Name: Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Poznaj metodę glikoproteomiki macierzy zewnątrzkomórkowej w tkankach sercowo-naczyniowych. Protokół umożliwia identyfikację miejsc glikozylacji i charakteryzację glikanów przy użyciu spektrometrii mas LC-MS/MS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JBB jest członkiem Career Establishment w King's British Heart Foundation Centre. MM jest starszym członkiem British Heart Foundation (FS/13/2/29892). Badanie było wspierane przez inicjatywę doskonałości (Competence Centers for Excellent Technologies - COMET) Austriackiej Agencji Promocji Badań Naukowych FFG: "Research Center of Excellence in Vascular Ageing - Tyrol, VASCage" (K-Project numer 843536) oraz NIHR Biomedical Research Center z siedzibą w Guy's and St. Thomas' National Health Service Foundation Trust i King's College London we współpracy z King's College Hospital.

Badanie zostało zatwierdzone przez Lokalny Komitet Etyki Badań Naukowych w Wandsworth (numer referencyjny: 06/Q0803/37) i otrzymało instytucjonalną aprobatę od biura badań i rozwoju. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.
1. Ekstrakcja białek macierzy zewnątrzkomórkowej
UWAGA: Ludzkie tkanki przedsionkowe użyte do tych eksperymentów zostały uzyskane z przydatków przedsionków podczas krążenia pozaustrojowego, tuż po zatrzymaniu krążenia serca. Wszystkie próbki zostały pobrane w St George's Hospital w Londynie w Wielkiej Brytanii. Wszystkie próbki tkanek muszą być zamrożone w temperaturze -80 °C. Nie należy używać próbek zakonserwowanych utrwalaczami, takimi jak paraformaldehyd, które sieciują białka.
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie ekstrakcyjne przed eksperymentami, zgodnie z tabelą 1, w celu zminimalizowania czasu między etapami ekstrakcji. Wszystkie inkubacje należy wykonywać w temperaturze pokojowej (RT) w środowisku o kontrolowanej temperaturze (tj. ~20 °C), aby zapewnić spójność między ekstrakcjami.</li>
	<li>Zważ 20-50 mg tkanki. Jeżeli ma zostać pobranych kilka próbek, należy je pokroić i zważyć jedna po drugiej, aby uniknąć całkowitego rozmrożenia tkanek. Za pomocą skalpela pokrój tkankę w kostkę na 3-4 mniejsze kawałki (tj. 2-3 mm) i umieść je razem w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów) i wykonać pięć płukań w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krwi.</li>
	<li>Etap ekstrakcji 1: Inkubacja z buforem NaCl
	<ol>
		<li>Po umyciu PBS umieścić próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml z nakrętkami. Dodać bufor NaCl (patrz Tabela 1) w ilości 10-krotności (v:w) masy tkanki. Wirować rurki przy RT przez 1 godzinę przy minimalnej prędkości (tj. 600 obr./min). 
		UWAGA: Niska prędkość wirowania ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia tkanki na tym etapie. Użyj adaptera piankowego, aby umieścić wszystkie rurki podczas ekstrakcji.</li>
		<li>Przenieść ekstrakty do nowych probówek i odwirować w stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ekstrakty przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Krótko przemyć pozostałe granulki tkanek świeżym buforem NaCl. Do przemywania należy użyć tego samego rodzaju buforu (tj. 100 μl buforu NaCl), aby zapobiec ekstrakcji innych białek o różnej rozpuszczalności (tj. białek, których nie można ekstrahować za pomocą NaCl).</li>
		<li>Po umyciu należy upewnić się, że bufor został całkowicie usunięty, aby zminimalizować nakładanie się zawartości białka na kolejne etapy ekstrakcji. Wyrzuć bufor NaCl używany do mycia. 
		UWAGA: Stosunek objętości buforu do masy tkanki jest ważny dla powtarzalnej ekstrakcji. Stosunek 10:1 (v:w) dla ekstrakcji NaCl i SDS oraz 5:1 dla etapu GuHCl zapewnia wystarczającą ilość białka bez nasycania buforu. Stężenie białka po ekstrakcji wynosi około 1-2 μg/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja Krok 2: Decelularyzacja za pomocą bufora SDS
	<ol>
		<li>Dodać bufor SDS (Tabela 1) w ilości dziesięciokrotnej (v:w) masy tkanki; zastosowanie niskich stężeń SDS (tj. 0,1%) ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia utraty białek ECM podczas decelularyzacji. Wirować rurki przy RT przez 16 godzin z minimalną prędkością (tj. 600 obr./min). 
		UWAGA: Niska prędkość wirowa minimalizuje mechaniczne zakłócenia ECM.</li>
		<li>Przenieś ekstrakty do nowych probówek. Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Krótko przemyć pozostałe granulki tkanek za pomocą ddH 2O, aby usunąć SDS. Upewnij się, że płyn został całkowicie usunięty po umyciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etap ekstrakcji 3: Inkubacja z buforem GuHCl
	<ol>
		<li>Dodać bufor GuHCl (Tabela 1) w ilości pięciokrotnej (v:w) masy tkanki. Wirować rury przy RT przez 72 godziny z maksymalną prędkością (tj. 3,200 obr./min); energiczne wirowanie ułatwia mechaniczne zakłócenie ECM.</li>
		<li>Przenieś ekstrakty do nowych probówek. Wirować w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja i wytrącanie białek
UWAGA: Ze względu na obecność detergentów, bufor SDS jest niezgodny z bezpośrednią kwantyfikacją białka na podstawie pomiarów absorbancji przy 280 nm. Aby zapewnić powtarzalną kwantyfikację, należy użyć testów kolorymetrycznych dla wszystkich ekstraktów białkowych17.
<ol>
	<li>Kwantyfikacji.
	<ol>
		<li>Przygotować wzorce do krzywej kalibracyjnej, używając albuminy surowicy bydlęcej (BSA) seryjnie rozcieńczanej w odpowiednim buforze ekstrakcyjnym (tj. NaCl, SDS lub GuHCl)17. W tym czasie rozmrozić ekstrakty próbki.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki w buforze ekstrakcyjnym w celu uzyskania stężeń w liniowym zakresie absorbancji; rozcieńczenie w stosunku 1:10 (v:v) daje zadowalające wyniki. Rozcieńczyć próbki GuHCl równą ilością ddH2O w celu określenia ilościowego, ponieważ test kolorymetryczny nie jest zgodny ze stężeniami >4 M GuHCl.</li>
		<li>Należy użyć testu kolorymetrycznego na bazie kwasu bicinchoninowego (BCA)17 (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi testów na płytkach 96-dołkowych; zaleca się wykonanie co najmniej podwójnych pomiarów.</li>
		<li>Po inkubacji przez 30 minut należy dokonać odczytów absorbancji przy długości fali 570 nm w celu obliczenia stężenia białka przy użyciu standardowej krzywej kalibracyjnej BSA17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie białek
	<ol>
		<li>Rozmrozić ekstrakty GuHCl w temperaturze pokojowej. Podwielokrotność 10 μg białka na każdą próbkę do nowych probówek. Do bezpośredniej analizy glikopeptydowej, podwielokrotność 50 μg. Dodać 10-krotność objętości etanolu i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: GuHCl nie jest kompatybilny z dalszymi reakcjami enzymatycznymi i większością zastosowań elektroforetycznych. Usunięcie GuHCl jest wymagane przed deglikozylacją i trawieniem trypsyny. Rozpuszczalność GuHCl w etanolu i odwrotnie, niska rozpuszczalność białek pozwala na skuteczne usuwanie GuHCl, zapewniając jednocześnie około 98% odzysku białek18.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 16 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć wytrąconego osadu. Suszyć granulki przez 15 minut za pomocą koncentratora próżniowego (patrz tabela materiałów) w RT. 
		UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół, a wysuszone granulki przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Opcjonalnie należy przeprowadzić elektroforezę żelową w ramach kontroli jakości (QC, patrz Metody Uzupełniające).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekwencyjna deglikozylacja do oceny zajętości miejsca N-glikozylacji
<ol>
	<li>Podczas suszenia próbki (zob. etap 2.2.2) należy przygotować bufor deglikozylacyjny zawierający enzymy deglikozylacji rozgałęziające, zgodnie z tabelą 1. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje o produkcie.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 10 μl buforu deglikozylacyjnego zawierającego enzymy. Zapewnić odpowiednie ponowne zawieszenie osadów, wykonując szybkie wirowanie i wirowanie próbek. 
	UWAGA: Usunięcie monomerów cukrów za pomocą enzymów rozgałęziających jest niezbędne do późniejszego i całkowitego usunięcia kompleksu sacharydów sprzężonych z O i ułatwia późniejsze rozszczepienie cukrów połączonych z N przez PNGazę-F.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, aby umożliwić usunięcie siarczanu heparanu przez heparynazę II. Zwiększyć temperaturę do 37 °C i inkubować przez 36 godzin, delikatnie mieszając. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę małe objętości reakcji i wydłużony czas inkubacji, należy użyć wytrząsarek inkubatora i szczelnie zapakować wiele probówek o pojemności 1,5 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml pochylonej wewnątrz inkubatora pod kątem około 45°.</li>
	<li>Po 36 godzinach odwirować próbki przez 1 minutę przy 16 000 x g i odparować H2Oz próbek za pomocą koncentratora próżniowego w temperaturze pokojowej przez około 45 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 10 μlH218O zawierającej 50 U/ml PNGazy-F, która rozszczepia wszystkie glikany związane ze asparaginą w reakcji deamidacji. 
	UWAGA: Otrzymany kwas asparaginowy ma nadmiar masy 2,98 Da, co wskazuje na obecność N-glikozylacji podczas analizy MS.</li>
	<li>Inkubować przez 36 godzin w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu w wytrząsarce inkubatora.</li>
</ol>
4. Trawienie trypsyny w roztworze
UWAGA: Ten krok powinien być przeprowadzony zarówno dla próbek niezdeglikozylowanych (tj. używanych do bezpośredniej analizy glikopeptydu), jak i deglikozylowanych (tj. używanych do oceny zajętości glikanów).
<ol>
	<li>Do oceny zajętości miejsca N-glikozylacji należy użyć 10 μg białka całkowitego (jak wskazano w poprzednim kroku). W przypadku próbek przeznaczonych do bezpośredniej analizy glikopeptydowej należy użyć 50 μg białka jako ilości wyjściowej. 
	UWAGA: Poniższe kroki są opisane dla 10 μg białka. W razie potrzeby zwiększ objętości (tj. 5 razy dla 50 μg).</li>
	<li>Denaturować białka w każdej próbce podwielokrotności przy użyciu 9 M mocznika i 3 M tiomocznika, przy końcowych stężeniach odpowiednio 6 M mocznika i 2 M tiomocznika (np. dla próbki 10 μl, 20 μl mocznika/tiomocznika).</li>
	<li>Zredukuj białka, dodając 100 mM ditiotreitolu (DTT, 3,33 μL, stężenie końcowe: 10 mM). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z mieszaniem przy 240 obr./min.</li>
	<li>Schłodzić próbki do temperatury suchej temperatury przed wykonaniem alkilacji, dodając 0,5 M jodoacetamidu (3,7 μl, stężenie końcowe: 50 mM). Inkubować w ciemności przez 1 godzinę.</li>
	<li>Użyć wstępnie schłodzonego (-20 °C) acetonu (6-krotność objętości próbki) do inkubacji próbek przez noc w temperaturze -20 °C. Wytrącić przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć wytrąconego osadu. Suszyć granulki białka za pomocą koncentratora próżniowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 20 μl 0,1 M buforu wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) o pH 8,2 i zawartości trypsyny (0,01 μg/μl) i trawić przez noc w temperaturze 37 °C i 240 obr./min.</li>
	<li>Przerwać trawienie poprzez zakwaszenie próbek 10% kwasem trifluorooctowym (TFA, 2 μl dla końcowego stężenia 1% TFA).</li>
</ol>
5. Oczyszczanie peptydów za pomocą kolumn C18
UWAGA: Usuwanie zanieczyszczeń zakłócających z mieszaniny peptydów po trawieniu zmniejsza tłumienie jonów i poprawia stosunek sygnału do szumu oraz pokrycie sekwencji. Etap ten należy przeprowadzić zarówno dla próbek niezdeglikozylowanych, jak i zdeglikozylowanych.
<ol>
	<li>Aktywuj żywicę na płytce wirowej C18 (patrz Tabela Materiałów) za pomocą 200 μl metanolu na studzienkę i odwiruj przy 1 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Przemyć, dodając 200 μl na studzienkę 80% acetonitrylu (ACN) i 0,1% TFA wH2O. Wirować przy 1.000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Zrównoważyć, dodając 200 μl na studzienkę 1% ACN i 0,1% TFA w H2O. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Załadować próbki (całą objętość) z etapu 4 do studzienek zawierających żywicę i odwirować przy stężeniu 1 500 x g przez 1 minutę. Ponownie załadować przepływowy przepływ po raz drugi i powtórzyć wirowanie.</li>
	<li>Przemyć, dodając 200 μl na studzienkę 1% ACN i 0,1% TFA w H2O. Wirować przy 1 500 x g przez 1 min. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Eluować próbki za pomocą 170 μl na studzienkę 50% ACN, 0,1% TFA w H2O. Odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę. Powtórzyć poprzedni krok i połączyć zebrany eluat.</li>
	<li>Suszyć eluat za pomocą koncentratora próżniowego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyty, wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Próbki deglikozylowane przeznaczone wyłącznie do identyfikacji białek są gotowe do użycia dla LC-MS/MS po tym etapie. Kroki 6 i 7 nie są wymagane w przypadku tych próbek.</li>
	<li>Rozmrozić i ponownie zawiesić zdeglikozylowane próbki w 2% ACN i 0,05% TFA wH2Odo końcowego stężenia białka 0,5 μg/μL. Postępować do etapu 6 dla bezpośredniej analizy glikopeptydowej próbek niezdeglikozylowanych.</li>
	<li>Opcjonalnie przefiltruj peptydy przed znakowaniem za pomocą tandemowych znaczników masy (TMT); patrz Metody uzupełniające dotyczące dopasowania peptydów.</li>
</ol>
6. Etykietowanie za pomocą TMT (tylko do bezpośredniej analizy glikopeptydowej)
<ol>
	<li>Rozmrozić i ponownie zawiesić wysuszone granulki w 50 μl 50 mM TEAB do uzyskania stężenia 1 μg/μL.</li>
	<li>Ponownie umieścić w fiolce 0,8 mg odczynnika TMT Zero (TMT0, patrz Tabela Materiałów) w 41 μl ACN. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi ponownego wymieszania.</li>
	<li>Oznaczyć próbki peptydów w stosunku 50 μg peptydów do 0,4 mg TMT0 (tj. 50 μL peptydów na 20,5 μl TMT0). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Ugasić reakcję znakowania, dodając 5% hydroksyloaminy w stosunku 6:100 (tj. 4,23 μl 5% hydroksyloaminy). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Suszyć próbki peptydów znakowanych TMT0 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą koncentratora próżniowego. Zawiesić w 10 μl ddH2O. 
