Name: Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34. Ta technika pozwala wykrywać subtelne zmiany w imporcie jądrowym, co jest kluczowe dla badań nad stwardnieniem zanikowym bocznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium AI za ich pomocne komentarze i sugestie. Serdecznie dziękujemy prof. Markowi Hippowi (Instytut Biochemii im. Maxa Plancka) za udostępnienie nam wektora wahadłowca GFP. Prace te były wspierane przez granty Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF #124/14), Binational Science Foundation (BSF #2013325), Grantu na Integrację Kariery Marie Curie 7PR (CIG # 333794) oraz Narodowego Instytutu Psychobiologii w Izraelu (NIPI #b133-14/15).

1. Przygotowanie linii komórkowej
<ol>
	<li>Rozmrozić około 1 000 000 mysich komórek nerwiaka zarodkowego rdzenia kręgowego (komórki NSC-34), które były przechowywane w pojemniku z ciekłym azotem. Użyj inkubatora wodnego o temperaturze 37 °C, aż komórki całkowicie się rozmrozą.</li>
	<li>Dodaj świeżą, ciepłą pożywkę (pożywkę DMEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% antybiotyków pen-strep).</li>
	<li>Odwirować rozmrożone komórki (SL16R) w ilości 500 x g przez 5 minut, tworząc osad komórkowy. Odrzucić pożywkę i dodać 1 ml nowej pożywki do ponownego wytworzenia komórek.</li>
	<li>Umieścić zawieszone komórki w kolbie o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 5 ml pożywki. Inkubować komórki przez noc w sterylnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Równolegle umieść 8 niepowlekanych szkiełek nakrywkowych (szkło nakrywkowe: 12 mm, grubość 0,13-0,17 mm) w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i sterylizuj przy użyciu 70% etanolu i ekspozycji na 30 minut światła UV, aż wyschnie. Dodaj podłoże do każdego naczynia i wylej, aby zmyć resztki etanolu.</li>
	<li>Dodaj bufor trypsyny (2,5 g trypsyny i 0,2 g EDTA w 1 litrze zbilansowanego roztworu soli Hanksa) do komórek po osiągnięciu około 90% konfluencji (około 6 milionów komórek na kolbę), aby umożliwić przylegającym komórkom dysocjację. 
	UWAGA: Komórki NSC-34 są wrażliwe i wymagają tylko 15 s inkubacji bufora trypsyny i 1 dodatkowej minuty inkubacji bez trypsyny przed dysocjacją przy użyciu pożywki.</li>
	<li>Umieść komórki na 60-milimetrowych szalkach hodowlanych zawierających szkiełka nakrywkowe z 3 ml pożywki, około 350 000 na szalkę. Pozostaw je w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić przyczepienie komórek do szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek
UWAGA: Po około 24 godzinach, komórki NSC-34 osiągną 40% konfluencji (około 800 000 komórek) i będą gotowe do transfekcji.
<ol>
	<li>Przygotować czystą pożywkę DMEM (300 μl pożywki DMEM na każde 60 mm naczynie hodowlane) w sterylnych probówkach do mikrowirówek.</li>
	<li>Dodać 2 μg każdego plazmidu wymaganego do transfekcji do każdej probówki mikrowirówkowej zawierającej DMEM. 
	UWAGA: Plazmid shuttle-GFP jest obowiązkowy we wszystkich transfekcjach komórkowych.</li>
	<li>Dodać odczynnik do transfekcji do wszystkich probówek do mikrowirówek, które zawierają wymagane plazmidy. Tutaj dodaj 4 μl komercyjnego odczynnika do transfekcji na każde 2 μg DNA.</li>
	<li>Wirować probówki do mikrowirówek zawierające DMEM, plazmidy i odczynnik do transfekcji i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 25 minut.</li>
	<li>Dodaj każdą probówkę do mikrowirówki do naczynia hodowlanego i delikatnie wymieszaj naczynie, aby uzyskać jednorodny roztwór. Umieść naczynie z powrotem w inkubatorze na 48 godz. 
