Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej
1 maja 2017
Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.
Ogólnym celem tej procedury jest uchwycenie dynamiki błony za pomocą mikroskopii elektronowej po indukcji aktywności neuronalnej za pomocą optogenetyki, a następnie zamrożenie komórek w określonych punktach czasowych po stymulacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii i biologii komórki dotyczące mechanizmów recyklingu pęcherzyków synaptycznych, a także być może modelowania w bardzo szybkiej skali czasowej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji zmian morfologicznych w komórce za pomocą mikroskopii elektronowej w milisekundowej skali czasowej.
Procedura zostanie zademonstrowana przez Shuo Li, doktoranta i Sumanę Raychaudhuri, pracownika naukowego. Oba z mojego laboratorium. Przed przygotowaniem utrwalacza oznacz ołówkiem dwa mililitrowe pilniki kriogeniczne zgodnie z numerami ich próbek.
Następnie połączyć wszystkie odczynniki utrwalające i wsypać jeden mililitr objętości utrwalacza do każdej fiolki. Po zamknięciu probówek należy natychmiast zanurzyć utrwalacze w ciekłym azocie i przechowywać fiolki w zamkniętym pudełku styropianowym. Następnie napełnij ciekłym azotem automatyczną jednostkę do bezpłatnego zastępowania i zamrażarkę wysokociśnieniową.
Następnie umieść mały pojemnik z acetonem w komorze na próbki jednostki wolnego podstawiania i poczekaj, aż temperatura jednostki podstawiania osiągnie minus 90 stopni Celsjusza. Aby zaprogramować protokół stymulacji światłem, kliknij przycisk edytuj w oknie stymulacji światłem na monitorze dotykowym. Otworzy się kolejne okno.
Wprowadź 15 sekund dla fazy ciemnej. 100 milisekund dla okresu. 10 milisekund dla impulsu i jeden dla liczby okresów dla pojedynczego 10-milisekundowego bodźca.
Na ekranie głównym upewnij się, że pole stymulacji światłem jest zaznaczone, a następnie kliknij przechowywanie próbki, a następnie edytuj. W nowym oknie użyj przycisku plus lub minus, aby wybrać dwie próbki do przechowywania dwóch próbek w każdym kanale i potwierdź, że wybrano opcję włączonego przechowywania ciekłego azotu. Teraz pod mikroskopem stereoskopowym umieść szafirową komórkę tarczową stroną do góry w studzience środkowej czarnej płytki.
Następnie znajduje się pierścień dystansowy o średnicy 100 mikronów. Zanurz jedną stronę pustego krążka szafirowego we wstępnie podgrzanym roztworze soli fizjologicznej i umieść krążek na pierścieniu dystansowym solą fizjologiczną do dołu. Umieść kolejny pierścień dystansowy o średnicy 100 mikronów.
I 400-mikronowy pierścień dystansowy na górze ostatniego szafirowego krążka i użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar płynu. Trzymając próbki, upewnij się, że nie zatrzymujesz żadnych pęcherzyków powietrza między szafirowymi krążkami. Następnie umieść cały zespół między dwoma przezroczystymi półcylindrami i zamknij górną czerwoną pokrywę, aby rozpocząć proces zamrażania.
Czerwona pokrywa wyskoczy automatycznie po zakończeniu procesu zamrażania. Gdy wszystkie próbki zostaną zamrożone, otwórz drzwi do dewara do przechowywania i przenieś dewara na blat. Przenieść komorę na próbkę z dewara do przechowywania na specjalistyczną tacę na próbki wypełnioną ciekłym azotem.
I odblokuj pokrętło, aby zwolnić kubek na próbkę. Następnie użyj pęsety z końcówkami chłodzonymi ciekłym azotem, aby usunąć przezroczyste półcylindry z kubka na próbkę. I ostrożnie przenieś środkowe czarne płytki do małej filiżanki zawierającej ciekły azot.
Należy uważać, aby zamrożone próbki były zawsze przechowywane w ciekłym azocie i zawsze obchodzić się z próbkami za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety. Ponownie schłodzić pęsetę i szybko przenieść pierwszą środkową płytkę do wstępnie schłodzonego acetonu. Delikatnie potrząśnij i postukaj w płytkę, aby oddzielić szafirowy krążek od płytki.
Następnie umieść otwarty kriogeniczny pilnik utrwalacza w komorze na próbki w jednostce podstawiania. Przenieść krążek szafiru do fiolki. I natychmiast zakręć fiolkę.
Po przeniesieniu wszystkich próbek należy ustawić odpowiednie parametry programu do wolnej substytucji i uruchomić program. Pod koniec programu bezpłatnej substytucji użyj rękawiczek, aby przenieść pliki kriogeniczne z komory na próbki do okapu chemicznego i użyj pipety, aby dodać aceton o temperaturze pokojowej do każdej fiolki. Płukać w każdej fiolce świeżym acetonem cztery do sześciu razy w ciągu jednej do dwóch godzin.