	UWAGA: Ze względu na reszty glikanów, glikopeptydy wykazują większą masę cząsteczkową niż peptydy nieglikozylowane. TMT0 zwiększa stan naładowania glikopeptydów. Zmniejsza to ich stosunek względnej masy do ładunku (m/z) i ułatwia fragmentację ETD.</li>
</ol>
7. Wzbogacanie glikopeptydów
<ol>
	<li>Stosować reakcyjne znajdujące się w zestawie (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu wiążącego do każdej próbki o objętości 10 μl z kroku 6.5. Wirować roztwór żywicy wychwytującej gliko, aż stanie się jednorodny. Użyj chromatografii cieczowej opartej na zwitterionowej interakcji hydrofilowej (ZIC-HILIC) capture15.</li>
	<li>Przenieść 50 μl zawiesiny żywicy do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 1 minutę przy 2 500 x g i usunąć supernatant. Dodać 60 μl próbki (tj. próbki z buforem wiążącym) do probówek zawierających granulki żywicy. Wymieszać za pomocą pipety i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w mieszaniu przy 1 200 obr./min.</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g i przenieść supernatant do nowych probówek. Zachowaj rurki. Dodać 150 μl buforu do płukania do probówek z żywicą. Wymieszać za pomocą pipety i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w mieszaniu przy 1 200 obr./min.</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty przy 2 500 x g. Przenieść supernatant do tych samych probówek (od kroku 7.4). Powtórz kroki prania dwa razy.</li>
	<li>Dodać 75 μl buforu elucyjnego i wymieszać za pomocą pipety. Mieszać przy 1.200 obr./min przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywać probówki przez 2 minuty przy 2.500 x g. Przenieść supernatanty do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Powtórz etapy przemywania, a następnie przenieś supernatant eluatu do tej samej probówki.</li>
	<li>Odwirować probówki zawierające eluat (tj. glikopeptydy) przez 2 minuty przy 2 500 x g. Przenieść supernatant do nowych probówek, aby zapewnić usunięcie pozostałości żywicy z poprzednich etapów.</li>
	<li>Wysuszyć całkowite 150 μl eluatu za pomocą koncentratora próżniowego przez około 2 godziny w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić wysuszone glikopeptydy w 15 μl 2% ACN i 0,05% TFA w ddH2O.</li>
	<li>Kontynuuj wykonywanie LC-MS/MS przy użyciu fragmentacji HCD w celu analizy składu białka ECM oraz LC-MS/MS przy użyciu fragmentacji HCD i ETD w celu scharakteryzowania glikopeptydu. Patrz punkt 8.</li>
</ol>
8. Analiza spektrometrii mas
<ol>
	<li>Wykonać LC-MS/MS z wykorzystaniem fragmentacji HCD w celu analizy składu białka ECM; szczegółowe informacje można znaleźć w metodach uzupełniających.</li>
	<li>Przeprowadzić LC-MS/MS przy użyciu fragmentacji HCD i ETD w celu scharakteryzowania glikopeptydu (szczegółowe informacje można znaleźć w metodach uzupełniających); wzbogaconą próbkę należy porównać z niewzbogaconym materiałem wejściowym15. 
	UWAGA: Szczegółowe opisy metod LC-MS/MS do pośredniej analizy glikopeptydowej, bezpośredniej analizy glikopeptydowej i przeszukiwania bazy danych znajdują się w Metodach uzupełniających. Badaczy zainteresowanych scharakteryzowaniem składu białek i glikanów ECM za pomocą spektrometrii mas zachęcamy do zapoznania się z wcześniejszymi publikacjami3,11,15.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, K. E., Turner, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts%3A+at+the+heart+of+myocardial+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling.</a> Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).</li>
<li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+cardiac+extracellular+matrix+remodeling+in+a+porcine+model+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury.</a> Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).</li>
<li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomics+reveals+decorin+peptides+with+anti-myostatin+activity+in+human+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation.</a> Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).</li>
<li>Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+proteomics+in+metabolic+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases.</a> J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).</li>
<li>Varki, A., Lowe, J. B., et al. Biological Roles of Glycans. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1897/">Essentials of glycobiology. 2nd ed</a>. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor NY. (2009).</li>
<li>Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+-+opportunities+and+challenges%3A+The+application+of+proteomics+to+study+the+cardiovascular+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix.</a> Cardiovasc. Res. , (2016).</li>
<li>Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divide+and+conquer%3A+the+application+of+organelle+proteomics+to+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure.</a> Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).</li>
<li>Mason, R. M., Mayes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+cartilage+protein-polysaccharides+with+inorganic+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions.</a> Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).</li>
<li>Vogel, K. G., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteoglycans+from+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteoglycans from tendon.</a> Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).</li>
<li>Wilson, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11450270">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li>
<li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://cardiovascres.oxfordjournals.org/content/early/2016/04/10/cvr.cvw075">Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins.</a> Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).</li>
<li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li>
<li>Didangelos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+composition+and+remodeling+in+human+abdominal+aortic+aneurysms%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li>
<li>Grandoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+biglycan+enhances+thrombin+generation+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%3A+Implications+for+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).</li>
<li>Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).</li>
<li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+N-linked+glycoproteomics+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion+injury+reveals+early+remodeling+in+the+extracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Pepinsky, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+precipitation+of+proteins+from+guanidine+hydrochloride-containing+solutions+with+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol.</a> Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).</li>
<li>de Castro-Brás, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texas+3-step+decellularization+protocol%3A+looking+at+the+cardiac+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix.</a> J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+matrix+proteins+from+tissues+and+digestion+into+peptides+for+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis.</a> J Vis Exp. (101), e53057(2015).</li>
<li>Decaris, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).</li>
<li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+glycan-peptide+analysis+for+determination+of+N-glycoproteome+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity.</a> J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+glycosylated+and+sialylated+prostate-specific+antigen+revealing+differential+distribution+of+glycosylated+prostate-specific+antigen+isoforms+in+prostate+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues.</a> Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).</li>
<li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+extracellular+matrix%3A+an+ever-changing+and+diverse+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity.</a> Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).</li>
</ol>

Ten protokół proteomiczny został zoptymalizowany w ciągu ostatnich kilku lat w naszym laboratorium. W tym przypadku użyliśmy tkanki serca, ale do jej zastosowania do innych tkanek mogą być wymagane tylko niewielkie korekty. Na przykład protokół ekstrakcji musi uwzględniać komórkowość tkanki. Tkanka serca jest wysoce komórkowa w porównaniu z tkanką naczyniową. W przypadku stosowania tkanki naczyniowej stężenie SDS może być niższe (tj. 0,08%), a czas decelularyzacji krótszy (tj. 4 h)11,12,13. Zastosowanie enzymów deglikozylacyjnych ma kluczowe znaczenie dla analizy składu ECM metodą LC-MS/MS. Jednak czas inkubacji musi być dostosowany do różnych typów tkanek. Na przykład heparynaza II wymagała wydłużonego czasu inkubacji w temperaturze 25 °C przy użyciu próbek takich jak skóra, które są bogate w białka błony podstawnej (np. agryna, perlekan) (dane nie pokazane). Bezpośrednią analizę glikopeptydu można przeprowadzić na kondycjonowanych pożywkach z komórek w hodowli15. Etapy wzbogacania mogą nie być wymagane do analizy tego uproszczonego subproteomu. Podobnie jak ekstrakty GuHCl, ekstrakty NaCl są również podatne na analizę glikoproteomiczną z niewielkimi modyfikacjami. Inne protokoły ekstrakcji w celu wzbogacenia białek ECM można dostosować do charakterystyki glikopeptydów ECM 19,20.
