Name: Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę obrazowania rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia analizę migracji komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Pierre'owi Bourdoncle'owi i Thomasowi Guilbertowi z Cochin Imaging Facility (Institut Cochin, Paryż) za rady i pomoc przy mikroskopach. Prace te były częściowo wspierane przez granty z francuskiej Ligue Nationale contre le Cancer, CARPEM (Cancer Research for Personalized Medicine), Fondation de France oraz z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 667980 (CARAT).

Ludzkie nowotwory uzyskano za zgodą francuskiej komisji etycznej i przez Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) zgodnie z artykułem L.1121-1 francuskiego prawa. Przed włączeniem do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów.
1. Wykrywanie ludzkich guzów płuc
<ol>
	<li>Uzyskaj świeże próbki guza płuc od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca w stadium I-III, którzy przeszli całkowitą chirurgiczną resekcję guzów płuc4.</li>
	<li>Nieutrwalony świeży guz należy przetransportować w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej lodowato zimne podłoże z Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640). Odstawić na lodzie na 30 minut do kroku 2.7. 
	UWAGA: Gdy guzy zostaną otrzymane po południu, umieść je w temperaturze 4 °C na noc i przetwórz następnego dnia. W takim przypadku należy uzupełnić pożywkę RPMI-1640 o 5% płodową surowicę bydlęcą (FBS).</li>
</ol>
2. Osadzanie agarozy i krojenie wibratomem ludzkich guzów płuc
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki do 2.10 w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotować 5% roztwór agarozy do zatopienia, rozpuszczając 1 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu. Podgrzewaj ten roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Pozostawić agarozę do ostygnięcia w temperaturze 37 °C, umieszczając roztwór w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej przygotuj kompletną pożywkę RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 4 mM L glutaminy oraz 1x penicylinę i streptomycynę.</li>
	<li>Dodaj 1,1 ml kompletnej pożywki RPMI-1640 na studzienkę do 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i umieść 30-milimetrową wkładkę do hodowli komórkowej w każdym dołku. Odłożyć płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut do kroku 2.12.</li>
	<li>Wysterylizowane podkładki płaskie ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 5 mm, średnica zewnętrzna 10 mm i grubość 1 mm) należy umieścić w 35-milimetrowym plastikowym naczyniu wypełnionym kompletnym podłożem RPMI. Podkładki będą dalej używane do koncentracji przeciwciał na plasterku pokrojonym wibratomem.</li>
	<li>Umieść biopsję guza w plastikowym naczyniu o średnicy 10 cm i pokrój guz ostrym ostrzem na małe fragmenty w kształcie sześcianu o długości około 5x5 mm.</li>
	<li>Wyjmij agarozę z inkubatora i wlej roztwór do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść fragmenty guza na chusteczkę tkankową, aby usunąć nadmiar podłoża. Włóż fragmenty do agarozy i umieść je na dnie plastikowego naczynia. Pozostaw żel agarozowy na lodzie na 5 minut do zestalenia.</li>
	<li>Gdy agaroza zastygnie, odwróć plastikowe naczynie i użyj szpatułki, aby uwolnić cały żel.</li>
	<li>Za pomocą ostrego ostrza przyciąć nadmiar agarozy otaczającej fragment guza, pozostawiając 3-5 mm żelu wokół tkanki.</li>
	<li>Zamontuj każdy blok agarozy na krążku próbki wibratomu za pomocą kropli nietoksycznego kleju tkankowego z cyjanoakrylanu butylu. Napełnij tackę buforową wibratomu sterylnym, lodowatym PBS i zainstaluj dysk z próbką w tacy.</li>
	<li>Pokrój tkankę zatopioną w agarozie na plastry o grubości 350 μm. Dostosuj ustawienia wibratomu przy niskim zakresie prędkości (0.2-0.3 mm/s) i częstotliwości wibracji przy średnim zakresie (1.5 mm).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie zbierz plastry guza podczas ich krojenia i umieść je płasko na wkładkach do hodowli komórkowych na 6-dołkowej płytce (krok 2.3). Przenieś 1 plasterek na każdą wkładkę. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z plastrami, ponieważ można je łatwo uszkodzić.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczyków, aby umieścić podkładki ze stali nierdzewnej na każdym pojedynczym plasterku. Upewnij się, że podkładki są dobrze umieszczone na agarozie otaczającej tkankę nowotworową.</li>
	<li>Utrzymywać płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 10 minut. Przejść do barwienia immunologicznego.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne rezydentnych limfocytów T CD8 i komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała (stężenie końcowe 10 μg/ml) i barwnik jądrowy (stężenie końcowe 1 μg/ml) w pożywce RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej. 
