Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Ogólnym celem tego protokołu jest analiza składu białek macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym identyfikacja miejsc glikozylacji i charakterystyka składu form glikanów w tkankach sercowo-naczyniowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w procesie zwłóknienia tkanek, takie jak to, w jaki sposób glicostlacja macierzy strukturalnej wpływa na zwłóknienie tkanek podczas chorób sercowo-naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do poprzednich protokołów, które analizują ogólne zmiany glikozylacji, pozwala ona na scharakteryzowanie glikozylacji w określonych miejscach strukturalnych białek macierzy, zapewniając narzędzie do bardziej ukierunkowanych dalszych badań mechanistycznych.

Zabiegi zademonstrują dr Marika Fava oraz Pani Ferheen Baig z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj wszystkie ekstrakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie za pomocą skalpela pokrój w kostkę od 20 do 50 miligramów tkanki na trzy lub cztery mniejsze kawałki o wielkości około dwóch milimetrów.

Umieść pokrojoną w kostkę chusteczkę w 1,5-mililitrowej tubie i dodaj 500 mikrolitrów lodowatego PBS. Umyj chusteczkę pięć razy przy użyciu 500 mikrolitrów PBS do każdego prania, aby zminimalizować zanieczyszczenie krwi. Przenieś umyte próbki do 1,5 mililitrowej probówki z zakrętką i dodaj objętość buforu chlorku sodu 10-krotność masy tkanki.

Wirować z minimalną prędkością przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś ekstrakt do nowych probówek wirówkowych i odwiruj w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powstałe w ten sposób osady tkanek należy krótko przepłukać świeżym buforem chlorku sodu.

Następnie dodaj objętość buforu SDS 10-krotność masy tkanki i wiruj z minimalną prędkością przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Przenieść ekstrakt do nowych probówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj powstałe granulki wodą podwójnie destylowaną.

Dodać objętość buforu chlorowodorku guanidyny pięciokrotnie większą od masy tkanki i wirować z maksymalną prędkością przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymany ekstrakt przenieść do nowych probówek i odwirować w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ilościowym określeniu białka podać 10 mikrogramów do nowej probówki dla każdej próbki w celu oceny zajętości miejsca glikozylacji i 50 mikrogramów do oddzielnej probówki do bezpośredniej analizy glikopeptydu.

Dodaj 10-krotność objętości etanolu do każdego i inkubuj przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować próbki w temperaturze 16 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zassać supernatant, uważając, aby nie naruszyć wytrąconego osadu.

Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby suszyć granulki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Do każdej próbki dodać 10 mikrolitrów przygotowanego buforu deglikozylacyjnego. Zapakuj probówki z próbkami do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i inkubuj pod kątem 45 stopni przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie zwiększ temperaturę do 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 36 godzin z delikatnym mieszaniem. Po odwirowaniu w temperaturze 16 000 G przez jedną minutę użyj koncentratora próżniowego w temperaturze pokojowej przez 45 minut, aby odparować wodę. Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 10 mikrolitrach wody znakowanej O-18 zawierającej 50 jednostek na mililitr PNGazy F. Inkubować przez 36 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem, a następnie przeprowadzić trawienie trypsyny w roztworze dla wszystkich próbek i przystąpić do oczyszczania C-18.

Na początek dodaj 200 mikrolitrów metanolu do każdej studzienki płytki wirowej C-18, aby aktywować żywicę. Wirować przy 1 000 razy G przez jedną minutę. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 80% ACN i 0,1% TFA w wodzie do każdej studzienki i odwiruj przy 1000 razy G przez jedną minutę.

Następnie dodać 200 mikrolitrów roztworu zawierającego 1% ACN i 0,1% TFA w wodzie do każdej studzienki i odwirować przez jedną minutę przy 1000 razy G. Powtórzyć dodawanie tego roztworu i odwirowanie dwukrotnie. Następnie załaduj próbki do dołków na płytce wirowej i odwiruj przy 1500 razy G przez jedną minutę. Ponownie załaduj przepływ i powtórz wirowanie.

Następnie dodać 200 mikrolitrów roztworu zawierającego 1% ACN i 0,1% TFA w wodzie do każdej studzienki i odwirować przy 1500 razy G przez jedną minutę. Powtórz dodawanie tego roztworu i odwirowanie dwukrotnie. Następnie dodaj 170 mikrolitrów roztworu zawierającego 50% ACN i 0,1% TFA w wodzie do każdej studzienki i odwiruj przy 1500 razy G przez jedną minutę.

Powtórzyć to dodawanie i odwirować jeszcze raz. Za pomocą koncentratora próżniowego suszyć wymyty roztwór w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu użycia.

Następnie należy przeprowadzić analizę tandemowej spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej na próbkach przeznaczonych do oceny zajętości glikozytów. W przypadku próbek przeznaczonych do bezpośredniej analizy glikopeptydowej należy najpierw postępować zgodnie ze standardowym oznakowaniem zerowym TMT, jak opisano w protokole tekstowym. Na początek dodaj do każdych 10 mikrolitrów próbki oznaczonej zerowo TMT 50 mikrolitrów dostarczonego buforu wiążącego.

Następnie podwielokrotność 50 mikrolitrów jednorodnego gliko wychwytuje zawiesinę żywicy do nowych 1,5 mililitrowych probówek i wiruje przez jedną minutę przy 2500 razy G. Usunąć supernatant i dodać 60 mikrolitrów próbki i wiążącego roztworu buforowego do probówek zawierających granulki żywicy za pomocą pipety do wymieszania. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, mieszając z prędkością 1200 obr./min. Po odwirowaniu przez dwie minuty w temperaturze 2000 razy G, przenieść supernatant do nowych probówek.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu do płukania do każdej probówki z żywicą za pomocą pipety do mieszania, aby rozpocząć proces mycia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, mieszając z prędkością 1200 obr./min. Po odwirowaniu w temperaturze 2500 razy G przez dwie minuty przenieść każdy supernatant do odpowiedniej probówki do przechowywania supernatantu, aby zakończyć płukanie.

Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj 75 mikrolitrów buforu elucyjnego i wymieszaj pipetą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut, mieszając z prędkością 1200 obr./min.

Wirować przy 2500 razy G przez dwie minuty i przenieść każdy supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 75 mikrolitrów buforu elucyjnego za pomocą pipety do wymieszania, a następnie powtórzyć inkubację i odwirowanie próbek. Przenieś każdą elucję do odpowiedniej probówki.

Po odwirowaniu połączonej elucji przez dwie minuty w temperaturze 2500 razy G, przenieś każdy supernatant do nowej probówki, aby zapewnić całkowite usunięcie żywicy. Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby wysuszyć elucję przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Zawiesić wysuszone glikopeptydy w 15 mikrolitrach 2% ACN i 05% TFA w wodzie podwójnie destylowanej.

Następnie wykonaj analizę spektrometrii mas zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu białka ECM z tkanki sercowo-naczyniowej są przygotowywane do analizy składu ECM metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas oraz pośredniej i bezpośredniej analizy glikopeptydowej. Podstawowa strategia opiera się na sekwencyjnych inkubacjach z chlorkiem sodu, SDS i chlorowodorkiem guanadyny, a następnie pośredniej lub bezpośredniej analizie glikopeptydu.

Skuteczność ekstrakcji jest monitorowana na żelach bis-tris akrylamidowych z barwieniem srebrem w celu wizualizacji. Spośród trzech przebiegów ekstraktów, większość glikoprotein ECM znajduje się w podwielokrotnościach chlorowodorku guanadyny. Glikoproteiny ECM są ozdobione dużymi i powtarzalnymi łańcuchami glikozaminy wraz z krótkimi i różnorodnymi oligosacharydami sprzężonymi z N i O.

Skuteczność deglikozylacji obserwuje się po dodaniu enzymów trawiących glikany glikozaminowe i enzymów, które celują w mniejsze oligosacharydy związane z N i O. Glikoproteiny są następnie identyfikowane na podstawie obecności deamidowanych asparaginy znakowanych tlenem 18 w sektonach NXT lub NXS. Reprezentatywne tandemowe widmo masowe HCD dla peptydu dekoryny z deamidowaną asparaginą w pozycji drugiej 11 pokazano tutaj.

Fragmentacja HCD ETD jest następnie wykorzystywana do analizy ekstraktu ECM wzbogaconego w glikoproteinę. Tandemowe widmo masowe ETD pozwala na scharakteryzowanie składu glikanów. Po opanowaniu tej techniki powinno zająć około dwóch do trzech tygodni.

Ta glikoproteomika pozwala nam badać fizjologiczne i patologię funkcji zwłóknienia nie tylko w odniesieniu do zmian w proteomice, ale także w zakresie składu cukrów myślowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki do badania glikozylacji białek za pomocą spektrometrii mas. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w choroby sercowo-naczyniowe, może być również stosowana do innych patologii w zwłóknieniu objętościowym, takich jak choroby układu oddechowego lub rak.