć je do końcowej objętości 50 μl w buforze do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE). Gotować przez 5 minut w temperaturze 100 ºC.</li>
	<li>Oddzielić białka za pomocą elektroforezy SDS-PAGE 10%, z 4% koncentratem żelu w warunkach redukcyjnych. Elektroforezę przy stałym napięciu 80 V, aż barwnik dostanie się do dolnego żelu, a następnie zwiększyć napięcie do 120 V.</li>
	<li>Przenieś białka do membrany PVDF i blokuj roztworem blokującym IB przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
	<li>Inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 ºC ze wskazanym przeciwciałem pierwszorzędowym (tj. anty-SNAP-25, anty-PSD-95, anty-synaptofizyną lub anty-GPR37) rozcieńczonym w roztworze blokującym IB pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
	<li>Przemyć membranę trzy razy (po 10 minut) roztworem myjącym IB w celu wyeliminowania niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Inkubować ze wskazanym przeciwciałem drugorzędowym przez 90 minut w ciemnych warunkach w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
	<li>Przemyć membranę trzykrotnie (po 10 minut) roztworem myjącym IB w celu wyeliminowania niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.</li>
	<li>Inkubować membranę z podłożem chemiluminescencyjnym (przygotować mieszaninę w ciemnych warunkach i zgodnie z proporcją 1:1 roztworów A i B podaną przez producenta).</li>
	<li>Przeanalizuj membranę w chemiluminescencyjnym urządzeniu detekcyjnem.</li>
</ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/textbookofphysio1897fost">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).</li>
<li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%22">The fine structure of the nervous system</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357909">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li>
<li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presynaptic+particle+web%3A+ultrastructure%2C+composition%2C+dissolution%2C+and+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li>
<li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+adenosine+A%281%29+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li>
<li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1%2C+P2X2%2F3%2C+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1%2C+P2Y2%2C+and%2For+P2Y4+Receptors+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li>
<li>Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits%3A+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li>
<li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parkinson%27s+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus%3A+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li>
<li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%25+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart%3A+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li>
<li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li>
<li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li>
<li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li>
<li>Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li>
<li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li>
<li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pael+receptor%2C+endoplasmic+reticulum+stress%2C+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9(2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół stanowi potężne narzędzie biochemiczne do badania subsynaptycznego rozmieszczenia określonych białek w dowolnym regionie mózgu. Istnieją jednak pewne wady związane z tą techniką, które zasługują na podkreślenie w tym miejscu. Na przykład jednym z głównych ograniczeń jest stosunkowo duża ilość tkanki potrzebna do oczyszczenia rozsądnej ilości białka w celu przeprowadzenia analizy immunoblot wszystkich frakcji subsynaptycznych. Problem ten może być związany z faktem, że synapsy (tj. sy...

Transmisja synaptyczna opiera się na fizycznej integralności synapsy, koncepcji, która została przewidziana już w 1897 roku przez Fostera i Sherringtona1. W związku z tym zrozumienie rozmieszczenia kluczowych składników neurotransmisji (np. kanałów jonowych, receptorów itp.) jest niezbędne do wyjaśnienia funkcji synaptycznych, zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach. Mikroskopia elektronowa (EM) w ogromnym stopniu przyczyniła się do obecnego ultrastrukturalnego pojęcia prototypowych synaps ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W ten sposób EM precyzyjnie ustalił różnice między gęstościami pre- i postsynaptycznymi, które są oddzielone szczeliną o dość jednolitej odległości (~25 nm)2. Co ciekawe, aparat postsynaptyczny wykazuje względnie ciągłe, gęste od elektronów pogrubienie poniżej błony plazmatycznej, tzw. gęstość postsynaptyczną, czyli PSD2. I odwrotnie, w aparacie presynaptycznym zauważalna nieciągła sieć cytomatrix jest umieszczona tuż pod błoną plazmatyczną, co jest niezbędne do wyrównania i dokowania pęcherzyków synaptycznych do strefy aktywnej błony plazmatycznej3. W związku z tym EM stanowi złote podejście eksperymentalne do badania dystrybucji białek w strukturalnie zachowanych synapsach OUN. Jednak informacje dostarczane przez mikrofotografie elektronowe są statyczne. Rzeczywiście, coraz więcej dowodów pokazuje, że synapsy in vivo są niezwykle dynamiczne, a zatem doświadczają dramatycznych zmian strukturalnych przy długotrwałej transmisji synaptycznej. Ponadto morfologia i skład synaps mogą się zmieniać w różnych regionach OUN oraz w trakcie rozwoju, dojrzewania, starzenia się i rozwoju stanów neuropatologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół skoncentrowany na izolowaniu białek należących do różnych przedziałów synaptycznych w warunkach fizjologicznych stanowi cenne narzędzie do bardziej kompleksowego badania funkcjonowania synapty.
Tutaj opisujemy ten rodzaj uzupełniającego podejścia eksperymentalnego, które pozwala na preparatywne wzbogacenie biochemiczne różnych przedziałów błony synaptycznej - mianowicie poza-, pre- i postsynaptycznych domen błonowych. Ta metoda frakcjonowania błonowego, po raz pierwszy opisana przez Philipsa i wsp. (2001)4, opiera się na przesunięciu pH, które osłabia interakcje adhezyjne zachodzące w aparacie pre- i postsynaptycznym. Po pierwsze, stosując łagodne detergenty o pH 6,0, można dostrzec połączenie adherens, które utrzymuje aparat pre- i postsynaptyczny i które jest utrzymywane z pozasynaptycznej domeny błonowej, która jest rozpuszczona, a zatem może być ekstrahowana z kontaktów synaptycznych. Następnie podniesienie pH z 6,0 do 8,0 w obecności łagodnych detergentów osłabia siłę połączenia adherens, które utrzymuje presynaptyczną strefę aktywną ściśle związaną z gęstością postsynaptyczną. W związku z tym przedział presynaptyczny jest rozpuszczony i może zostać oddzielony od gęstości postsynaptycznej, która jest w większości zachowana, ponieważ stężenie użytego detergentu nie sprzyja jego rozpuszczaniu4. Co ciekawe, skuteczność frakcjonowania, ostatecznie wyższa niż 90%, może być potwierdzona przez różne markery subsynaptyczne: i) białko 25 związane z synaptosomalami (SNAP-25) z presynaptycznej strefy aktywnej; ii) synaptofizyna, z frakcji pozasynaptycznej (tj. poza strefą aktywną i obejmująca mikrosomy); oraz iii) białko gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95), z gęstości postsynaptycznej. Warto zauważyć, że ta metoda frakcjonowania błony mózgowej została z powodzeniem zastosowana. W związku z tym udało się precyzyjnie określić subsynaptyczną lokalizację różnych receptorów, takich jak receptory kwasu alfa-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA)5, receptor adenozyny A1 (A1R)6, receptor adenozyny A2A (A2AR)7, receptory adenozynotrifosforanu (ATP) P28, podjednostki receptora nikotynowego acetylocholiny9, oraz receptor choroby Parkinsona GPR3710. Szereg ograniczeń może jednak utrudniać prawidłową ocenę rozkładu synaptycznego danego białka neuronalnego. Dlatego w tej procedurze nie tylko w pełni opisujemy cały protokół, ale także podkreślamy kilka krytycznych punktów, które należy wziąć pod uwagę, takich jak dość duża ilość potrzebnej tkanki, niska wydajność białka i obowiązkowy wymóg walidacji skuteczności każdej separacji przed wykonaniem ostatecznego eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Trzustka Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Trzustka Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy Zestaw III</td><td>Millipore, Darmstadt, Niemcy</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Trzustka Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko</td><td></td><td></td><td></td>w proszku</tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Trzustka Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1 314 941 210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Hiszpania</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Hiszpania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptowalny homogenizator</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Probówki powinny być prawie całkowicie napełnione, gdy są używane, aby zapobiec zapadaniu się w wyniku ultrawirowania.</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Hiszpania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane pipety Pasteura 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Waga kompaktowa EK-610</td><td>A& D, Tokio, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna GR 200</td><td>A& D, Tokio, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GPR37</td><td>Domowe przeciwciało anty-GPR37 wyprodukowane i zwalidowane w laboratorium Francisco Ciruela.</td><td></td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe stosowane w końcowym stężeniu 0,250 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anty-PSD-95, anty-synaptofizyna</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td></td><td>Pierwszorzędowe przeciwciała rozcieńczone 1:10 000</td></tr><tr><td>HRP sprzężone z kozią anty-mysią IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:10 000</td></tr><tr><td>koniugugowaną z HRP kozą anty-króliczą IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone 1:30 000</td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Ocena składu i funkcji białek synaptycznych stanowi ważne wyzwanie w neurobiologii. Jednak nie jest łatwo ocenić neuroprzekaźnictwo zachodzące w synapsach, ponieważ jest ono wysoce regulowane przez dynamiczne interakcje białko-białko i zdarzenia fosforylacji. W związku z tym, gdy stosuje się jakąkolwiek metodę do badania transmisji synaptycznej, głównym celem jest zachowanie tych przejściowych modyfikacji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych. Innymi słowy, protokół opisuje metodologię biochemiczną do przeprowadzania wzbogacania białek z przedziałów presynaptycznych, postsynaptycznych i pozasynaptycznych. Po pierwsze, synaptosomy lub zakończenia synaptyczne uzyskuje się z neuronów, które zawierają wszystkie przedziały synaptyczne za pomocą nieciągłego gradientu sacharozy. Warto zauważyć, że jakość tego początkowego preparatu błony synaptycznej ma kluczowe znaczenie. Następnie izolację różnych przedziałów subsynaptycznych uzyskuje się za pomocą lekkiej solubilizacji przy użyciu łagodnych detergentów w różnych warunkach pH. Pozwala to na separację przez wirowanie gradientowe i izopikenne. Wreszcie, wzbogacenie białek w różnych przedziałach subsynaptycznych (tj. pre-, post- i zewnątrzsynaptycznych frakcjach błonowych) jest walidowane za pomocą analizy immunoblot przy użyciu dobrze scharakteryzowanych markerów białka synaptycznego (tj. odpowiednio SNAP-25, PSD-95 i synaptofizyny), umożliwiając w ten sposób bezpośrednią ocenę dystrybucji synaptycznej dowolnego konkretnego białka neuronalnego.