	UWAGA: Użyj fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał anty-CD8 (mysia IgG, klon SK1) i anty-EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka) (mysia IgG HEA-125) do znakowania odpowiednio limfocytów T CD8 i komórek nabłonka nowotworu. Użyj fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała anty-CD90 / Thy1 (mysia IgG, klon 5E10) do znakowania fibroblastów i aktywowanych komórek śródbłonka. Użyj 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do znakowania jądra komórkowego z naruszoną błoną plazmatyczną w celu oceny żywotności tkanek.</li>
	<li>Wyjmij płytki hodowlane z inkubatora i za pomocą pipety zassaj płyn z podkładek ze stali nierdzewnej. Nie wyjmuj pożywki o pojemności 1.1 ml RPMI-1640 umieszczonej pod wkładkami do hodowli komórkowych (krok 2.3).</li>
	<li>Nie dotykając plastra i używając końcówki pipety, dodaj 40 μl roztworu zawierającego przeciwciała na każdy plasterek guza.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić barwienie przeciwciałami.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy zdejmij podkładki, wyjmij plastry i zanurz je na 10 s w podłożu RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej. Umieść plastry z powrotem na wkładkach do hodowli komórkowych i dodaj kroplę pożywki RPMI-1640 wolnej od czerwieni fenolowej na każdy pojedynczy plasterek. Utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Przejdź do obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i analiza migracji rezydentnych limfocytów T CD8 w obrębie ludzkich wycinków guza płuc
UWAGA: Mikroskop konfokalny używany w tym protokole to pionowy wirujący dysk wyposażony w obiektyw z 25-krotnym zanurzeniem w wodzie (25x/0,95 N.A.).
<ol>
	<li>Przygotowanie zestawu mikroskopu
	<ol>
		<li>Ustaw temperaturę komory grzewczej mikroskopu na 37 °C na kilka godzin przed rozpoczęciem sesji obrazowania.</li>
		<li>Skonfiguruj system do ciągłej perfuzji plastrów guza za pomocą natlenionej (5% CO2, 95% O2) pożywki RPMI wolnej od czerwieni fenolowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Za pomocą pompy perystaltycznej wprowadzić media perfuzyjne do komory obrazowania i zassać roztwór do kolby do zbierania odpadów.</li>
		<li>Uruchom pompę perystaltyczną, aby natleniony roztwór mógł przejść przez rurki perfuzyjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków wyjmij plasterek z płytki 6-dołkowej i przenieś go do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm wypełnionego pożywką RPMI bez czerwieni fenolowej. Unieruchom plasterek za pomocą kotwy o średnicy 19,7 mm z gwintami w odstępach 2 mm. Umieść szalkę Petriego na stoliku do obrazowania mikroskopu. Podłącz końcówki wlotowe i wylotowe systemu perfuzyjnego. Włącz system perfuzyjny i ustaw natężenie przepływu pożywki na 0,8 ml/min.</li>
	<li>Opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do plasterka. Skoncentruj się na górnej części plastra w jasnym świetle polowym. Używając odpowiedniego światła fluorescencyjnego, wybierz obszar zainteresowania, który zawiera limfocyty T CD8, wyspy guzakowe (dodatnie dla EpCAM) i obszar zrębu (dodatni dla CD90). Sprawdź żywotność komórek w plastrze, oceniając barwienie DAPI na powierzchni cięcia i głębiej w tkance. 
	UWAGA: Zdrowy plasterek zawiera tylko mniejszość komórek DAPI dodatnich w odległości kilku mikronów od powierzchni cięcia.</li>
	<li>Ustaw sesję obrazowania, wykonując następujące czynności.
	<ol>
		<li>W zależności od intensywności sygnału fluorescencyjnego 3 fluoroforów, ustaw czas naświetlania w zakresie od 50 do 800 ms, a intensywność lasera w zakresie od 20 do 40%.</li>
		<li>Wybierz grubość stosu z do zobrazowania w obrębie wycinka guza. 
		UWAGA: Tutaj uchwycono 10-12 płaszczyzn optycznych o łącznej głębokości 60-70 μm w wymiarze z.</li>
		<li>Wybierz pozycję początkową około 10 μm poniżej pierwszych oznaczonych komórek T CD8.</li>
		<li>Zdefiniuj odstęp czasu między każdym obrazem ze stosu z zakresu od 10 do 30 s oraz całkowity czas nagrywania od 10 do 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj migrację rezydentnych limfocytów T CD8 zgodnie z opisem w reference4.
