Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej
December 27th, 2017
Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 naciekających nowotwór znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich fragmentatorach guzów płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w immunologii nowotworów, takie jak natura elementów, które pozytywnie i negatywnie regulują migrację limfocytów T w ludzkich nowotworach. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam monitorować codzienne zachowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w zachowanym środowisku ludzkiego guza.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy opracowaliśmy metodę w węzłach chłonnych Myrin do śledzenia limfocytów T, sadzenia ich na plasterkach, protokołu pierwotnie opublikowanego w JoVE w 2011 roku. Na początek dodaj jeden gram agarozy o niskiej temperaturze topnienia do pojemnika, a następnie dodaj 20 mililitrów sterylnego PBS wolnego od wapnia i magnezu. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aby całkowicie rozpuścić agarozę.
Schłodzić ten 5% roztwór agarozy w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. W kapturze do hodowli tkankowej dodaj 1,1 mililitra kompletnej pożywki RPMI-1640 do każdej studzienki na sześciodołkowej płytce subhodowlanej. Następnie, za pomocą sterylnych kleszczy, umieść sterylną wkładkę do hodowli komórek o średnicy 30 milimetrów w każdym dołku.
Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aż do późniejszego użycia. Następnie umieść biopsję guza w 10-centymetrowym plastikowym naczyniu i za pomocą ostrego, sterylnego ostrza pokrój guz na mały fragment w kształcie sześcianu, który ma około pięć na pięć milimetrów. Teraz wyjmij przygotowany roztwór agarozy z inkubatora.
Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś fragmenty guza na chusteczkę tkankową, aby odsączyć nadmiar pożywki, a następnie wlej agarozę do 35-milimetrowego plastikowego naczynia i włóż fragmenty guza tak, aby umieścić je na dnie plastikowego naczynia. Pozostaw żel agarozowy na lodzie na pięć minut, aby stężał. Gdy agaroza zastygnie, odwróć plastikowe naczynie.
Za pomocą szpatułki uwolnij cały żel. Ostrym ostrzem przytnij nadmiar agarozy otaczającej fragmenty guza, pozostawiając od trzech do pięciu milimetrów żelu wokół tkanki. Używając kropli nietoksycznego kleju tkankowego, zamontuj blok agarozy na krążku próbki wibratomu.
Napełnij tackę buforową wibratomu sterylnym, lodowatym PBS i zainstaluj w niej krążek z próbką zawierającą blok agarozy. Ustaw prędkość i częstotliwość wibratomu na żądane wartości. Gdy zestaw wibratomu jest gotowy, wyjmij płytkę z sześcioma dołkami z inkubatora.
Teraz zacznij ciąć zamontowany blok na plastry o grubości 350 mikronów za pomocą wibratomu. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie zbieraj plastry guza podczas ich krojenia i umieść je płasko na wkładkach do hodowli komórkowych na płytce z sześcioma dołkami. Przenieś jeden plasterek na każdą wkładkę.
Następnie, za pomocą cienkich kleszczy, umieść wstępnie wysterylizowane i zwilżone podkładki ze stali nierdzewnej na każdym plasterku. Upewnij się, że podkładki są dobrze umieszczone na agarozie otaczającej tkankę nowotworową. Pozostaw płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przed barwieniem immunologicznym.
Rozcieńczyć wymagane przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i fluorescencyjny barwnik jądrowy, DAPI, do wymaganych stężeń winylu w pożywce RPMI wolnej od czerwieni fenolowej. Następnie wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora i za pomocą cienkiej końcówki odessaj płyn z podkładek ze stali nierdzewnej. Teraz, nie dotykając plasterka, dodaj 40 mikrolitrów rozcieńczonych przeciwciał na każdy plasterek guza.
Aby umożliwić barwienie, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po zakończeniu etapu barwienia, za pomocą drobnych kleszczy, usuń podkładki. Następnie delikatnie wyjmij plastry i zanurz je w podłożu wolnym od czerwieni fenolowej RMPI-1640 na 10 sekund.