Glikozylacja jest najbardziej złożonym PTM5. Pośrednią identyfikację glikopeptydów uzyskuje się przez wykrycie deamidowanego Asn z włączonym 18O w sekgonie NxT/S. Deamidated Asn na innych pozycjach może reprezentować fałszywe alarmy. Podobnie N-glikozylację należy rozpatrywać w kontekście ontologii białek: białka wewnątrzkomórkowe zawierające sekwon NxT/S nie będą glikozylowane, ale mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Ponieważ obecne algorytmy wyszukiwania nie pozwalają na przesiewanie PTM tylko w z góry określonych sekwencjach (tj. Asn w NxT/S), wymagane jest ręczne filtrowanie danych. Identyfikacja obecności/braku glikozylacji w tych pozycjach może być porównana między próbkami chorobowymi i kontrolnymi. Nie ma enzymu równoważnego PNGazie F dla O-deglikozylacji (tj. wprowadzania przesunięcia masy na treoninę lub serynę). Dlatego identyfikacja O-glikozylacji jest ograniczona do bezpośredniej analizy glikopeptydu. Bezpośrednia analiza glikopeptydu służy do uzyskania informacji o składzie cukrów przyłączonych do białek, ale nie dostarcza informacji strukturalnych glikanu. Co więcej, skład glikanów jest wynikiem syntezy i przetwarzania glikanów po wydzieleniu.
Nasza 3-etapowa metoda ekstrakcji białek ECM ("English Quickstep")6 pozwoliła na scharakteryzowanie ECM w różnych tkankach sercowo-naczyniowych. Frakcjonowanie tkanki na kilka ekstraktów jest wymagane w celu uzyskania uproszczonego proteomu ECM, jak omówiono w innym miejscu6. W przeciwnym razie białka wewnątrzkomórkowe przyczyniłyby się do nadmiernego dynamicznego zakresu obfitości białek w ekstraktach, co utrudniłoby identyfikację mniej obfitych białek ECM. Co więcej, białka wewnątrzkomórkowe przenoszą O-glikozylacje5, które komplikują wzbogacanie glikopeptydów ECM i późniejszą analizę SM. Inni autorzy zastosowali podobne metody ekstrakcji do scharakteryzowania na przykład płuc21 i tkanek chrzęstnych10, jednak nie kontynuowali analizy glikozylacji. Dotychczasowa analiza glikozylacji koncentrowała się wyłącznie na identyfikacji glikozytów, wymagała usunięcia glikanu z rdzenia białka i nie mogła ocenić O-glikozylacji22,23. Matryce lektynowe i wzbogacanie chemiczne są dostępne do oceny typów glikanów w próbkach biologicznych na podstawie ich specyficzności wiązania, ale techniki te nie mogą przypisać typów glikanów do określonych białek24 ani nie mogą ocenić miejsc glikozylacji.
Początkowo stosowaliśmy elektroforezę żelową przed LC-MS/MS białek ECM. Chociaż separacja żeli jest przydatna w uzyskiwaniu uproszczonych frakcji białkowych podatnych na analizę LC-MS/MS, najnowsze urządzenia oferują szybsze skanowanie. W ten sposób można pominąć etap separacji elektroforetycznej. Stanowi to dodatkową zaletę, ponieważ duże białka ECM, które są zatrzymywane na wierzchu żelu, są analizowane bardziej efektywnie. Jednak informacje dotyczące Mw nienaruszonych białek są tracone. Etap parowania przed deglikozylacją PNGazy F zapewnia całkowite usunięcie zwykłegoH2Ow celu zminimalizowania wyników fałszywie ujemnych. Reszty cukrowe (tj. zmienne masy glikanów) zakłócają rozdzielanie przez LC i utrudniają późniejszą identyfikację peptydów przez MS/MS. Protokół pan-deglikozylacji jest również zalecany do analizy proteomicznej białek ECM, które nie koncentrują się na glikozylacji.
Proteomika może dostarczyć bezprecedensowego wglądu w ECM. Poza wsparciem strukturalnym, glikany przyłączone do ECM są niezbędne do interakcji gospodarz-patogen, komunikacji komórka-komórka i odpowiedzi immunologicznej25, tj. odrzucenia przeszczepu allogenicznego po przeszczepie narządu. Glikoproteomika będzie podstawowym narzędziem w glikobiologii.

Zwłóknienie jest cechą charakterystyczną wielu chorób. Fibroblasty namnażają się i różnicują w kierunku wysoce syntetycznych fenotypów, które są związane z zaostrzonym wydzielaniem i odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)1. Nadmierne odkładanie się ECM może być kontynuowane, nawet po ustąpieniu początkowego urazu, prowadząc do upośledzenia funkcjonalnego. Korzystając z proteomiki, zidentyfikowaliśmy wcześniej ponad 150 ECM i białek związanych z ECM w tkance serca2,3. Są to nie tylko białka strukturalne, ale także białka matrikomórkowe i proteazy, które przyczyniają się do ciągłej przebudowy i dynamicznej adaptacji serca. Warto zauważyć, że wiele białek ECM jest glikozylowanych4. Ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) polega na dodaniu reszt cukrowych do określonych pozycji aminokwasów i wpływa na fałdowanie, rozpuszczalność, wiązanie i degradację białek5.
Istnieją dwa główne typy glikozylacji, które występują u ssaków. (1) N-glikozylacja zachodzi w azocie karboksamidowym reszt asparaginy (Asn) w sekwencji konsensusu Asn-Xaa-Thr/Ser, gdzie Xaa jest dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny. (2) W O-glikozylacji reszty cukru przyłączają się do reszt seryny i treoniny (Ser, Thr) lub, w znacznie mniejszym stopniu, do hydroksyproliny i hydroksylizyny. Podczas gdy O-glikozylacja może zachodzić w różnych grupach białek, N-glikozylacja jest ograniczona do wydzielanych białek lub zewnątrzkomórkowych domen białek błonowych5. To sprawia, że N-glikozylacja jest atrakcyjnym celem podczas badania ECM.
Proteomika ustanawia nowy standard analizy zmian białek w chorobie. Do tej pory większość badań proteomicznych koncentrowała się na białkach wewnątrzkomórkowych6. Wynika to głównie z następujących powodów. Po pierwsze, obfitość białek wewnątrzkomórkowych utrudnia identyfikację rzadkich składników ECM. Jest to szczególnie istotne w tkance serca, w której białka mitochondrialne i miofilamentowe stanowią dużą część zawartości białka7. Po drugie, integralne białka ECM są silnie usieciowane i trudne do rozludnienia. Wreszcie, obecność obfitych PTM (tj. Glikozylacja) zmienia masę cząsteczkową, ładunek i właściwości elektroforetyczne peptydów, wpływając zarówno na separację, jak i identyfikację za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS / MS). W ostatnich latach opracowaliśmy i udoskonaliliśmy metodę sekwencyjnej ekstrakcji i wzbogacania białek ECM, która jest kompatybilna z późniejszą analizą spektrometrii mas (MS). Strategia opiera się na inkubacjach sekwencyjnych.