	<ol>
		<li>Po zaimportowaniu danych do oprogramowania śledzącego utwórz punkty dla każdej komórki T CD8 w terenie. Dostosuj średnicę komórek i próg wykrywania zgodnie z obrazowanymi komórkami fluorescencyjnymi.</li>
		<li>Sprawdź ścieżki i usuń wszelkie nieistotne ścieżki, usuwając je. Koryguj ścieżki, łącząc i rozłączając różne ścieżki i różne punkty czasowe tych samych ścieżek. Eksportuj dane (prędkość ścieżki, długość przemieszczenia ścieżki) do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054(2011).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li>
<li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500(2015).</li>
<li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+Oncology+Meets+Immunology%3A+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li>
<li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exclusion%2C+immune+privilege%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisano prostą, szybką i solidną technikę generowania wycinków ludzkiego guza płuc i oceny dynamicznego zachowania rezydentnych limfocytów T CD8 w zachowanym środowisku guza przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Protokół ten jest udoskonaleniem poprzedniego artykułu JoVE, który opisuje monitorowanie posianych limfocytów T na mysich węzłach chłonnych2.
Należy wziąć pod uwagę wybielanie barwników fluorescencyjnych, zwłaszcza w przypadku barwników pierwszej generacji, takich jak izotiocyjanian fluoresceiny i fikoerytryna. Odkryliśmy, że wyraźne fotowybielanie przeciwciał sprzężonych bezpośrednio wystąpiło przy użyciu mikroskopu dwufotonowego. I odwrotnie, minimalne fotowybielanie zauważono w przypadku mikroskopów konfokalnych, zwłaszcza przy użyciu jasnych barwników fluorescencyjnych opracowanych niedawno.
Przeciwciała są stosunkowo dużymi cząsteczkami i dlatego ich przenikanie do tkanki może być trudne. Ten krok można poprawić, wydłużając czas inkubacji. Ponadto dobrą alternatywą jest użycie mniejszych odczynników barwiących, takich jak bezpośrednio sprzężone fragmenty przeciwciał Fab.
Wszystkie przeciwciała opisane w tym protokole zostały wcześniej zwalidowane i wiadomo, że wytwarzają jasne zabarwienie4. W związku z tym kontrole izotypu nie są wymagane. Jeśli jednak pożądane są modyfikacje tej metody przy użyciu innych przeciwciał, zdecydowanie zaleca się stosowanie przeciwciał kontrolnych izotypu.
Ten eksperymentalny system ma pewne ograniczenia. Procedura cięcia uszkodzi tkankę, co może wpłynąć na zachowanie limfocytów T CD8, szczególnie w pobliżu powierzchni cięcia. Ponadto może dojść do utraty szeregu rozpuszczalnych czynników (np. chemokin) odgrywających zasadniczą rolę w kontrolowaniu migracji limfocytów T. Jednym ze sposobów na ominięcie tych problemów jest monitorowanie limfocytów T znajdujących się w odległości kilkudziesięciu mikronów od powierzchni w przypuszczalnie zdrowszych obszarach tkanki. Opublikowane eksperymenty ujawniają, że limfocyty T zlokalizowane głęboko w tkance migrują aktywniej niż limfocyty T zlokalizowane w pobliżu powierzchni cięcia4. Do naszych badań użyliśmy mikroskopów konfokalnych, ale jest prawdopodobne, że mikroskopy dwufotonowe zwiększą rozdzielczość przestrzenną w głąb.
Podejście to opiera się na wykorzystaniu przeciwciał sprzężonych fluorescencyjnie, które nie są cząsteczkami obojętnymi. Pełnowymiarowe przeciwciała są podatne na wpływanie na normalne funkcjonowanie limfocytów T na różne sposoby. Po pierwsze, przeciwciała anty-CD8 mogą zmieniać migrację limfocytów T poprzez wyzwalanie wewnątrzkomórkowej kaskady sygnalizacyjnej zdolnej do wpływania na cytoszkielet limfocytów. Po drugie, przeciwciała anty-CD8 mogą modulować interakcję między cząsteczkami CD8 i MHC klasy I, co jest ważnym krokiem w procesie rozpoznawania antygenu. Po trzecie, nienaruszone przeciwciała mogą wiązać się z receptorami Fc wyrażanymi przez wiele komórek szpikowych rozmieszczonych w guzie, a zatem podatnych na zwiększenie sygnału niespecyficznego. Nic nie wskazuje na to, że taki problem wpłynął na nasze dane, prawdopodobnie dlatego, że receptory Fc rezydentnych komórek szpikowych są, w przeciwieństwie do komórek w hodowli, nasycone immunoglobulinami obecnymi w środowisku nowotworowym. Rzeczywiście, dodanie surowicy podczas procedury znakowania, procesu, o którym wiadomo, że blokuje wolne receptory Fc, nie zmieniło barwienia immunologicznego. Niemniej jednak fragmenty Fab przeciwciał, pozbawione regionu Fc, a także przeciwciała zmutowane w swoim regionie Fc i fragmenty przeciwciał pochodzących z wielbłądowatych8 reprezentują inne alternatywne strategie śledzenia komórek rezydentnych za pomocą znaczników fluorescencyjnych.