Następnie dodaj świeżo przygotowaną 30% żywicę epoksydową do każdej fiolki na dwie do trzech godzin inkubacji w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min. Pod koniec inkubacji zastąp 30% żywicę epoksydową 70% żywicą epoksydową na trzy do czterech godzin inkubacji na wytrząsarce orbitalnej. Następnie za pomocą pęsety przenieś każdy krążek, komórką do góry, na nakrętkę kapsułki do zatapiania i dodaj 90% żywicy epoksydowej do krążków w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego ranka przenieś każdy szafirowy krążek do nasadki nowej kapsułki do zatapiania i napełnij nasadkę świeżo przygotowaną 100% żywicą epoksydową. Po ostatniej inkubacji ze 100% żywicy epoksydowej należy spolimeryzować próbki w piecu o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Gdy próbki ulegną polimeryzacji, umieść pierwszą próbkę do góry nogami na mikroskopie stereoskopowym, tak aby szafirowy krążek znajdował się w górnej części bloku żywicy i użyj żyletki, aby usunąć cienką warstwę żywicy z górnej części próbki.
Następnie użyj żyletki, aby wyciąć płytką linię wzdłuż krawędzi dysku, aby oddzielić szafirowy krążek od żywicy epoksydowej. I zanurz krążek w ciekłym azocie na około 10 sekund, aby oddzielić krążek od reszty żywicy. Przenieś żywicę pod mikroskop preparacyjny i przyklej próbkę do stolika mikroskopu.
Korzystając z powiększenia od czterech do 10 razy, znajdź obszar z komórkami i użyj obosiecznej żyletki, aby wyciąć obszar o wymiarach dwa na dwa milimetry wokół obszaru zainteresowania. Następnie użyj kleju superglue, aby zamontować komórki na cylindrycznym atrapie bloku wykonanym z żywicy epoksydowej i inkubować blok w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Po przecięciu na ultra mikrotomie przenieś próbki do transmisyjnego mikroskopu elektronowego w celu zobrazowania w powiększeniu 930 000x.
Na tym obrazie pokazano fuzję pęcherzyków synaptycznych poprzez egzocytozę zarejestrowaną 15 milisekund po pojawieniu się światła w strefie aktywnej błony presynaptycznej w neuronach hipokampa myszy. 100 milisekund po nadejściu światła można zaobserwować dół endocytotyczny przylegający do strefy aktywnej, ilustrujący ultraszybką endocytozę przez komórkę nerwową. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać próbki za pomocą eksperymentów flash i freeze
.Pamiętaj, że praca z aldehydem glutarowym, tetratlenkiem osmu i ciekłym azotem może być naprawdę niebezpieczna, dlatego upewnij się, że nosisz odzież ochronną. Po opanowaniu, zamrażanie tej procedury można wykonać w ciągu kilku godzin dla 12 próbek, ale reszta procedur, w tym obrazowanie i analiza obrazu, może zająć nawet dni, tygodnie, a nawet miesiące, więc może to być naprawdę długa procedura. Jeśli zlokalizujesz białka lub zobrazujesz ich dynamikę, możesz również użyć różnych protokołów, aby zachować antygenowość lub perescencję białek perłowych i zobrazować ich dynamikę za pomocą tych technik.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia technikę „flash-and-freeze” (błysk i zamrażanie), metodę rozdzielczości czasowej w mikroskopii elektronowej, która umożliwia wizualizację szybkiej dynamiki błon w neuronach. Poprzez połączenie stymulacji optogenetycznej z zamrażaniem wysokociśnieniowym badacze mogą rejestrować zmiany morfologiczne, takie jak fuzja pęcherzyków synaptycznych i endocytoza, z rozdzielczością czasową rzędu milisekund oraz przestrzenną rzędu nanometrów. Protokół został zademonstrowany na neuronach hipokampa myszy wykazujących ekspresję channelrhodopsiny, co pozwala na precyzyjną indukcję i obserwację zdarzeń synaptycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikroskopia elektronowa
- Optogenetyka
Wstęp
- Błony komórkowe i rozkład białek są wysoce dynamiczne, jednak ich wizualizacja z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną jest trudna.
- Tradycyjna mikroskopia elektronowa nie pozwala na rejestrację szybkich, przejściowych zdarzeń komórkowych.
- Optogenetyka umożliwia precyzyjną kontrolę czasową aktywności neuronów.
- Zrozumienie recyklingu pęcherzyków synaptycznych i dynamiki błon jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie metody wizualizacji szybkiej dynamiki błon w neuronach.
- Rejestracja zmian morfologicznych podczas transmisji synaptycznej w określonych punktach czasowych po stymulacji.