Pierwszy krok jest wykonywany za pomocą NaCl, bufora jonowego, który ułatwia ekstrakcję powiązanych z ECM i luźno związanych białek ECM, a także nowo zsyntetyzowanych białek ECM. Nie zawiera detergentów, nie denaturuje, nie narusza błon komórkowych i nadaje się do dalszych testów biochemicznych8. Następnie decelularyzacja uzyskuje się za pomocą dodecylosiarczanu sodu (SDS). Na tym etapie niskie stężenie SDS zapewnia destabilizację błony i uwalnianie białek wewnątrzkomórkowych, jednocześnie zapobiegając zakłóceniu bardziej rozpuszczalnych nieintegralnych składników ECM. Na koniec białka ECM są ekstrahowane za pomocą buforu chlorowodorku guanidyny (GuHCl). GuHCl jest skuteczny w ekstrakcji silnie usieciowanych białek i proteoglikanów z tkanek takich jak ścięgna9, chrząstka10, vessels11,12,13 i heart2,3. Zastosowaliśmy to frakcjonowanie biochemiczne w połączeniu z LC-MS/MS, aby zbadać przebudowę ECM w chorobach sercowo-naczyniowych2,3,11,12,13,14. Ostatnie postępy w dziedzinie stwardnienia rozsianego obejmują nowatorskie metody fragmentacji, takie jak kombinacje dysocjacji zderzeń o wyższej energii (HCD) i dysocjacji przeniesienia elektronów (ETD), które pozwalają na bezpośrednią analizę nienaruszonych glikopeptydów3,15.
Tutaj opisujemy metodologię przygotowania ECM do analizy MS, która pozwala na analizę składu białek, identyfikację miejsc glikozylacji i charakterystykę form glikanów. W porównaniu z poprzednimi analizami glikozylacji ECM16, metodologia ta pozwala na bezpośrednią ocenę zmian składu w profilach glikozylacji w sposób specyficzny dla danego miejsca przy użyciu MS. Zastosowaliśmy tę metodologię do tkanek sercowo-naczyniowych. Można go jednak również zastosować, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych próbkach tkanek i może dostarczyć bezprecedensowego wglądu w biologię ECM.

<table><tbody><tr><td>A. Chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa MS&nbsp;( ACN, C2H3N)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51101</td><td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>1.3,&nbsp; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy (Na2H2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT, C4H10O2S2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>4.3</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, C10H16N2<sub2/sub>>O<sub8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>1.3, &nbsp; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>Etanol (C2H6O)</td><td>VWR</td><td>437433T</td><td>2.2.1</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny (GuHCl, CH6ClN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>Glicerol (C3H8O3)</td><td>Acros organics</td><td>158920025</td><td>Suppl 1.1</td></tr><tr><td>H2O LC-MS Cromasolv</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td>W całym protokole</td></tr><tr><td>H218O</td><td>Taiyo Nippon Sanso</td><td>FO3-0027</td><td>3.5</td></tr><tr><td>Hydroksyloamina (HA, H3NO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td>6.4</td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA, C2H4INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td>4.4</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x</td><td>Lonza</td><td>51226</td><td>1.3</td></tr><tr><td>Octan sodu (C2H3NaO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7545</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>1.4.1, 3.2</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS, NaC12H25SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>466143</td><td>1.5.1</td></tr><tr><td>Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB, C7H17NO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11268</td><td>4.7, 6.1</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA, C2HF3O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T62200</td><td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td></tr><tr><td>Tiomocznik (CH4N2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Chlorowodorek trisu (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>1.4.1, Suplement 1.</td></tr><tr><td>Mocznik (CH4N2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>B. Enzymy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-3,6,8,9-neuraminidaza (sialidaza)</td> <td>EDM Milipor</td><td>362280 (KP0012)</td><td>3.1</td></tr> <tr><td>i beta; 1,4-galaktozydaza</td><td>EDM Milipory</td><td>362280 (KP0004)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&beta;-N-acetyloglukozaminidaza</td><td>EDM Milipory</td><td>362280 (KP0013)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Chondroitynaza ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3667</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Endo-&alfa;-N-acetylogalaktosaminidaza (O-glikozydaza)</td><td>EDM Milipor</td><td>362280 (KP0011)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Heparynaza II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6512</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Keratanaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6920</td><td>3.1</td></tr><tr><td>PNGase-F (N-glikozydaza F)</td><td>EDM Milipory</td><td>362280 (KP0001)</td><td>3.5</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td>4.7</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td> Uwagi</td></tr><tr><td>C. Zestawy odczynników</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 kDa Filtry wirowe MWCO&nbsp;</td><td>Amicon, Millipore</td><td>10256744</td><td>5.9, Suppl 2</td></tr><tr><td>Macro SpinColumn C-18, 96-dołkowa płytka</td><td>Aparat Harvarda</td><td>74-5657</td><td>5.1</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex BisTris Żele akrylamidowe</td><td>Thermo-Scientific</td><td>NP0322PK2</td><td>Suppl 1</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania glikopeptydów ProteoExtract</td><td>Merk Millipore</td><td>72103</td><td>7</td></tr><tr><td>Tandem masowy tag 0 (TMT0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>900067</td><td>6.2, 6.3</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>D. Sprzęt i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uznanie: Pułapka PepMap100 C18, 5 mm x 300 &mikro; m, 5 i mikro; m, 100 i Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Suplement 3, 4</td></tr><tr><td>Uznanie PepMap100 C18, 50 cm x 75 &mikro; m, 3 i mikro; m, 100 i Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td>Suplement 3</td></tr><tr><td>Byonic Search Engine</td><td>Protein Metrics</td><td>Wersja 2.9.30</td><td>Suplement 5</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td><td>Thermo Scientific</td><td>n/a</td><td>Suplement 3, 4</td></tr><tr><td>Źródło jonów EASY-Spray&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES081</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&nbsp; 50 cm x 75 &mikro; m, 2 i mu; m, 100 i Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES803</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Maskotka Wyszukiwarka</td><td>Matrix Science</td><td>Wersja 2.3.01</td><td>Suplement 3</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Proteome Discoverer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Wersja 2.1.1.21</td><td>Suplement 3, 5</td></tr><tr><td>Picoview Nanospray Źródło</td><td>Nowy cel</td><td>550</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Spektrometr</td> masowy <td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Koncentrator Savant SpeedVac</td><td>Thermo Scientific SPD131DDA</td><td></td><td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rusztowań</td><td>Oprogramowanie proteomowe&nbsp;</td><td>Wersja 4.3.2</td><td>Suplement 3</td></tr></tbody></table>

glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Zwłóknienie jest cechą charakterystyczną wielu chorób sercowo-naczyniowych i wiąże się z zaostrzonym wydzielaniem i odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Korzystając z proteomiki, zidentyfikowaliśmy wcześniej ponad 150 białek ECM i związanych z ECM w tkankach sercowo-naczyniowych. Warto zauważyć, że wiele białek ECM jest glikozylowanych. Ta potranslacyjna modyfikacja wpływa na fałdowanie, rozpuszczalność, wiązanie i degradację białek. Opracowaliśmy metodę sekwencyjnej ekstrakcji i wzbogacania białek ECM, która jest kompatybilna z późniejszą analizą nienaruszonych glikopeptydów metodą tandemowej spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej (LC-MS/MS). Strategia opiera się na sekwencyjnych inkubacjach z NaCl, SDS do decelularyzacji tkanek i chlorowodorkiem guanidyny do solubilizacji białek ECM. Ostatnie postępy w LC-MS/MS obejmują metody fragmentacji, takie jak kombinacje dysocjacji zderzeń o wyższej energii (HCD) i dysocjacji przeniesienia elektronów (ETD), które pozwalają na bezpośrednią analizę składu glikopeptydów białek ECM. W niniejszej pracy opisano metodę przygotowania ECM z próbek tkanek. Metoda ta pozwala nie tylko na profilowanie białek, ale także na ocenę i charakterystykę glikozylacji za pomocą analizy MS.