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka systemów modelowych, które są wykorzystywane do obrazowania limfocytów T w czasie rzeczywistym. Należą do nich preparaty in vitro limfocytów T uprzednio oczyszczonych i wyhodowanych z komórkami prezentującymi antygen. Takie preparaty pozwoliły na niezwykły postęp w definiowaniu mechanizmów rozpoznawania i reagowania na antygeny. Brakuje im jednak złożoności środowiska tkankowego. Ustalono inne preparaty, które bardziej naśladują strukturę tkanki rodzimej. Na przykład trójwymiarowe matryce żelu kolagenowego, w których osadzono oczyszczone limfocyty T, a także hodowlę zreagregowanych fragmentów tkanek wykorzystano do monitorowania dynamicznego zachowania limfocytów T za pomocą technologii obrazowania fluorescencyjnego9. Systemy te mają tę zaletę, że mają architekturę zbliżoną do tkanki natywnej, ale brakuje im innych ważnych czynników komórkowych i rozpuszczalnych. U myszy zastosowano dwufotonową mikroskopię przyżyteczną do śledzenia limfocytów T w prawdziwie fizjologicznym środowisku nienaruszonego narządu10. Takie podejście jest jednak technicznie trudne do skonfigurowania. Ponadto modele mysie wykazują znaczące różnice w stosunku do fizjologii człowieka.
Technika opisana w tym protokole reprezentuje złożone, wielokomórkowe środowisko nowotworowe, które ma wyjątkową pozycję, aby działać jako ważne ogniwo między badaniami nad współkulturami a modelami zwierzęcymi.
Opisany w niniejszym dokumencie protokół może być również stosowany do śledzenia ruchliwości komórek innych niż limfocyty T CD8, dla których wytworzono przeciwciała. Co więcej, technikę tę można dostosować do innych nowotworów i tkanek ludzkich i mysich. Na przykład, byliśmy w stanie zobrazować w czasie rzeczywistym dynamikę limfocytów B znakowanych przeciwciałem anty-CD19 w świeżych ludzkich migdałkach.
Technika opisana w tym protokole pozwala na badanie przesiewowe w kierunku cząsteczek terapeutycznych kontrolujących ruchliwość limfocytów T w tkankach. Dostępność systemu hodowli pozwala na zastosowanie niektórych odczynników farmakologicznych i przetestowanie ich wpływu na migrację limfocytów T. Obecnie przyjmuje się, że w rosnących nowotworach limfocyty T CD8 wykazują niską migrację i zmniejszone kontakty z komórkami nowotworowymi11. Co ważne, niewielka obecność limfocytów T w regionach komórek nowotworowych wiąże się ze złym wynikiem i jest uważana za jeden z mechanizmów oporności na immunoterapię nowotworów opartą na komórkach T. Zidentyfikowano wiele przeszkód ograniczających migrację limfocytów T w nowotworach, w tym gęstą macierz zewnątrzkomórkową. W związku z tym identyfikacja cząsteczek zdolnych do przywrócenia ruchliwości limfocytów T i interakcji z komórkami nowotworowymi stanowi ważny krok w immunoterapii nowotworów. W poprzednim badaniu odkryliśmy, że częściowa degradacja kolagenu za pomocą kolagenazy, ostro zastosowana do wycinków ludzkich płuc, poprawia kontakt limfocytów T z komórkami nowotworowymi.
Wreszcie, możliwość trzymania ludzkich wycinków guza w hodowli przez okres do kilku dni 7,12,13 oferuje szereg obiecujących zastosowań w zakresie limfocytów T i immunoterapii. Jednak stabilność systemu modelowego podczas długotrwałej hodowli jest ważnym parametrem, który należy dokładnie ocenić.
Uzyskanie świeżej i zdrowej tkanki jest kluczowym czynnikiem do produkcji wysokiej jakości plastrów z dobrym barwieniem immunologicznym komórek CD8, komórek nowotworowych i elementów zrębu. Kluczowe znaczenie ma utrzymanie biopsji guza w temperaturze 4 °C przed przetworzeniem.
Obchodzenie się z plastrami za pomocą cienkich kleszczyków stanowi kolejny krytyczny krok w ramach tego protokołu. Należy to robić z dużą ostrożnością, ponieważ agaroza może zostać łatwo uszkodzona. Nacięcie agarozy naruszy uszczelnienie wykonane przez podkładkę ze stali nierdzewnej, powodując wyciek roztworów zawierających przeciwciała.