Umieść plastry z powrotem na wkładkach do hodowli komórkowych i dodaj kroplę pożywki RMPI-1640 wolnej od czerwieni fenolowej na każdy plasterek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przystąp do obrazowania. Na kilka godzin przed rozpoczęciem tego eksperymentu ustaw temperaturę komory cieplnej mikroskopu na 37 stopni Celsjusza, a następnie przygotuj zestaw mikroskopu do ciągłego obfitowania plastrów guza natlenionym roztworem RMPI wolnym od czerwieni fenolowej i zasysania substancji rozpuszczonej do kolby na odpady za pomocą pompy perystaltycznej.
Za pomocą cienkich kleszczy wyjmij poplamiony plasterek z sześciodołkowej płytki i przenieś go do 35-milimetrowego plastikowego naczynia wypełnionego pożywką RMPI wolną od czerwieni fenolowej, a następnie umieść kotwę plasterka na plasterku, aby go podeprzeć. Następnie umieść tę szalkę Petriego na stoliku do obrazowania mikroskopu. Po połączeniu końcówek wlotowych i wylotowych systemu perfuzyjnego należy włączyć pompę perystaltyczną, aby umożliwić przejście natlenionego medium przez rurki perfuzyjne.
Opuść soczewkę ememisji wody do warstwy i skup się na górnej części warstwy przy jasnym świetle pola lub przy odpowiedniej długości fali. Następnie, używając odpowiednich filtrów, wizualizuj i wybierz obszar zainteresowania, który zawiera wszystkie interesujące nas komórki znakowane fluorescencyjnie, a mianowicie limfocyty T CD8, oczka guza i komórki zrębu CD90 dodatnie. Skonfiguruj sesję obrazowania, używając odpowiedniej intensywności lasera i czasów naświetlania, aby dopasować ją do jasności obserwowanych sygnałów fluorescencyjnych.
Następnie ustaw grubość stosu Z, aby zobrazować w wycinku guza. Następnie wybierz przedział czasu obrazu Z-stack i całkowity czas nagrywania, aby przechwytywać obrazy w określonych odstępach czasu. Po przechwyceniu i wyeksportowaniu obrazów fluorescencyjnych przeanalizuj migrację limfocytów T CD8 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz barwionego ludzkiego wycinka guza płuca. Zwróć uwagę na rozmieszczenie zielonych limfocytów T CD8-dodatnich, komórek nowotworowych barwionych cząsteczką adhezyjną niebieskich komórek nabłonkowych oraz czerwonych komórek zrębowych CD90 lub tyrum-dodatnich. W szczególności należy zauważyć, że limfocyty T CD8 są liczniejsze w zrębie w porównaniu z oczkami guza.
Wykreślone tutaj są trajektorie poszczególnych rezydentnych limfocytów T CD8 zabarwionych na zielono oraz czerwone zręby i niebieskie przedziały komórek nowotworowych ludzkiego wycinka guza płuc. Kolagen wykryty za pomocą drugiej harmonicznej i wyświetlany na czerwono, oznacza przedział zrębu. Chociaż mniej liczne niż oczka nowotworowe, limfocyty T CD8 migrują aktywniej w tym przedziale w porównaniu ze zrębem.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać zwykle w ciągu czterech, pięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po tym filmie powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać próbki guza z humorem immunologicznym, aby monitorować rezydentne limfocyty T CD8 za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę obrazowania obecnych w guzie limfocytów T CD8, oznaczonych przeciwciałami sprzężonymi z barwnikami fluorescencyjnymi, w wycinkach guza płuc u ludzi. Ta technika umożliwia analizy w czasie rzeczywistym migracji limfocytów T CD8 za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Onkologia
- Mikroskopia
Wprowadzenie
- Zrozumienie migracji komórek T jest kluczowe w immunologii nowotworów.
- Ta metoda bazuje na wcześniejszych technikach udokumentowanych dla śledzenia komórek T.