- Dostarczenie protokołu umożliwiającego badaczom analizę fuzji pęcherzyków synaptycznych i endocytozy z wysoką precyzją czasową.
Zastosowane metody
- Ekspresja channelropsyny w neuronach hipokampa myszy w celu stymulacji optogenetycznej.
- Indukcja aktywności neuronalnej za pomocą kontrolowanego impulsu światła.
- Mrożenie wysokociśnieniowe komórek w określonych punktach czasowych po stymulacji.
- Przetwarzanie próbek, obejmujące substytucję mroźną, zatapianie w żywicy,y cięcie na sekcje oraz obrazowanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Skuteczne uchwycenie fuzji pęcherzyków synaptycznych (egzocytozy) w ciągu 15 ms po stymulacji światłem.
- Obserwacja zagłębień endocytatywnych wskazujących na ultraszybką endocytozę 100 ms po stymulacji.
- Wygenerowanie dużych zbiorów danych do ślepej analizy zmian morfologicznych w czasie.
- Wykazanie, że metoda flash-and-freeze umożliwia wizualizację dynamiki błon z rozdzielczością milisekundową.
Wnioski
- Technika błyskawicznego mrożenia (flash-and-freeze) stanowi potężne podejście do badania szybkich zdarzeń komórkowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
- Metoda ta usprawnia możliwość badania mechanizmów recyklingu pęcherzyków synaptycznych oraz przebudowy błon.
- Protokoły można dostosować do lokalizacji białek lub wizualizacji dynamiki białek, stosując alternatywne techniki utrwalania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia elektronowa z szybkim mrożeniem (flash-and-freeze) umożliwia bezpośrednią wizualizację gwałtownej dynamiki błon z rozdzielczością milisekundową i nanometrową, wypełniając krytyczną lukę w mechanistycznej weryfikacji ryzyk w procesach badawczych z zakresu neurobiologii i biologii komórki. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz analizie funkcjonalnych szlaków sygnałowych, w szczególności w odniesieniu do cyklu pęcherzyków synaptycznych i przebudowy błon. Podejście to pozwala na generowanie wysokotreściowych zbiorów danych, które wspierają decyzje na etapie wczesnego odkrywania oraz badania translacyjne w ramach portfolio neurobiologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację zdarzeń fuzji i regeneracji błon po stymulacji optogenetycznej.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez rejestrowanie przejściowych zmian morfologicznych w określonych punktach czasowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w cykl pęcherzyków synaptycznych i transport błonowy.
- Dostarcza dowodów w wysokiej rozdzielczości, co pozwala zwiększyć pewność przewidywań w programach we wczesnej fazie.
Przesiew i opracowanie testu
- Umożliwia stworzenie zwalidowanych systemów biologicznych dla dalszych etapów ilościowego obrazowania.
- Dostarcza powtarzalne, rozdzielcze w czasie zbiory danych odpowiednie do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Umożliwia standaryzację protokołów stymulacji i zamrażania w celu zapewnienia skalowalności testów.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków chemicznych lub perturbacji genetycznych na dynamikę błon.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie odczytów morfologicznych z procesami synaptycznymi i błonowymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość przejścia od mechanistycznych spostrzeżeń na etapie odkryć do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Umożliwia dostosowanie postępów prac do poziomu ryzyka poprzez powiązanie zdarzeń komórkowych z efektami funkcjonalnymi.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez ilościową analizę kinetyki cyklu pęcherzykowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda flash-and-freeze integruje etapy wczesnego odkrywania i badań przedklinicznych, łącząc stymulację optogenetyczną z wysokorozdzielczą mikroskopią elektronową w celu analizy rozdzielczej w czasie.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących czasu i sekwencji zdarzeń błonowych następujących po określonej stymulacji.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania do porównywania warunków i opracowywania testów.
- Analityka: Generuje duże, analizowane w sposób zaślepiony zbiory danych wspierające statystyczną ocenę zmian morfologicznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z procesami istotnymi dla chorób w układach neuronowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę możliwą do adaptacji w badaniach lokalizacji białek i badaniach dynamicznych w różnych typach komórek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii błon komórkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i obrazowanie w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wysokotreściowych, rozdzielonych w czasie danych morfologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów w dziedzinie neurobiologii i biologii komórki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie optogenetyki, mikroskopii elektronowej oraz kriogenicznej obróbki próbek.
- Wymaga dostępu do urządzeń do mrożenia pod wysokim ciśnieniem, substytucji mrożenia oraz zaawansowanej infrastruktury obrazowania.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów stymulacji i mrożenia pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do badań lokalizacji białek lub analiz dynamicznych poprzez modyfikację protokołu.
- Przepustowość próbek i czas analizy mogą ulec wydłużeniu ze względu na złożone etapy przygotowania i obrazowania.