Limfocyty T CD8 odgrywają kluczową rolę w walce z rakiem. Jednak wiele mechanizmów supresyjnych zapobiega zabijaniu komórek nowotworowych przez limfocyty T. W ciągu ostatnich lat opracowano i zastosowano kilka obiecujących strategii, które uwalniają hamulce na limfocyty T, w klinice 5. Dwa podejścia, które cieszą się dużym zainteresowaniem, to przeciwciała ukierunkowane na immunologiczne punkty kontrolne, takie jak terapie anty-PD-1 i adoptywne terapie limfocytami T. Niemniej jednak, pomimo ostatnich sukcesów, tylko podgrupa pacjentów odnosi korzyści z tych terapii6. Dużym wyzwaniem jest zidentyfikowanie mechanizmów oporności na immunoterapię nowotworów w celu opracowania skuteczniejszych metod leczenia. Kolejnym wyzwaniem jest opracowanie modelowych systemów, w których można scharakteryzować i przetestować nowatorskie terapie pod kątem ich siły działania i bezpieczeństwa. Jak dotąd większość tych testów opiera się na systemach hodowli komórkowych in vitro, które słabo naśladują złożoność tkanki nowotworowej.
Ex vivo tissue slices to obiecująca technika, ponieważ zachowuje oryginalne mikrośrodowisko tkankowe7. Z biegiem lat opracowaliśmy to podejście, aby śledzić dynamikę limfocytów T w różnych tkankach. Nasze wyniki wskazują, że znakowane fluorescencyjnie limfocyty T dodane na wycinkach mysich węzłów chłonnych migrują do tkanki i reagują na odpowiednie sygnały mikrośrodowiskowe1,2. Podobnie, limfocyty T nałożone na wycinki ludzkiego guza płuc są szybko rekrutowane do zrębu guza3. Korzystając z tej techniki, zidentyfikowaliśmy macierz zewnątrzkomórkową jako ważny element w kontrolowaniu dystrybucji i migracji limfocytów T w ludzkich nowotworach3,4. Ponieważ zachowanie oczyszczonych i posianych limfocytów T ex vivo niekoniecznie odzwierciedla zachowanie rezydentnych wewnątrznowotworowych limfocytów T, niedawno udoskonaliliśmy to podejście4. 
Tutaj opisujemy protokół śledzenia rezydentnych limfocytów T w wycinkach wykonanych ze świeżych ludzkich guzów płuc. Poszczególne etapy polegają na przygotowaniu wycinków ludzkiego guza płuc (w tym osadzaniu agarozy i wibratomowaniu osadzonej tkanki), barwieniu endogennych limfocytów T przeciwciałami fluorescencyjnymi w świeżych wycinkach guza oraz monitorowaniu tych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.

<table><tbody><tr><td>Pionowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td>Zalecane jest użycie konfokalnego dysku wirującego Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>To oprogramowanie służy do wizualizacji obrazów i śledzenia migracji limfocytów T</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce precyzyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>14142</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Wkładki hodowlane</td><td>Pożywka Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI), Suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>61870010</td><td>Complete RPMI-pożywka jest wytwarzana przez dodanie 10% inaktywowanej termicznie surowicy cielęcej płodu i penicyliny/streptomycyny</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170088</td><td></td></tr><tr><td>Niska temperatura żelowania Agaroza, typ VII-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Nietoksyczny klej cyjanoakrylowy butylu, Vetbond</td><td>3M</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>Kotwy Slice, średnica 19,7, gwinty o rozstawie 2 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1415</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki ze stali nierdzewnej, 5 mm średnicy wewnętrznej</td><td>Amazon</td><td></td><td></td>B004K1FDGQ</tr><tr><td>BV605-sprzężony anty-CD8 (klon SK1)</td><td>BD Biosciences</td><td>565289</td><td></td></tr><tr><td>Anty-EpCAM sprzężony z FITC (klon HEA-125)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-113</td><td></td></tr><tr><td>BV510-sprzężony anty-CD90 (klon 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328125</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo obrazowanie rezydentnych limfocytów t cd8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 Limfocyty T są kluczowymi graczami w walce z rakiem. Aby limfocyty T CD8 mogły zabić komórki nowotworowe, muszą wejść do guza, migrować w mikrośrodowisku guza i odpowiednio reagować na antygeny nowotworowe. Niedawny rozwój ulepszonych metod obrazowania, takich jak mikroskopia 2-fotonowa, oraz wykorzystanie potężnych modeli nowotworów myszy rzuciły światło na niektóre mechanizmy regulujące aktywność przeciwnowotworowych limfocytów T. Chociaż takie systemy dostarczyły cennych informacji, nie zawsze przewidują reakcje ludzi. W przypadku ludzi nasza wiedza w tej dziedzinie pochodzi głównie z opisu utrwalonych próbek guza od pacjentów, a także z badań in vitro. Jednak modele in vitro nie mają złożonego trójwymiarowego środowiska nowotworowego, a zatem są niekompletnymi przybliżeniami aktywności limfocytów T in vivo. Świeże plastry wykonane z eksplantowanej tkanki reprezentują złożone wielokomórkowe środowisko nowotworowe, które może działać jako ważne ogniwo między badaniami współkulturowymi a modelami zwierzęcymi. Pierwotnie skonfigurowane w mysich węzłach chłonnych1 i wcześniej opisane w artykule JoVE2, podejście to zostało teraz przeniesione do ludzkich nowotworów w celu zbadania dynamiki zarówno plated3, jak i rezydentnych limfocytów T4.
Tutaj opisany jest protokół przygotowania wycinków ludzkiego guza płuc, barwienia immunologicznego rezydentnego CD8 T i komórek nowotworowych oraz śledzenia limfocytów T CD8 w mikrośrodowisku guza za pomocą mikroskopii konfokalnej. System ten jest wyjątkowo przydatny do badań przesiewowych pod kątem nowych środków immunoterapeutycznych sprzyjających migracji limfocytów T w nowotworach.

Guzy płuca u ludzi są zazwyczaj silnie nacieknięte przez limfocyty T CD8, które znajdują się preferencyjnie w zrębie3,4. Postępując zgodnie z tym protokołem, należy spodziewać się wizualizacji licznych immunobarwionych limfocytów T CD8 w skrawkach guzów płuca u ludzi. Współoznakowanie przeciwciałami anty-EpCAM i anty-CD90 powinno pozwolić na wyodrębnienie wysepek nowotworowych i obszarów zrębu. Kolagen włóknisty, obficie występujący w zrębie guza, można zwizualizować bez barwienia egzogennego, wykorzystując generację drugiej harmonicznej w mikroskopie dwufotonowym3,4. Należy zauważyć, że w niektórych guzach płuca u ludzi nie występuje wyraźne rozróżnienie między wysepkami nowotworowymi a zrębem. Takie guzy powinny zostać odrzucone, podobnie jak preparaty wykazujące rozległe obszary martwicy komórkowej, zidentyfikowane na podstawie nieswoistego wiązania przeciwciał i barwienia DAPI. Zgodnie z opublikowanymi wynikami uzyskanymi dla raka płuca i jajnika u ludzi, rezydentne limfocyty T CD8 są bardziej skoncentrowane w zrębie w porównaniu do wysepek nowotworowych4. Reprezentatywny przykład rozkładu limfocytów T CD8 w relacji do komórek nowotworowych i CD90 przedstawiono na Rysunku 2.
Analiza warstwowa umożliwia badanie ruchomości rezydentnych limfocytów T w różnych obszarach guza. Użyteczne kryteria porównawcze ruchomości limfocytów T CD8 w różnych regionach obejmują średnią prędkość (długość ścieżki podzielona przez czas próbkowania) oraz długość przemieszczenia (wektor między początkiem a końcem ścieżki). Mimo że w wysepkach nowotworowych występują one rzadko, limfocyty T CD8 migrują w tym przedziale bardziej aktywnie niż w zrębie (Rycina 3). Średnio prędkość poszczególnych limfocytów T CD8 w zrębie guza powinna wynosić około 4 µm/min, przy wysokiej zmienności wewnątrz- i międzyguzowej4. W zrębie guza na ruchomość rezydentnych limfocytów T silnie wpływa gęstość i orientacja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej3,4. Prawidłowo przeprowadzony eksperyment wykaże mniejszą liczbę limfocytów T w obszarach o gęstej macierzy w porównaniu do regionów o luźnej macierzy, co jest zgodne z opublikowanymi wynikami3,4.
Należy zauważyć, że niektóre guzy płuc człowieka wykazują bardzo wysoki poziom autofluorescencji, co uniemożliwia obrazowanie obecnych w nich limfocytów T. Taką cechę można szybko zaobserwować na początku sesji obrazowania. Guzy autofluorescencyjne powinny zostać odrzucone. Reprezentatywny przykład rezydentnych limfocytów T CD8 w guzie autofluorescencyjnym przedstawiono na Rycini 4.
<img alt="System perfuzji hodowli komórkowej z podłożem RPMI, pompą perystaltyczną i zestawem mikroskopowym do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zdjęcia systemu perfuzji. A) Roztwór RPMI bez czerwieni fenolowej jest nasycony 5% CO2, 95% O2. B) Następnie roztwór jest perfundowany za pomocą pompy perystaltycznej. C) Roztwór RPMI wpływa do naczynia hodowlanego przez wlot. Na wylocie roztwór jest odsysany przez pompę z komory do pojemnika na odpady. Należy zauważyć, że końcówka aspiracyjna jest ustawiona na poziomie pozwalającym określić wysokość roztworu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazująca ekspresję CD8, EpCAM i Thy1 w próbce tkanki, skala 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rozkład rezydentnych limfocytów T CD8 w ludzkim guzie płuca. Reprezentatywny obraz przekroju ludzkiego guza płuca barwionego na CD8 (zielony), EpCAM (niebieski) i CD90 (czerwony). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopii immunofluorescencyjnej, CD8, EpCAM, SHG, analiza komórek, rozkład intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Mobilność rezydentnych limfocytów T CD8 w ludzkim guzie płuca. Trajektorie pojedynczych rezydentnych limfocytów T CD8 w obszarach zrębowych (czerwony) i komórek nowotworowych (niebieski) w skrawku ludzkiego raka płuca. Skrawek zabarwiono wskazanymi przeciwciałami i obrazowano przez 20 min przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Kolagen włóknisty wykryto na koniec, stosując generowanie drugiej harmonicznej (SHG) w mikroskopie dwufotonowym. Ścieżki są zakodowane kolorystycznie zgodnie z długością przemieszczenia limfocytów T CD8. Obraz został zmodyfikowany na podstawie 4. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia wielokolorowa wykazująca CD8, EpCAM, SHG; immunofluorescencja tkankowa, oddziaływania komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywny obraz autofluorescencyjnego guza płuca człowieka. Przekrój guza został zabarwiony na CD8 (zielony) i EpCAM (niebieski). Sygnał SHG jest zaznaczony kolorem czerwonym. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie rezydentnych naciekających guz CD8 T komórek, znakowanych przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem, w przekrojach guza płuca człowieka przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii nowotworów, takie jak natura czynników pozytywnie i negatywnie regulujących migrację limfocytów T wewnątrz guzów u ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na monitorowanie codziennego zachowania rezydentnych CD8 T komórek w zachowanym środowisku guza ludzkiego.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy opracowywaliśmy sposób śledzenia limfocytów T w węzłach chłonnych Myrin poprzez ich przenoszenie na skrawki tkanek, zgodnie z protokołem pierwotnie opublikowanym w JoVE w 2011 roku. Aby rozpocząć, należy wsypać jeden gram agarozy o niskiej temperaturze topnienia do pojemnika, a następnie dodać 20 mililitrów sterylnego PBS pozbawionego wapnia i magnezu. Roztwór należy podgrzać w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia agarozy.Schładzaj ten 5% roztwór agarozy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez pięć minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza do każdego dołka płytki hodowlanej z sześcioma dołkami dodaj 1,1 ml kompletnej pożywki RPMI-1640. Następnie, używając sterylnej pęsety, umieść sterylny 30 mm insert do hodowli komórkowej w każdym dołku.Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 30 minut do późniejszego użycia. Następnie umieścić biopsjat guza w plastikowym naczyniu o średnicy 10 cm i za pomocą ostrego, sterylnego ostrza wyciąć z guza mały fragment w kształcie sześcianu o wymiarach około 5x5 mm. Teraz wyjąć przygotowany roztwór agarozy z inkubatora.Używając pary sterylnych pęset, ostrożnie przenieś fragmenty guza na chusteczkę do tkanek, aby odsączyć nadmiar pożywki, następnie wlej agarozę do 35 milimetrowej plastikowej szalki i umieść w niej fragmenty guza tak, aby znajdowały się one na dnie szalki. Pozostaw żel agarozowy na lodzie przez pięć minut w celu stwardnienia. Po stwardnieniu agarozy odwróć plastikową szalkę.Za pomocą szpatułki wyjmij cały żel. Ostrym ostrzem odetnij nadmiar agarozy otaczającej fragmenty guza, pozostawiając od trzech do pięciu milimetrów żelu wokół tkanki. Używając kropli nietoksycznego kleju do tkanek, przymocuj blok agarozy do tarczy do próbek w mikrotomie wibracyjnym.Napełnij tackę buforową wibratomu sterylnym, lodowatym PBS i umieść w niej dysk z próbką zawierający blok agarozy. Ustaw prędkość i częstotliwość wibratomu na pożądane wartości. Po przygotowaniu wibratomu wyjmij płytkę sześciodołkową z inkubatora.Następnie rozpocznij wycinanie zamontowanego bloku w plastry o grubości 350 micron za pomocą mikrotomu wibracyjnego. Używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie zbieraj wycinane plastry guza i układaj je płasko na wkładkach do hodowli komórkowych w płytce sześciodołkowej. Przenieś jeden plaster na każdą wkładkę.Następnie, używając precyzyjnej pęsety, umieść wysterylizowane i nawilżone stalowe podkładki na każdym skrawku. Upewnij się, że podkładki są odpowiednio rozmieszczone na agarozie otaczającej tkankę guza. Przed przystąpieniem do immunostainingu pozostaw płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w inkubatorze z 5% carbon dioxide i zwiększoną wilgotnością.Rozcieńczyć wymagane przeciwciała znakowane fluorescencyjnie oraz fluorescencyjny barwnik jądrowy DAPI do odpowiednich stężeń w pożywce RPMI bez czerwieni fenolowej. Następnie wyjąć płytkę hodowlaną z inkubatora i za pomocą cienkiej końcówki odessać ciecz znajdującą się wewnątrz stalowych podkładek. Teraz, nie dotykając skrawka, nanieść 40 µl rozcieńczonych przeciwciał na każdy skrawek guza.Aby umożliwić barwienie, inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez 15 minut. Po zakończeniu etapu barwienia usuń podkładki za pomocą precyzyjnej pęsety. Następnie delikatnie wyjmij plastry i zanurz je w medium RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej na 10 sekund.Umieść plastry z powrotem na wkładkach do hodowli komórkowej i dodaj kroplę medium RMPI-1640 bez czerwieni fenolowej na każdy plaster. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie przystąp do obrazowania. Na kilka godzin przed rozpoczęciem eksperymentu ustaw temperaturę komory grzewczej mikroskopu na 37 °C, a następnie przygotuj zestaw mikroskopowy do ciągłego przepływu natlenionego medium RMPI bez czerwieni fenolowej przez plastry nowotworu oraz do odsysania roztworu do kolby z odpadami za pomocą pompy perystaltycznej.Za pomocą precyzyjnej pęsety wyjmij zabarwiony plaster z płytki sześciodołkowej i przenieś go do 35 milimetrowej plastikowej szalki wypełnionej pożywką RMPI bez czerwieni fenolowej, a następnie umieść nad plastrem uchwyt do plastrów, aby go podeprzeć. Następnie umieść tę szalkę Petriego na stole obrazowym mikroskopu. Po podłączeniu końcówek wlotowych i wylotowych systemu perfuzji, włącz pompę perystaltyczną, aby umożliwić przepływ natlenionej pożywki przez rurki perfuzyjne.Obniż obiektyw imersyjny wodny do poziomu skrawka i ustaw ostrość na górnej powierzchni skrawka w świetle jasnego pola lub przy użyciu odpowiedniej długości fali. Następnie, stosując odpowiednie filtry, zidentyfikuj i wybierz obszar zainteresowania zawierający wszystkie komórki z fluorescencyjnymi znacznikami, a mianowicie limfocyty T CD8, wysepki nowotworowe oraz komórki zrębu CD90-dodatnie. Skonfiguruj sesję obrazowania, dobierając odpowiednią intensywność lasera i czasy ekspozycji dostosowane do jasności obserwowanych sygnałów fluorescencyjnych.Następnie ustaw grubość stosu Z (Z-stack), aby obrazować obszar wewnątrz przekroju guza. Dalej wybierz odstępy czasowe dla obrazowania stosu Z oraz całkowity czas rejestracji, aby uchwycić obrazy w określonych interwałach czasowych. Po wykonaniu i wyeksportowaniu obrazów fluorescencyjnych przeanalizuj migrację limfocytów T CD8 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przedstawiono tutaj reprezentatywny obraz barwionego skrawka guza płuca człowieka. Należy zwrócić uwagę na rozkład zielonych komórek T CD8+, niebieskich komórek nowotworowych wybarwionych na cząsteczkę adhezyjną komórek nabłonkowych oraz czerwonych komórek stromy CD90- lub Thyrum-dodatnich. W szczególności warto zauważyć, że komórki T CD8 są bardziej liczne w stromie w porównaniu z wyspami nowotworowymi.Przedstawiono tutaj trajektorie poszczególnych rezydentnych limfocytów T CD8 zabarwionych na zielono, a także czerwone obszary zrazikowe i niebieskie obszary komórek nowotworowych w plastrze guza płuca człowieka. Kolagen, wykryty za pomocą generacji drugiej harmonicznej i wyświetlony na czerwono, wyznacza przedział zrazikowy. Choć limfocyty T CD8 są mniej liczne niż wyspy nowotworowe, migrują one bardziej aktywnie w tym przedziale w porównaniu do zrazików.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje zazwyczaj od czterech do pięciu godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób przygotowania immunobarwienia próbek guzów, aby umożliwić monitorowanie rezydentnych limfocytów T CD8 przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

ex-vivo-imaging-resident-cd8-t-lymphocytes-human-lung-tumor-slices

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Poznaj metodę obrazowania rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia analizę migracji komórek w czasie rzeczywistym.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów