Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie białek należących do różnych przedziałów synaptycznych z mózgu myszy. Opisanie rozkładu komponentów transmisji kinetycznej jest niezbędne do zrozumienia funkcji synaps zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że synapsy in vivo są niezwykle dynamiczne i mogą ulegać dramatycznym zmianom strukturalnym, które otwierają się, podtrzymując transmisję synaptyczną.

Synapsy zostały klasycznie przebadane za pomocą mikroskopii elektronowej. Ta metoda frakcjonowania membranowego opiera się na połączeniu obliteracji laserowej przy użyciu łagodnych detergentów w różnych warunkach pH, a następnie wirowania w ułamku sekundy. Krótko mówiąc, mózg myszy jest usuwany, a jej hipokamp jest starannie preparowany w przyjemnym zimnym naczyniu osadzonym na pokruszonym lodzie.

Hipokampy są zbierane do szklanej rurki Pottera-Elvehjema zawierającej lodowaty bufor izolacyjny. Następnie pobrana tkanka jest homogenizowana za pomocą mieszadła homogenizującego. Następnie homogenizowaną tkankę miesza się z roztworem sacharozy i wapnia.

Następnie ekstrakt tkankowy nakłada się na stężony roztwór sacharozy i wapnia. Próbki są następnie odwirowywane. Frakcja błonowa zawierająca synaptosomy jest łatwo rozpoznawalna jako gęsty pierścień unoszący się na granicy faz roztworu sacharozy.

Następnie izolację różnych przedziałów subsynaptycznych, a mianowicie frakcji dodatkowych, wstępnych i postsynaptycznych, uzyskuje się poprzez połączenie solubilizacji światła przy użyciu łagodnych detergentów w warunkach różnicowania pH. Na koniec wzbogacenie białek w różnych przedziałach jest weryfikowane za pomocą analizy immunoblot. W dniu eksperymentu przygotuj świeże roztwory i schłodź je na lodzie.

Umieść mózg na szalce Petriego, osadzonej na kruszonym lodzie i zawierającej 10 mililitrów lodowatego buforu izolacyjnego. Ostrożnie wypreparuj hipokamp za pomocą kleszczy. Przenieś hipokampy do pięciomililitrowej szklanej rurki Pottera-Elvehjema zawierającej jeden mililitr lodowatego buforu izolacyjnego.

A następnie homogenizować za pomocą mieszadła homogenizującego. Przenieś homogenizowaną tkankę do 15-mililitrowej probówki Falcona zawierającej sacharozę i roztwór wapnia i powoli mieszaj, odwracając probówkę. Umieść roztwór w ultra przezroczystej probówce wirówkowej i dodaj na wierzch każdej probówki 2,5 mililitra sacharozy zawierającej chlorek wapnia.

I skalibrować probówki z izolacyjnym roztworem buforowym i wirować przez trzy godziny w temperaturze 100 000 G w czterech stopniach w ultrawirówce. Ostrożnie wyjmij probówkę ze stalowego wspornika wirówki i zidentyfikuj gęsty pierścień w granicy faz sacharozy, który zawiera synaptosomy. Wyrzuć górną warstwę mailingu za pomocą niebieskiej końcówki.

Za pomocą pipety Pasteura zbierz gęsty pierścień zawierający frakcje synaptosomów i przenieś do ultra przezroczystej probówki wirówkowej i trzymaj na pokruszonym lodzie. Rozcieńczyć synaptosomy dziewięcioma objętościami lodowatego buforu izolacyjnego i odwirować przez 30 minut w temperaturze 15 000 G w temperaturze czterech stopni. Po odwirowaniu wyjmij probówkę.

Odrzucić supernatant. Powinna być widoczna otoczka zawierająca synaptosomy. Ponownie zawiesić granulat z 1,1 mililitra bufora izolacyjnego i pozostać na pokruszonym lodzie do następnego kroku.

Przygotuj świeże roztwory o odpowiednim pH dostosowanym do czterech stopni. Dodawać powoli jeden mililitr zawieszonego osadu synaptosomalnego do pięciu mililitrów chlorku wapnia w zlewce na lodzie pod ciągłym mieszaniem. Następnie w pięciu mililitrach stężonego buforu do rozpuszczania o pH 6.

Po 50 minutach na lodzie przenieś roztwór do bardzo przezroczystej probówki wirówkowej i odwiruj przy 40 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni. Po odwirowaniu wyjmij probówkę. Należy obserwować osad zawierający frakcję pre i postsynaptyczną.

Supernatant zawierający dodatkową frakcję synaptyczną zbiera się w 15-mililitrowej probówce zagęszczającej. Ostrożnie umyj osad dwoma mililitrami buforu do solubilizacji o pH sześć. Unikaj przerywania osadu i wyrzuć bufor.

Przy 10 mililitrach buforu solubilizującego pH osiem do osadu i miareczkować za pomocą pipety Pasteura. Inkubować zlewkę na lodzie pod ciągłym mieszaniem przez 50 minut. Przenieść roztwór do bardzo przezroczystej probówki wirówkowej i odwirować przy 40 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni.

Po odwirowaniu wyjmij probówkę. Należy obserwować osad zawierający frakcję postsynaptyczną. Supernatant zawierający frakcję presynaptyczną zbiera się w 15-mililitrowej probówce zagęszczającej.

Osad zawierający frakcję postsynaptyczną zawiesza się w 200 mikrolitrach roztworu STS. Sonikować zawieszone osady. Ocenić ilość białka w każdej frakcji za pomocą testu oznaczania białka.

Weź 20 mikrogramów białka z każdej frakcji i potraktuj buforem do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym STS. Oddziel białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym STS i przeanalizuj za pomocą immunoblot. GPR37 to kolejny fantazyjny globalny receptor białkowy, głównie w mózgu gryzoni.

Zaangażowany w różne patologie, takie jak choroba Parkinsona lub poważna depresja, jego funkcja pozostaje nieprawidłowa. Badanie obecności tego receptora w synapsach może pomóc w rozszyfrowaniu jego roli w ośrodkowym układzie nerwowym. Synaptosomy myszy typu dzikiego i myszy z nokautem GPR37 wyizolowano, a następnie frakcjonowano.

Czystość każdego przedziału subsynaptycznego była gwarantowana przez segregację odpowiednich markerów synaptycznych. Dodatkowy synaptyczny marker pęcherzykowy synaptofizyna została wzbogacona w tę dodatkową frakcję synaptyczną. Białko BSD 95, klasyczny marker gęstości postsynaptycznej, zostało wzbogacone w odpowiednią frakcję postsynaptyczną.

Wreszcie, czystość frakcji presynaptycznej została potwierdzona przez obecność SNAP 25, markera presynaptycznej strefy aktywnej. Co ciekawe, podczas gdy reaktywność immunologiczna GPR 37 była bardziej obfita we frakcji pozasynaptycznej, wykazywała również znaczną preferencję dla frakcji postsynaptycznej w stosunku do frakcji presynaptycznej. Ocena składu białek subsynaptycznych jest ważnym wyzwaniem w neurobiologii.

Nie jest to jednak łatwe zadanie, ponieważ jest silnie regulowane przez wstęgi interakcji białek. W tym miejscu przedstawiamy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę selekcji białek należących do różnych przedziałów synaptycznych. Innymi słowy, jest opisany twój technologia chemiczna do przeprowadzania wzbogacania białek z przedziałów presynaptycznych, postsynaptycznych i pozasynaptycznych.

Do widzenia i życzę powodzenia w eksperymentach z frakcjonowaniem.