Opisana metodologia była szeroko stosowana do analizy subsynaptycznej białek neuronalnych w ujęciu ogólnym oraz w szczególności do izolacji i charakterystyki biochemicznej receptorów synaptycznych5,6,7,8,9. Co ciekawe, przedstawiony tutaj reprezentatywny wynik wykazuje użyteczność tej procedury eksperymentalnej w analizie subsy...

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie białek należących do różnych przedziałów synaptycznych z mózgu myszy. Opisanie rozkładu komponentów transmisji kinetycznej jest niezbędne do zrozumienia funkcji synaptycznej zarówno w warunkach prawidłowych, jak i patologicznych. Narastające dowody wskazują, że synapsy in vivo są niezwykle dynamiczne i mogą ulegać gwałtownym zmianom strukturalnym, utrzymując przy tym transmisję synaptyczną.Synapsy były klasycznie badane za pomocą mikroskopii elektronowej. Ta metoda frakcjonowania błon opiera się na połączeniu obliteracji laserowej z użyciem łagodnych detergentów w różnych warunkach pH, a następnie szybkim wirowaniu. W skrócie, mózg myszy zostaje usunięty, a jego hipokamp jest ostrożnie wycinany w chłodnym naczyniu umieszczonym na kruszonym lodzie.Hipokampy przenosi się do szklanej rurki Potter-Elvehjem zawierającej lodowaty bufor izolacyjny. Następnie zebraną tkankę homogenizuje się za pomocą homogenizatora mechanicznego. Po tym procesie zhomogenizowaną tkankę miesza się z roztworem sacharozy i wapnia.Następnie ekstrakt tkankowy przykrywa się stężonym roztworem sacharozy i wapnia. Próbki są następnie poddawane wirowaniu. Frakcja błonias

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

In situ frakcjonowanie subkomórkowe komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu umożliwia wizualizację lokalizacji białek.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Ta procedura ilustruje, jak wyizolować z mózgu dorosłej myszy błony ER związane z mitochondriami lub MAM oraz frakcje mikrodomen wzbogacone glikosfingolipidami z MAM i preparatów mitochondrialnych.

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Ten artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyki synaptycznej przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie sacharozy. Opisano również późniejsze przygotowanie białek o gęstości postsynaptycznej. Preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Poznaj metodę frakcjonowania błony mózgowej do izolacji białek z różnych kompartmentów synaptycznych mózgu myszy. To podejście ex vivo umożliwia badanie funkcji synaptycznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Przeglądaj więcej filmów