Schematyczny przebieg protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
Protokół ekstrakcji ECM
Wydajność ekstrakcji można monitorować, przeprowadzając analizę alikwotów z każdego ekstraktu na żelach akrylamidowych Bis-Tris i wykorzystując barwienie srebrem do wizualizacji. Rysunek 2A przedstawia komplementarność ekstraktów NaCl, SDS i GuHCl po ekstrakcji sekwencyjnej. Ta kontrola jakości umożliwia identyfikację potencjalnych problemów z jakością próbek, takich jak nadmierna degradacja białek. Po ekstrakcji glikoproteiny ECM występują w dużym stężeniu w ekstraktach GuHCl (Rysunek 2B).
Deglikozylacja
Aby ocenić wydajność deglikozylacji, należy równolegle przeprowadzić kontrolę bez deglikozylacji. Czas deglikozylacji musi być odpowiednio dobrany, aby zapewnić całkowite i jednorodne usunięcie reszt cukrowych, co przedstawiono na Rysunku 3A. Rysunek 3B pokazuje reprezentatywny przykład próbek skutecznie poddanych deglikozylacji poprzez dodanie enzymów usuwających GAG oraz enzymów deglikozylujących nakierowanych na mniejsze oligosacharydy typu N- i O-linkowanych.
Glikoproteomika
Protokół oceny stopnia zajętości sekwonów NxT/S poprawia pokrycie sekwencji białek w przypadku glikoprotein ECM po analizie MS (Rycina 3C) i umożliwia wstępne przesiewowe badanie obecności glikoprotein. Pomaga to skrócić czas poszukiwania glikopeptydów, ponieważ bazy danych mogą zostać dostosowane tak, aby zawierały wcześniej zidentyfikowane glikoproteiny. Fragmentacja HCD-ETD jest wykorzystywana do identyfikacji i charakterystyki składu oligosacharydów przyłączonych do glikoprotein ECM. Rycina 4A przedstawia reprezentatywne widmo uzyskane dla peptydu znakowanego 18O po deglikozylacji (pośrednia analiza glikopeptydów). Rycina 4B stanowi reprezentatywny przykład widma uzyskanego po analizie nienaruszonych glikopeptydów z ekstraktów ECM (bezpośrednia analiza glikopeptydów).
<img alt="Enzymatyczny proces pośredniego mapowania glikozylacji; schemat MS/MS; ekstrakcja białek, trawienie, LC-MS/MS." src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd metody. (A) Po sekwencyjnym wzbogaceniu o białka ECM, w odglikozylowanych ekstraktach przeprowadza się analizy LC-MS/MS. (B) Alternatywnie, nieodglikozylowane ekstrakty ECM są dodatkowo wzbogacane o glikopeptydy. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy białek, żel SDS-PAGE barwiony, analiza dekoryny metodą Western blot, porównanie masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/55674/55674fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ekstrakcja białek ECM. (A) Trzy różne ekstrakty uzyskane w procedurze ekstrakcji sekwencyjnej („English Quickstep”) uzupełniają się pod względem zawartości białek. Podczas gdy ekstrakty SDS są wzbogacone w białka wewnątrzkomórkowe, ekstrakty GuHCl zawierają większość białek ECM. Prawidłowe frakcjonowanie jest widoczne poprzez różne wzory barwienia srebrem. (B) Białka ECM, takie jak małe proteoglikany bogate w leucynę: dekoryna, biglikan i mimekan, są wykrywane głównie w ekstraktach GuHCl, przy niewielkiej obecności w ekstraktach SDS i NaCl. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="SDS-PAGE wykazująca deglikozylację dekoryny i analizę; wzorce prążków glikoprotein i porównania." src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza glikozylacji. (A) Do pełnej deglikozylacji wymagane są odpowiednie czasy inkubacji. Przykład pokazuje wpływ czasu inkubacji podczas usuwania łańcuchów glikozaminoglikanów z glikoproteiny dekoryny. (B) Glikoproteiny ECM są ozdobione dużymi i powtarzalnymi łańcuchami glikozaminoglikanów oraz krótkimi i zróżnicowanymi oligosacharydami typu N- i O-linkowanymi. Ścieżka 1 na każdym z immunoblottów reprezentuje nieleczone ekstrakty z serca. Ścieżka 2 zawiera ekstrakty traktowane enzymami trawiącymi glikozaminoglikany. Próbki na ścieżce 3 zawierają dodatkowo enzymy do usuwania oligosacharydów typu N- i O-linkowanych. Galektyna-1 nie jest glikozylowana, w związku z czym nie następuje zmiana wielkości białka. Adaptowano z Lynch M, et al.4 (C) W analizie LC-MS/MS próbki traktowane PNGase-F w obecności H218O osiągają lepsze pokrycie sekwencji (%, po prawej stronie) w porównaniu do próbek nieodglikozylanych. Ciemnozielone obszary reprezentują pokrycie sekwencji metodą LC-MS/MS. Czerwone, przerywane linie reprezentują miejsca glikozylacji, a numery wskazują ich pozycję aminokwasową. Wykrycie glikozylacji dekoryny w pozycji Asn211 (N, zaznaczone pogrubieniem) pokazano szczegółowo jako przykład na Rycinie 4. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza składu glikoprotein ECM; wyniki spektrometrii masowej; modyfikacje sekwencji peptydów." src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Analiza glikopeptydów metodą MS. (A) Wykorzystując podejście shotgun proteomics w ekstraktach wzbogaconych w ECM, glikopeptydy można zidentyfikować na podstawie obecności deamidowanych asparagin w sekwonach NxT/S i znakować 18O. Przykład przedstawia widmo HCD MS/MS dla peptydy dekoryny zawierającego uprzednio glikozylowaną Asn211. Uzyskane dane mogą służyć do stworzenia spersonalizowanej bazy danych glikoprotein ECM. (B) Fragmentacja HCD-ETD jest wykorzystywana do analizy ekstraktu ECM wzbogaconego w glikopeptydy. Widmo ETD MS/MS umożliwia charakterystykę składu glikanów. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A. Roztwory stokowe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (ditiotreitol, C4H10O2S2)</td>
			<td>100 mM DTT w ddH2O.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (kwas etylendiaminotetraoctowy, C10H16N2O8)</td>
			<td>250 mM EDTA w ddH2O2O, pH 8,0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GuHCl (chlorowodorek guanydyny, CH6ClN3)</td>
			<td>8 M GuHCl w ddH2O2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA (jodoacetamid, C2H4INO)</td>
			<td>500 mM IAA w ddH2O2O.1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octan sodu (Sodium acetate, C2H3NaO2)</td>
			<td>1 M octanu sodu w ddH2O2O, pH 5,8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (chlorek sodu, NaCl) </td>
			<td>1 M NaCl w ddH2O2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fosforan sodu dwuzasadowy (fosforan disodowy, Na2HPO4)2H2PO4)</td>
			<td>1 M fosforan dwuwodorowodowy sodu w ddH2O, pH 6,8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (dodecylosiarczan sodu, NaC12H25SO4)</td>
			<td>1% SDS (35 mM) w ddH2O2O.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA (kwas trifluorooctowy, C2HF3O2)</td>
			<td>10% TFA (1,2 M) w ddH2O2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEAB (wodorowęglan trietyloamoniowy, C7H17NIE3)</td>
			<td>1M TEAB w ddH2O, pH 8,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tio mocznik (Tio mocznik, CH4N2S)</td>
			<td>3 M mocznik w ddH2O2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (hydrochlorek trisu (NH11C4O3[HCl])</td>
			<td>100 mM Tris-HCl w ddH2O2O, pH 7,5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mocznik (Urea, CH4N2O)4N2O)</td>
			<td>9 M mocznika w ddH2O2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. Bufory reakcyjne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor ekwilibracyjny do oczyszczania C18</td>
			<td>1% ACN, 0,1% TFA w ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do płukania kolumny oczyszczającej C18</td>
			<td>80% ACN, 0,1% TFA w H2O2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor elucyjny do oczyszczania na C18</td>
			<td>50% acetonitrylu, 0,1% TFA w ddH2O2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do deglikozylowania (4x)</td>
			<td>600 mM NaCl i 200 mM fosforanu sodu w ddH2O2O, pH 6,8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor GuHCl4</td>
			<td>4 M chlorek guanidyny, 50 mM octan Na i 25 mM EDTA w ddH2O2O, pH 5,8. Przed użyciem dodać koktajl inhibitorów proteinaz w stosunku 1:100 (v:v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor NaCl4</td>
			<td>0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl i 25 mM EDTA w ddH2O2O, pH 7,5. Przed użyciem dodać koktajl inhibitorów proteinaz w stosunku 1:100 (v:v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>1,7 mM KH2PO4, 5 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Przed użyciem dodać 25 mM EDTA oraz koktajl inhibitorów proteinaz w stosunku 1:100 (v:v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do próbek (4x)</td>
			<td>100 mM Tris, 2% SDS, 40% glicerolu, 0,02% błękitu bromofenolowego w ddH2O2O, pH 6,8. Przed użyciem dodać 10% $\beta$-merkaptoetanolu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor SDS4 </td>
			<td>0,1% SDS i 25 mM EDTA w ddH2O2O. Przed użyciem dodać koktajl inhibitorów proteinaz w proporcji 1:100 (v:v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. Enzymy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitynaza ABC5 </td>
			<td>0,5 U/mL w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratanaza5</td>
			<td>0,1 U/mL w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparynaza II5</td>
			<td>0,1 U/mL w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>α2-3,6,8,9-neuraminidaza (sialidaza)5</td>
			<td>0,025 J/ml w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β1,4-galaktozydaza5</td>
			<td>0,015 U/ml w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-N-acetyloglukozaminidaza5</td>
			<td>0,25 J/ml w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-α-N-acetylogalaktozaminidaza (O-glikozydaza)5</td>
			<td>0,013 U/ml w buforze do deglikozylacji (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGaza-F (N-glikozydaza F)6</td>
			<td>50 J/ml w H218O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsyna</td>
			<td>0.01 µg/µL w buforze TEAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UWAGI do tabeli</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Przechowywać roztwór zapasowy w zamrożeniu w temperaturze -20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 IAA należy przechowywać w warunkach chroniących przed światłem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 SDS łatwo krystalizuje w temperaturze &lt; 20 °CAby ułatwić solubilizację 1% SDS (roztwór zapasu), ogrzej bufor pod strumieniem ciepłej wody z kranu. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">4 Bufory do ekstrakcji można przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed użyciem należy dodać szerokospektrowy koktajl inhibitorów proteaz, zgodnie z zaleceniami.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">5 Enzymy te należy dodać podczas pierwszego etapu deglikozylowania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6 PNGaza-F należy dodać wyłącznie podczas drugiego etapu deglikozylowania.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Roztwory zapasowe, bufory reakcyjne i enzymy. Tabela ta przedstawia skład każdego roztworu zapasowego i buforu reakcyjnego wymaganego do ekstrakcji i późniejszego przetwarzania (w tym trawienia enzymatycznego) białek ECM serca przed analizą MS.

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest analiza składu białek macierzy zewnątrzkomórkowej, obejmująca identyfikację miejsc glikozylacji oraz charakterystykę składu form glikanów w tkankach układu sercowo-naczyniowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące procesu włóknienia tkanek, takie jak wpływ glikozylacji macierzy strukturalnej na włóknienie tkanek podczas chorób układu sercowo-naczyniowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do wcześniejszych protokołów analizujących ogólne zmiany glikozylacji, pozwala ona na charakterystykę glikozylacji w konkretnych miejscach białek macierzy strukturalnej, stanowiąc narzędzie do bardziej ukierunkowanych, mechanistycznych badań uzupełniających.Procedury zaprezentują dr Marika Fava oraz pani Ferheen Baig z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie bufory do ekstrakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie za pomocą skalpela należy pokroić od 20 do 50 mg tkanki na trzy lub cztery mniejsze kawałki o rozmiarze około 2 mm.Umieścić posiekaną tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 500 µL schłodzonego w lodzie PBS. Przemyć tkankę pięciokrotnie, używając po 500 µL PBS do każdego płukania, aby zminimalizować zanieczyszczenie krwią. Przenieść przemyte próbki do probówki o pojemności 1,5 ml z nakrętką i dodać objętość buforu chlorku sodu stanowiącą 10-krotność masy tkanki.Mieszaj w wirówce typu vortex z minimalną prędkością przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś ekstrakt do nowych probówek do wirowania i wiruj przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Krótko przemyj otrzymane pellety tkankowe świeżym buforem chlorku sodu.Następnie należy dodać objętość buforu SDS dziesięciokrotnie większą niż masa tkanki i mieszać w wirówce Vortex z minimalną prędkością przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Przenieść ekstrakt do nowych probówek do wirowania i wirować z prędkością 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powstałe osady przemyć wodą dwukrotnie destylowaną.Dodać objętość buforu z chlorkiem guanidyny pięciokrotnie przekraczającą masę tkanki i mieszać w wibratorze Vortex z maksymalną prędkością przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść otrzymany ekstrakt do nowych probówek i odwirować przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po oznaczaniu ilości białka, odmierzyć alikwoty 10 µg do nowej probówki dla każdej próbki w celu oceny stopnia zajętości miejsc glikozylacji oraz 50 µg do osobnej probówki do bezpośredniej analizy glikopeptydów.Do każdej próbki dodać 10-krotną objętość etanolu i inkubować przez noc w temperaturze 20 °C. Następnego dnia próbki wirować przy 16 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odessać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć wytrąconego osadu.Następnie użyć koncentratora próżniowego, aby wysuszyć osady przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Do każdej próbki dodać 10 µL przygotowanego buforu do deglikozylacji. Umieścić probówki z próbkami wewnątrz probówki stożkowej o pojemności 50 mL i inkubować pod kątem 45 stopni przez dwie godziny w temperaturze 25 °C.Następnie