- Mikroskopia konfokalna zapewnia szczegółowe obrazowanie interakcji komórkowych.
- Oznakowanie fluorescencyjne wzmacnia widoczność specyficznych typów komórek.
Cel badania
- Monitorowanie zachowania obecnych w guzie limfocytów T CD8 w zachowanym środowisku guza.
- Badanie czynników regulujących migrację komórek T wewnątrz guzów.
- Poprawa zrozumienia interakcji między nowotworem a układem odpornościowym.
Metody
- Przygotowanie wycinków guza przy użyciu agarozki o niskiej temperaturze topnienia.
- Oznaczenie przeciwciałami z barwnikami fluorescencyjnymi.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
- Analiza wzorców migracji limfocytów T CD8.
Główne wyniki
- Pomyślne obrazowanie limfocytów T CD8 w wycinkach guza płuc u ludzi.
- Wizualizacja dystrybucji komórek T w mikrosiedliskach guza.
- Identyfikacja wzorców migracji obecnych w guzie limfocytów T CD8.
- Wskazówki dotyczące interakcji między komórkami T i komórkami nowotworowymi.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia potężne narzędzie do badania dynamiki komórek T w nowotworach.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym może ujawnić kluczowe spostrzeżenia dotyczące immunologii nowotworów.
- Przyszłe badania mogą bazować na tej technice, aby zbadać interwencje terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of resident CD8 T cell migration within human tumor microenvironments, addressing a critical gap in preclinical immuno-oncology models. By preserving native tissue architecture and cellular interactions, it provides mechanistic insights into T cell-tumor-stromal dynamics that inform target validation and therapeutic screening. The approach supports early-stage hypothesis testing and de-risks immunotherapy candidates by linking phenotypic behavior to functional outcomes in a clinically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking CD8 T cell migration in response to tumor antigens and microenvironmental cues.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of T cell behavior in preserved human tumor slices.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by revealing migration patterns that correlate with anti-tumor activity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated human tumor slice systems for screening immunomodulatory compounds that influence T cell migration.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and immunostaining workflows to ensure reproducible, quantitative imaging outputs.
- Scalability: Enables platform reuse across immunotherapy campaigns by maintaining consistent slice viability and staining fidelity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings and animal models by preserving human tumor-stromal-T cell interactions in a near-physiological context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies spatial and dynamic relationships between CD8 T cells, tumor cells, and stromal compartments to inform biomarker alignment.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing human-relevant data on T cell infiltration and motility prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, offering a human-relevant readout for immunomodulatory mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time tracking of CD8 T cell migration in response to immunological stimuli within human tumor tissue.
- Screening: Delivers assay-ready systems with standardized slice preparation and fluorescent labeling for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative migration trajectories and spatial distribution data that allow comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by preserving human tumor architecture and cellular interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal immunotherapy screening across multiple tumor types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in T cell-tumor interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized agarose embedding, vibratome sectioning, and immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering human-relevant functional data that reduces late-stage biological risk in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on observed T cell migration efficacy in disease-relevant human tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, immunostaining, and confocal microscopy setup for live imaging.
- Dependent on precision instrumentation including vibratome, perfusion system, and temperature-controlled microscope stage.
- Necessitates cross-team standardization between pathology, immunology, and imaging teams to ensure slice quality and staining consistency.
- Involves adaptation considerations for varying tumor densities and stromal content across lung cancer subtypes.
- Limited by slice viability duration, necessitating timely imaging post-preparation to maintain physiological relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Agarose Embedding and Vibratome Slicing of Human Lung Tumors
3:51
Immunostaining of Resident CD8 T Cells and Tumor Cells
5:07
Imaging and Analyzing Resident CD8 T Cell Migration Within Human Lung Tumor Slices
7:03
Results: Distribution and Motility Patterns of Resident CD8 T Cells in Human Lung Tumor Tissues
7:53
Conclusion