	UWAGA: Ponieważ shuttle-GFP powinien być wyrażany we wszystkich komórkach, skuteczność transfekcji shuttle-GFP można częściowo zbadać i wstępnie przetestować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po nocnej transfekcji. Pełne badanie białek nieulegających ekspresji fluorescencyjnej można przeprowadzić za pomocą analizy immunoblot.</li>
</ol>
3. Mikroskopia
<ol>
	<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe zawierające transfekowane komórki NSC-34 do uchwytu na szkiełko nakrywkowe i delikatnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia oderwanych martwych komórek.</li>
	<li>Zidentyfikuj odpowiednią łatkę komórkową za pomocą zielonego filtra fluorescencyjnego z odwróconym mikroskopem. 
	UWAGA: Odpowiedni plaster komórkowy definiuje się jako pole widzenia mikroskopu pokazujące dużą liczbę komórek (20-30 komórek w polu) i w którym jądra są wyraźnie zdefiniowane w komórkach. Jądra komórkowe w obrębie łaty komórkowej są najpierw identyfikowane wzrokowo i ręcznie oznaczane przez oprogramowanie do obrazowania.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu inhibitora eksportu-1 leptomycyny B (LMB) zawierającego 10 ng/ml LMB w PBS do szkiełek nakrywkowych, wlewając bufor na szkiełka nakrywkowe pod mikroskopem. 
	UWAGA: Ten punkt w czasie jest ustawiony jako interwał zerowy.</li>
	<li>Określ ilościowo intensywność fluorescencji oznaczonych jąder w odstępach 3 s przez około 400-500 s.</li>
	<li>Zbadać od 3 do 5 szkiełek nakrywkowych dla każdej grupy transfekcji w każdym indywidualnym doświadczeniu.</li>
</ol>
4. Analiza
UWAGA: Ponieważ różne komórki wyrażają różne poziomy fluorescencyjnego GFP, ważne jest, aby znormalizować intensywność fluorescencji jądrowej każdej komórki do jej początkowej intensywności fluorescencji.
<ol>
	<li>Znormalizuj intensywność fluorescencji oznaczonych jąder, dzieląc 3-sekundowy interwał fluorescencyjny każdego jądra przez średnią z początkowych sześciu interwałów tego jądra.</li>
	<li>Po normalizacji każdego jądra należy wytworzyć krzywą intensywności fluorescencji reprezentującą zmianę fluorescencji jąder w funkcji czasu dla każdej łaty komórki. Aby to zrobić, oblicz średnią wszystkich komórek w każdej łatce komórkowej (składającej się z około 20-30 komórek w każdym łacie). 
	UWAGA: Krzywa intensywności fluorescencji jąder przypomina krzywą nasycenia Michaelisa-Mentena, którą lepiej zaobserwować w dłuższych okresach czasu. Wynika to ze zmniejszania się cytozolowych ilości czółenka-GFP z czasem w związku z transportem jądrowym. Spadek ten statystycznie obniża prawdopodobieństwo transportu wahadłowca-GFP do jądra, osiągając w ten sposób nasycenie fluorescencją jądrową. Nachylenie wyprowadzone z liniowej szybkości początkowej krzywej daje Vmaksymalną szybkość wchodzenia do jądra.</li>
	<li>Przeanalizujnachylenia V max każdej łatki komórkowej, pochodzące z trzech do pięciu niezależnych eksperymentów, używając oprogramowania do tworzenia wykresów, aby uzyskać jedno nachylenie reprezentujące każdą grupę eksperymentalną. Wykonaj kwantyfikację przy użyciu jednoczynnikowej analizy statystycznej ANOVA.</li>
</ol>
5. Walidacja ekspresji białka
<ol>
	<li>Umieścić na lodzie 60-milimetrowe szalki hodowlane zawierające resztki komórek (niewykorzystane w powyższym doświadczeniu).</li>
	<li>Wyrzucić pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu rozcieńczenia i umycia pozostałej pożywki.</li>
	<li>Potraktuj komórki 200-400 μl buforu do lizy zawierającego PBS, 0,5% Triton i tabletkę koktajlową inhibitora proteazy (PI). Zeskrobać za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>Zebrać komórki w buforze do lizy w probówce mikrowirówki i homogenizować z homogenizatorem przy 4,000 obr./min przez 1 minutę pod lodem.</li>
	<li>Odwirować homogenizowane komórki w temperaturze 2 500 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant, określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu Bradforda i przechowywać do momentu użycia w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zebrać od 30 do 70 μg białka ogółem (w zależności od białka) i załadować je do żelu SDS-PAGE w celu zbadania ekspresji białka za pomocą testu immunoblot.</li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , 4th edn, Garland Science. (2002).</li>
<li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li>
<li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li>
<li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877(2016).</li>
<li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li>
<li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli%2C+impede+RNA+biogenesis%2C+and+kill+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li>
<li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li>
<li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li>
<li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9ORF72+poly%28GA%29+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li>
<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li>
<li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li>
<li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li>
<li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+frontotemporal+dementia+and%2For+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li>
<li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li>
<li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li>
<li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS%2FFTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten demonstruje wysoce czuły i ilościowy nowy test do oceny drobnych zmian w transporcie nukleocytoplazmatycznym. Za pomocą tego systemu możliwa jest obserwacja i pomiar transportu nukleocytoplazmatycznego i jego dysfunkcji w czasie rzeczywistym, a nie tylko dużych defektów, które skutkują dramatycznymi zmianami w dystrybucji białek. Test ten ma nie tylko przewagę w zakresie czułości, ale także wymaga niewielkiego przygotowania, jest niedrogi i jest bardzo łatwym i mało angażującym testem.
<p class="jove_con...

Kompleks porów jądrowych (NPC) kontroluje import i eksport dużych cząsteczek do i z jądra komórkowego. W przeciwieństwie do małych cząsteczek, które mogą dostać się do jądra bez regulacji1, transport większych cząsteczek jest silnie kontrolowany przez NPC. Te duże cząsteczki, takie jak białka i RNA, wiążą się z czynnikami transportowymi, w tym importynami i eksportynami, które mają być importowane i eksportowane z jądra2. Aby białka mogły zostać zaimportowane, muszą zawierać mały motyw peptydowy, ogólnie nazywany sygnałem lokalizacji jądrowej (NLS), który jest związany przez importyny2. Te sekwencje aminokwasów działają jak znacznik i są zróżnicowane pod względem składu3,4. Białka mogą być eksportowane z jądra do cytoplazmy ze względu na ich związek z eksportynami, które wiążą sekwencję sygnałową, ogólnie nazywaną jądrowym sygnałem eksportowym (NES)2. Zarówno importy, jak i eksporterzy są w stanie transportować swoje ładunki dzięki regulacji małej GTPazy białka jądrowego związanego z Ras (Ran)2. Wykazano, że ran występuje w różnych stanach konformacyjnych w zależności od tego, czy jest związany z GTP czy GDP. Po powiązaniu z GTP, Ran może wiązać się z importinami lub exportinami. Po związaniu się z RanGTP, importy zwalniają swój ładunek, podczas gdy eksporty muszą związać RanGTP, aby utworzyć kompleks ze swoim ładunkiem eksportowym. Dominujący stan wiązania nukleotydów Ran zależy od jego lokalizacji w jądrze (RanGTP) lub cytoplazmie (RanGDP).
Ostatnio, wiele badań wykazało związek między upośledzeniem szlaku nukleocytoplazmatycznego a zarówno stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS), jak i otępieniem czołowo-skroniowym (FTD)5,6,7,8,9,10,11,12. ALS jest postępującą i śmiertelną chorobą neurodegeneracyjną atakującą zarówno górne, jak i dolne neurony ruchowe (MNs)13 i prowadzącą do paraliżu, a ostatecznie do śmierci, średnio w ciągu 2-5 lat. Większość przypadków ALS jest klasyfikowana jako sporadyczne (SALS), bez widocznych powiązań genetycznych, ale 10% jest dziedziczonych w sposób dominujący (rodzinne ALS; FAŁSZE). Ostatnio zidentyfikowano ekspansje powtórzeń heksanukleotydowych (HRE) w genie chromosomu 9 z otwartą ramką odczytu 72 (C9orf72) 14,15 jako genetyczna przyczyna ALS i FTD. Mutanty te stanowią 30-40% przypadków FALS16, a różne badania wykazały, że powodują one toksyczność, wpływając na transport nukleocytoplazmatyczny5,6,7,8,9,10,11,12.
Te badania w większości wykazały końcowe wyniki i objawy HRE w transporcie nukleocytoplazmatycznym, ale nie wykazały zakłócenia nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym. W rezultacie oceniono tylko poważny niedobór transportu nukleocytoplazmatycznego11,17,18.
Ten protokół opisuje nowy i bardzo czuły test do oceny i ilościowego określenia dysfunkcji transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym. Szybkość importu białka NLS-NES-GFP (SHUTTLE-GFP) MOŻNA OKREŚLIĆ ILOŚCIOWO W CZASIE RZECZYWISTYM ZA POMOCĄ MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ. Odbywa się to za pomocą inhibitora eksportu, jak opisano wcześniej18, co pozwala wahadłowcowi GFP wejść tylko do jądra. Korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania zdolnego do ilościowego określania zmian fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym, możliwe jest ilościowe określenie stopniowych zmian intensywności fluorescencji wahadłowca GFP, znajdującego się w jądrze. W rezultacie, można wyznaczyć podobną do Michaelisa-Mentena krzywą nasycenia osi fluorescencja-czas, reprezentującą ilość promu jądrowego-GFP w danym momencie. Wykorzystując początkową szybkość liniową krzywych, możliwe jest wygenerowanie nachylenia, które reprezentuje szybkość wchodzenia do jądra przed nasyceniem fluorescencyjnym.
Aby potwierdzić test, użyto translowanych powtórzeń dipeptydowych C9orf72, poly(GR) i poly(PR), które wcześniej zgłaszano, że zakłócają transport nukleocytoplazmatyczny5,7,8,10,12. Stosując ten test, zaobserwowano 50% spadek wskaźnika importu jądrowego w porównaniu z kontrolą. Za pomocą tego systemu można badać drobne zmiany w transporcie nukleocytoplazmatycznym. Ponadto można określić zdolność różnych czynników do ratowania defektu transportu nukleocytoplazmatycznego.

<table><tbody><tr><td>Mysia hybrydowa linia komórkowa podobna do neuronów ruchowych (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g / L L-glukozy</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS Przemysł</td><td>biologiczny</td> klasy europejskiej <td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka SL 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Płaszcz wodny CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe o średnicy 12 mm, grubości 0,13-0,17 mm</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TurboFect</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Axiovert 100</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycyna B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Silnik homogenizatora/sterowanie/uchwyt/zacisk 90 stopni</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Wirówka, chłodzona</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach nsc-34 podobnych do neuronów ruchowych

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Transport nukleocytoplazmatyczny odnosi się do importu i eksportu dużych cząsteczek z jądra komórkowego. Ostatnio wiele badań wykazało związek między stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) a upośledzeniem szlaku nukleocytoplazmatycznego. ALS jest chorobą neurodegeneracyjną atakującą neurony ruchowe i prowadzącą do paraliżu, a ostatecznie do śmierci, średnio w ciągu 2-5 lat. Większość przypadków ALS jest sporadyczna, bez widocznych powiązań genetycznych, ale 10% jest dziedziczonych w sposób dominujący. Ostatnio ekspansje powtórzeń heksanukleotydowych (HRE) w genie chromosomu 9 z otwartą ramką odczytu 72 (C9orf72) zostały zidentyfikowane jako genetyczna przyczyna ALS i otępienia czołowo-skroniowego (FTD). Co ważne, różne grupy zasugerowały ostatnio, że te mutanty wpływają na transport nukleocytoplazmatyczny. Badania te w większości wykazały ostateczny wynik i objawy wywołane przez HRE w transporcie nukleocytoplazmatycznym, ale nie wykazały dysfunkcji transportu jądrowego w czasie rzeczywistym. W rezultacie można określić tylko poważny niedobór transportu nukleocytoplazmatycznego, głównie z powodu wysokiej nadekspresji lub insercji białek egzogennych. 
Ten protokół opisuje nowy i bardzo czuły test do oceny i ilościowego określenia dysfunkcji transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym. Szybkość importu białka NLS-NES-GFP (SHUTTLE-GFP) MOŻNA OKREŚLIĆ ILOŚCIOWO W CZASIE RZECZYWISTYM ZA POMOCĄ MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ. Odbywa się to za pomocą inhibitora eksportu, dzięki czemu czółenka GFP może dostać się tylko do jądra. Aby zweryfikować test, wykorzystano translowane powtórzenia dipeptydowe C9orf72 HRE poly(GR) i poly(PR), które, jak wykazano wcześniej, zakłócają transport nukleocytoplazmatyczny. Przy użyciu opisanego testu zaobserwowano 50% spadek wskaźnika importu jądrowego w porównaniu z kontrolą. Za pomocą tego systemu można badać drobne zmiany w transporcie nukleocytoplazmatycznym i określać zdolność różnych czynników do ratowania (nawet częściowo) defektu transportu nukleocytoplazmatycznego.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, komórki NSC-34 przypominające neurony ruchowe poddano transfekcji białkiem NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Białko to, posiadające sekwencje sygnałowe NLS i NES (Rysunek 1), może przemieszczać się między jądrem a cytoplazmą. Generyczne GFP w przypadku braku sygnału lokalizacji może wnikać do jądra lub z niego wychodzić wyłącznie poprzez dyfuzję, w związku z czym ulega równomiernemu rozkładowi między jądrem a cytoplazmą (Rycina 2A<...

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Ogólnym celem niniejszego testu jest wykrywanie w czasie rzeczywistym niewielkich zmian w szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach, w obecności lub w nieobecności potencjalnych cząsteczek hamujących ten transport. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące konkretnych chorób neurogenetycznych, takich jak ALS, w przypadku których sugeruje się negatywny wpływ na transport nukleocytoplazmatyczny. Do zalet tej techniki należy jej wysoka czułość i charakter ilościowy, a także możliwość analizy w czasie rzeczywistym niewielkich zmian w szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego.Procedurę zaprezentuje Tom Shani, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij od rozmrożenia około 1×10⁶ komórek rdzenia kręgowego neuroblastoma myszy z zapasów w ciekłym azocie, korzystając z łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Po całkowitym rozmrożeniu komórek należy je zebrać poprzez wirowanie, a następnie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki.Następnie przenieść komórki do kolby o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki do hodowli komórek w celu inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, umieścić osiem niepowlekan

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Ten protokół opisuje ekstrakcję białek z komórek raka neuronów. Komórki są myte buforem i poddawane lizie poprzez rozerwanie enzymatyczne i mechaniczne. Wyekstrahowany supernatant bogaty w białko zbiera się po odwirowaniu.

Ekstrakcja białek z komórek neuronalnych

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Poznaj metodę pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34. Ta technika pozwala wykrywać subtelne zmiany w imporcie jądrowym, co jest kluczowe dla badań nad stwardnieniem zanikowym bocznym.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Przeglądaj więcej filmów