zwiększyć temperaturę do 37 °C i inkubować przez 36 godzin przy łagodnym mieszaniu. Po odwirowaniu przy 16 000 ×g przez jedną minutę użyć koncentratora próżniowego w temperaturze pokojowej przez 45 minut w celu odparowania wody. Próbki po wysuszeniu zawiesić w 10 µL wody znakowanej O-18 zawierającej 50 U/mL PNGase F. Inkubować przez 36 godzin w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu, a następnie przeprowadzić trawienie trypsyną w roztworze dla wszystkich próbek i przejść do oczyszczania na kolumnach C-18.Na początek, aby aktywować żywicę, należy dodać 200 µL metanolu do każdego dołka płyty wirówkowej C-18. Odwiruj z prędkością 1 000 ×g przez jedną minutę. Następnie do każdego dołka dodaj 200 µL 80% ACN i 0,1% TFA w wodzie i wiruj z prędkością 1 000 ×g przez jedną minutę.Następnie do każdego dołka należy dodać 200 µL roztworu zawierającego 1% ACN i 0,1% TFA w wodzie, a następnie wirować przez jedną minutę przy 1 000 ×g. Czynność dodawania tego roztworu i wirowania należy powtórzyć dwukrotnie. Po tym etapie próbki nanosi się do dołków płytki wirówkowej i wiruje przy 1500 ×g przez jedną minutę. Przesącz należy ponownie nałożyć do dołków i powtórzyć wirowanie.Następnie do każdej studzienki dodaj 200 µL roztworu zawierającego 1% ACN i 0,1% TFA w wodzie i wiruj przy 1500 ×g przez jedną minutę. Powtórz dodawanie tego roztworu i wirowanie dwukrotnie. Następnie do każdej studzienki dodaj 170 µL roztworu zawierającego 50% ACN i 0,1% TFA w wodzie i wiruj przy 1500 ×g przez jedną minutę.Powtórz ten etap dodawania i wirowania jeszcze raz. Użyj wirówki próżniowej, aby osuszyć połączony eluat w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Przechowuj osuszone próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu użycia.Następnie przeprowadź analizę chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas dla próbek przeznaczonych do oceny stopnia zajętości miejsc glikozylacji. W przypadku próbek przeznaczonych do bezpośredniej analizy glikopeptydów należy najpierw przeprowadzić standardowe znakowanie TMT zero zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć, dodaj do każdych 10 µL próbki znakowanej TMT zero 50 µL dostarczonego buforu wiążącego.Następnie przenieś aliquoty 50 µL jednorodnej zawiesiny żywicy do wychwytywania glikanów do nowych probówek o pojemności 1,5 mL i wiruj przez jedną minutę przy 2500 ×g. Usuń supernatant i za pomocą pipety dodaj do probówek z osadem żywicy 60 µL roztworu próbki i buforu wiążącego, mieszając zawartość. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy wytrząsaniu z prędkością 1200 RPM. Po wirowaniu przez dwie minuty przy 2000 ×g przenieś supernatant do nowych probówek.Następnie, za pomocą pipety, dodaj 150 µL buforu płuczącego do każdej probówki z żywicą i wymieszaj, aby rozpocząć proces płukania. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy wytrząsaniu z prędkością 1200 RPM. Po wirowaniu z prędkością 2500 ×g przez dwie minuty przenieś każdą nadsączkę do odpowiadającej jej probówki do przechowywania nadsączków, aby zakończyć płukanie.Powtórz ten proces płukania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj 75 µL buforu elucyjnego i wymieszaj za pomocą pipety. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, wytrząsając przy 1200 RPM.Odwirować przy 2500 ×g przez dwie minuty i przenieść każdy supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Za pomocą pipety dodać 75 µl buforu elucyjnego, aby wymieszać zawartość, a następnie powtórzyć inkubację i wirowanie próbek. Przenieść każdy eluat do odpowiedniej probówki.Po odwirowaniu połączonego eluatu przez dwie minuty przy 2500 ×g, przenieś każdy nadosad do nowej probówki, aby zapewnić całkowite usunięcie żywicy. Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby wysuszyć eluat przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Resuspenduj wysuszone glikopeptydy w 15 µL 2% ACN i 0,5% TFA w wodzie dwukrotnie destylowanej.Następnie należy przeprowadzić analizę spektrometrią mas zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu białka ECM z tkanki sercowo-naczyniowej są przygotowywane do analizy składu ECM za pomocą ciekłej chromatografii i tandemowej spektrometrii mas, a także do pośredniej i bezpośredniej analizy glikopeptydów. Główna strategia opiera się na sekwencyjnych inkubacjach z chlorkiem sodu, SDS oraz węglodanem guanidyny, po których następuje pośrednia lub bezpośrednia analiza glikopeptydów.Wydajność ekstrakcji monitoruje się na żelach bis-tris akrylamidowych z zastosowaniem barwienia srebrem w celu wizualizacji. spośród trzech przeprowadzonych ekstrakcji, większość glikoprotein ECM widoczna jest w alikwotach chlorku guanidyny. Glikoproteiny ECM są ozdobione dużymi i powtarzalnymi łańcuchami glikozaminoglikanów oraz krótkimi i zróżnicowanymi oligosacharydami typu N- i O-linkowanego.Wydajność deglikozylacji jest oceniana po dodaniu enzymów trawiących glikanami glikozaminowe oraz enzymów celujących w mniejsze oligosacharydy typu N- i O-linkowanego. Glikoproteiny są następnie identyfikowane na podstawie obecności deamidowanych asparagin znakowanych tlenem 18 w sekwonach NXT lub NXS. Przedstawiono tutaj reprezentatywne tandemowe widmo masy HCD dla peptydu dekoryny z deamidowaną asparaginą w pozycji dwa 11.Następnie do analizy wzbogaconego w glikoproteiny ekstraktu ECM wykorzystuje się fragmentację HCD ETD. Tandemowe widmo masowe ETD pozwala na charakterystykę składu glikanów. Po opanowaniu techniki, proces ten powinien zająć około dwóch do trzech tygodni.Ta analiza glikoproteomiczna pozwala nam badać fizjologię i patologię funkcji włóknienia nie tylko pod kątem zmian w proteomie, ale także w składzie związanych z nimi cukrów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania próbek do badania glikozylacji białek za pomocą spektrometrii mas. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat chorób układu sercowo-naczyniowego, może być ona również zastosowana w innych patologiach przebiegających z włóknieniem, takich jak choroby układu oddechowego czy nowotwory.

glycoproteomics-extracellular-matrix-method-for-intact-glycopeptide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Ten protokół opisuje procedurę wzbogacania białek ECM z tkanek lub guzów oraz deglikozylacji i trawienia preparatów wzbogaconych w ECM na peptydy w celu analizy ich składu białkowego za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa główną rolę w definiowaniu mikrośrodowiska komórek oraz w modulowaniu ich zachowania i fenotypu. Opisujemy szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórki, którą można dostosować do różnych skal do badań mikroskopowych, biochemicznych, proteomicznych lub funkcjonalnych.

Szybka, skalowalna metoda izolacji, badania funkcjonalnego i analizy macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj metodę glikoproteomiki macierzy zewnątrzkomórkowej w tkankach sercowo-naczyniowych. Protokół umożliwia identyfikację miejsc glikozylacji i charakteryzację glikanów przy użyciu spektrometrii mas LC-MS/MS.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów