Name: Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli zarodkowych zawiązków nerek myszy do badania morfogenezy rozgałęziania pęcherzyków moczowych. Prosta technika umożliwia obserwację rozwoju nerek in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Leifowi Oxburghowi i Derekowi Adamsowi za hojne podzielenie się swoją wiedzą, Leifowi Oxburghowi za pomocne komentarze do manuskryptu, a także Stefanowi Wölflowi i Ulrike Müller za wsparcie techniczne oraz Saskii Schmitteckert, Julii Gobbert, Sascha Weyer i Violi Mayer za pomoc w laboratorium. Prace te były wspierane przez Development, The Company of Biologists (do CP).

Myszy były utrzymywane zgodnie ze szwedzkimi przepisami i prawodawstwem Unii Europejskiej (2010/63/UE). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Szwedzkiej Komisji Etyki (zezwolenia C79/9, C248/11 i C135/14). Procedury na Uniwersytecie w Heidelbergu z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Regierungspräsidium Karlsruhe i Inspektorów ds. Dobrostanu Zwierząt na Uniwersytecie w Heidelbergu.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów do hodowli
UWAGA : Użyj okapu z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
<ol>
	<li>W dniu sekcji, wstępnie zgrupowane ludzkie białko Fc samo lub rekombinowane chimeryczne białko efryny połączone z ludzkim Fc przez zmieszanie go z przeciwciałami kozi anty-ludzkimi Fc w stosunku molowym 1:5 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C5.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę, uzupełniając zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Modified Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) z 1% penicyliny/streptomycyny (v/v), 1% glutaminy (v/v), 1% insuliny-transferyny-selenu (v/v), 50 μg/ml ludzkiej holotransferyny i 1,5 μg/ml amfoterycyny. 
	UWAGA: 10 ml pożywki wystarcza na 16 zarodków.</li>
	<li>Dodać zgrupowany rekombinowany roztwór efryny o końcowym stężeniu 20 μg/ml do pożywki hodowlanej. Użyj klastrowanego ludzkiego Fc jako formantu.</li>
	<li>Przygotować płytki hodowlane, dodając 500 μl pożywki do każdego dołka sterylnej, niepowlekanej, 4-dołkowej płytki z płaskiego dnem polistyrenu.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków ostrożnie umieść jeden filtr membranowy z poliwęglanu o wielkości porów 5 μm na studzienkę na wierzchu podłoża. Przenieść przygotowaną płytkę do inkubatora (37 °C/5% CO2 ). Upewnij się, że filtr pozostaje suchy na górnej powierzchni i unosi się. 
	UWAGA: Jeden filtr wystarcza na dwa anlageny nerkowe.</li>
	<li>Za pomocą żyletki odetnij około 30 końcówek pipet (objętość: 100 μl) około 1 mm od końcówki, aby uzyskać szerszy otwór. Umieść końcówki z powrotem w stojaku na końcówki do pipet.</li>
</ol>
2. Analiza podstaw metanefrycznych w E11.5
<ol>
	<li>Uśmierc mysz w ciąży w czasie w E11.5 przez zwichnięcie szyjki macicy (lub przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalną komisję etyczną).</li>
	<li>Usuń macicę i zarodki, zgodnie z opisem Browna i wsp. 6. Od tego momentu pracuj pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich nr 5 przeciąć zarodek bezpośrednio pod przednimi kończynami. Użyj świeżej szalki Petriegodla każdego zarodka. Usuń nogi i ogon zarodka. Aby to zrobić, chwyć tkankę do usunięcia jedną parą kleszczy zegarmistrzowskich nr 5 i użyj końcówek drugiej pary do cięcia.</li>
	<li>Aby usunąć masę narządu brzusznego, użyj końcówek kleszczy, aby bocznie otworzyć ścianę ciała zarodka w kierunku rostralnym do ogonowego.
	<ol>
		<li>Przeciąć powierzchownie, równolegle do aorty grzbietowej. Do orientacji użyj wypełnionej krwią, a zatem widocznej aorty grzbietowej. Ostrożnie oddziel brzuszną część ściany ciała od części grzbietowej za pomocą końcówek zamkniętych kleszczy i odwróć zarodek. Przetnij ścianę ciała bocznie w kierunku rostralno-ogonowym i używając aorty grzbietowej do orientacji, tak jak po poprzedniej stronie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy brzuszna ściana ciała zostanie oddzielona od grzbietu, chwyć ją jedną parą kleszczy i ostrożnie pociągnij, aby ją usunąć wraz z masą narządu. 
	UWAGA: Anlagen śródnerczycy zwykle pozostaje przyczepiony do grzbietowej ściany ciała. Są to owalne struktury o długości ~ 200 μm znajdujące się na poziomie kończyn tylnych.</li>
	<li>Przytrzymaj grzbietową ścianę ciała jedną parą kleszczy, stroną brzuszną skierowaną do góry. Używając drugiej pary kleszczy, chwyć aortę grzbietową na jej końcu rostralnym i ostrożnie oderwij aortę grzbietową od ściany grzbietowej ciała. 
	UWAGA: Obie nerki śródnercze zwykle pozostają przyczepione do aorty grzbietowej.</li>
	<li>Za pomocą jednej pary kleszczy przyciąć rostralnie do nerki anlagen, aby usunąć aortę. Następnie ostrożnie oddziel dwa anlagen nerkowe za pomocą końcówek kleszczy.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij niechcianą tkankę z anlagenu nerkowego za pomocą końcówek kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić mezenchymy, ponieważ uszkodzenie może skutkować słabym wzrostem i wykluczeniem eksplantatu z dalszej analizy.</li>
	<li>Przenieść anlagen nerkowy oddzielnie za pomocą pipety mikrolitrowej i szeroko otwartej końcówki pipety w 10 μl PBS do poliwęglanowego filtra membranowego w płytce 4-dołkowej. 
	UWAGA: Ze względu na napięcie powierzchniowe eksplant zostanie pokryty cienką warstwą podłoża. Jeden filtr wystarcza na dwa anlageny nerkowe.
	<ol>
		<li>Umieść każdy z dwóch anlagenów nerkowych na środku każdej odpowiedniej połowy filtra. Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Pozostawić płytkę w inkubatorze do czasu, gdy zaczątki śródnercza z następnego zarodka będą gotowe do umieszczenia na filtrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.3-2.9.1 dla każdego zarodka. 
	UWAGA: Przy odrobinie wprawy procedura preparacji zajmie około 5 minut na zarodek.</li>
	<li>Inkubować anlagen nerkowy przez 3 dni w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynników do utrwalania i barwienia
<ol>
	<li>Aby przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS bez wapnia i magnezu (w/v), należy rozpuścić PFA w temperaturze 60 °C w PBS, ciągle mieszając. Schłodzić do temperatury pokojowej i użyć papierowego filtra, aby usunąć pozostałe cząstki. Porcjować i przechowywać w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia lub zamrozić w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny. Nosić środki ochrony osobistej określone w lokalnych normach bezpieczeństwa i pracować pod wyciągiem. Odpady należy wyrzucać zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i korzystać z wyznaczonych pojemników na odpady.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór przepuszczalny, należy rozcieńczyć Triton X-100 w PBS bez wapnia i magnezu do 0,3% (v/v).</li>
	<li>Aby przygotować roztwór blokujący, dodaj 5% (v/v) surowicy koziej i 0,1% Triton X-100 do PBS bez wapnia i magnezu. Dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (w/v). Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Z azydkiem sodu należy obchodzić się zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa i ochrony środowiska. 
	UWAGA: Używając przeciwciał do barwienia, użyj 5% surowicy z gatunku, z którego pochodzi przeciwciało drugorzędowe, aby uzyskać roztwór blokujący.</li>
	<li>Rozcieńczyć biotynylowaną aglutyninę Dolichorus biflorus w stosunku 1:200 w roztworze blokującym. Rozcieńczyć streptawidynę sprzężoną z Alexa488 w stosunku 1:200 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Aby przygotować gotowe do użycia podłoże do zatapiania (patrz tabela materiałów), dodać 0,1 g rozpuszczalnego w wodzie mukoadhezji na bazie alkoholu winylowego/ml do 25% (w/v) glicerolu w 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5). Ogrzewać do 50 °C w ciągłym mieszaniu przez 1 godzinę, schłodzić i dostosować pH do 8,0-8,5 za pomocą 1 M NaOH. Unikaj wyższych stężeń NaOH. Dodać 100 μg/ml N-propylallanu i tiomersalu do końcowego stężenia 0,02% (w/v). Mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Tiomersal jest toksyczny. Obchodzić się z nim zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa i ochrony środowiska.
	<ol>
		<li>Napełnić pożywkę do zatapiania w probówkach o pojemności 50 ml, zrównoważyć rotor i odwirować przy 3 200 x g i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zdekantować klarowny roztwór do probówek o pojemności 15 ml i wyrzucić osad. Porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Po rozmrożeniu roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozgrzać do temperatury ~30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tyle szkiełek szkiełkowych, ile mają być zamontowane filtry z eksplantatami. W tym celu przyklej dwa małe szkiełka nakrywkowe, 18 x 18 mm, po obu stronach szkiełka za pomocą kleju błyskawicznego, Pozostaw ~15 mm przestrzeni na filtr pomiędzy.</li>
</ol>
4. Utrwalanie i barwienie
<ol>
	<li>Po 3-dniowym okresie hodowli in vitro (div) wyjąć płytki z inkubatora i ostrożnie odessać pożywkę z każdej studzienki za pomocą mikropipety. Uważaj, aby nie dotykać filtra i trzymać końcówkę otwierającą się w kierunku ściany studni.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 4% PFA/PBS do każdej studzienki. Filtry będą unosić się na utrwalaczu. Za pomocą mikropipety ostrożnie dodaj kroplami utrwalacz PFA, aby zanurzyć filtry. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. 
	UWAGA: We wszystkich kolejnych krokach należy uważać, aby nie zmyć eksplantatów z filtra. Otwór końcówki pipety powinien być skierowany w stronę ściany studzienki.</li>
	<li>Usuń PFA i przepłucz dwukrotnie 500 μl PBS, zanurzając filtr. Dodać 500 μl roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie 500 μl PBS i dodać 500 μl roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zastąpić roztwór blokujący 250 μl biotynylowanej aglutyniny Dolichorus biflorus rozcieńczonej w stosunku 1:200 w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć roztwór aglutyniny Dolichorus biflorus i spłukać dwukrotnie 500 μl PBS na studzienkę.</li>
	<li>Dodać 250 μl streptawidyny sprzężonej z Alexa488 rozcieńczonej w stosunku 1:200 w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Alternatywnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny 
	UWAGA: Lepszy stosunek sygnału do szumu uzyskuje się podczas inkubacji w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie 500 μl PBS na studzienkę. Za pomocą kleszczy przenieś filtry na przygotowane szkiełka podstawowe, eksplantatami skierowanymi do góry. Zamontuj z ~50-100 μL medium do zatapiania. Okładka z szkiełkami nakrywkowymi nr 1,5 o długości 60 mm. Pozostawić roztwór pożywki do zastygnięcia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Przystąpić do obrazowania lub przechowywać szkiełka, owinięte w folię, w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do obrazowania.</li>
	<li>Obraz za pomocą szerokokątnego mikroskopu epifluorescencyjnego7 sprzężonego z lampą Hg i przy użyciu jednostki lustra do wzbudzenia niebieskiego (pasmo wzbudzenia wzbudzenia, 460 - 495 nm; zwierciadło dichromatyczne 505 nm; i pasmo emisyjne 510 - 550 nm) oraz soczewek planapochromatycznych 20x, apertura numeryczna 0,75.</li>
</ol>

<ol><li>Saxén, L. <a target="_blank" href="http://admin.cambridge.org/fk/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/organogenesis-kidney">Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series</a>. 19, Cambridge University Press. (1987).</li>
<li>Lindström, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+%CE%B2-catenin%2C+BMP%2C+PTEN%2C+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000(2015).</li>
<li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Eph%2FEphrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li>
<li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555(2011).</li>
<li>Olympus Support. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817">http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817</a> (2016).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401300207/abstract">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li>
<li>Saxén, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/38101">Primary Embryonic Induction</a>. , Academic Press. London. (1962).</li>
<li>Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Morphog%22%5BJournal%5D)">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li>
<li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li>
<li>Perälä, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+exp+Morph%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
<li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel%2C+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550(2010).</li>
<li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li>
<li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li>
<li>Saxén, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3328727">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li>
<li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li>
<li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W manuskrypcie opisano metodę izolowania rozwijającego się anlagenu metanefrycznego z zarodka myszy i hodowli zaczątków narządów. Metoda ta jest techniką standardową, opracowaną przez Grobsteina8 i Saxéna 9,10, a następnie została zaadaptowana i zmodyfikowana przez wielu innych11,12. Powodzenie metody zależy głównie od czasu trwania sekcji, ponieważ przeżywalność eksplantatów i pot...

Nerka ssaków wywodzi się z dwóch pierwotnych struktur o mezodermalnym pochodzeniu: kanalikowatego nabłonka moczowodu i mezenchymii metanefrycznych. Podczas nefrostenezy pączek moczowodu atakuje mezenchymę śródnerczą i rozgałęzia się, tworząc system zbiorczy. Mezenchyma śródnerczyca powoduje powstanie elementów nabłonkowych nefronów. Procesy te zachodzą w ściśle określonym czasie i przestrzennie skoordynowany sposób i są inicjowane przez wzajemne mechanizmy indukcyjne. Oba składniki tkanki komunikują się i wpływają na morfogenezę komórek drugiego. 
W latach 20. to Boyden przeprowadził in vivo niedrożność przewodu śródnerkowego u kurcząt, dostarczając pierwszej oznaki oddziaływań indukcyjnych, ponieważ oddzielona blastema nerkowa nie jest w stanie się rozróżnić1. Mniej więcej w tym samym czasie opublikowano pierwsze udane próby hodowli zaczątków nerki kurczaka w wiszącej kropli. Następnie opracowano hodowlę narządów w celu zbadania interakcji tkankowych w organogenezie ssaków. W latach pięćdziesiątych XX wieku Grobstein opracował technikę, w której podstawy metanefryczne można było hodować na filtrze. Technika ta została zmodyfikowana przez Saxéna, który umieścił filtr na ekranie typu Trowell w naczyniu hodowlanym1. Na przestrzeni lat pojawiło się wiele modyfikacji i zastosowań w hodowli organów. Opisana tutaj metoda opiera się na technice Saxéna, ale jest uproszczona, ponieważ filtry swobodnie unoszą się na pożywce, a średnica kultury tylko nieznacznie przekracza średnicę filtra, co ogranicza niepożądane ruchy filtra.
Hodowla całego narządu to klasyczne, tanie i proste, ale potężne narzędzie do badania procesów komórkowych i komunikacji międzykomórkowej podczas organogenezy. Posiew narządowy pozwala na leczenie czynnikami biologicznymi, takimi jak czynniki wzrostu, przeciwciała, oligonukleotydy antysensowne, wirusy i peptydy, a także związkami farmaceutycznymi i innymi chemikaliami. Funkcję genów można również badać przy użyciu eksplantatów pochodzących od genetycznie zmodyfikowanych myszy lub przy użyciu technologii indukowalnej inaktywacji genów, takiej jak system Cre-loxP. Pozwala to na badanie mutacji genetycznych, które powodują śmiertelność zarodka przed rozwojem nerki. Hodowla narządów może być również połączona ze znakowaniem fluorescencyjnym w celu śledzenia funkcji genów lub linii oraz nowoczesnymi technikami obrazowania, które umożliwiają monitorowanie zachowania komórek w czasie rzeczywistym2.
W konkretnym przykładzie tutaj podanym badano wpływ sygnalizacji receptora Eph aktywowanego przez EphrinB2 na morfologię rozgałęzień pączka moczowodu. Morfologia myszy z podwójnym nokautem EphA4/EphB2 sugerowała kilka poważnych wad w rozwoju nerek, które były wykrywalne już w 11 dniu embrionalnym (E11) i obejmowały pączek moczowodu, moczowód i wspólny przewód nerkowy3. Sygnalizacja za pośrednictwem receptorów Eph wymaga grupowania receptora liganda dimer4. Aby nadmiernie aktywować sygnalizację Eph, zalążki nerek z zarodków myszy E11.5 hodowano w obecności zgrupowanego rekombinowanego EphrinB2-Fc. EphrinB2 jest znanym ligandem receptora EphA4, który ulega ekspresji w wierzchołkach pączków moczowodu 3.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific 21331020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, wapń, magnez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>zastosowanie do sekcji</td></tr><tr><td>holo-transferyny ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Tiomersal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Galusan propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany Dolichorus Biflorus Wektor aglutyniny</td><td>Laboratoria</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 sprzężona Streptawidyna</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko chimery efryny-B2 Fc u myszy, CF</td><td>R& D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IgG1 Fc, CF</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG Fc</td><td>R& D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>zastosowanie do utrwalania i barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Dumont #5, końcówki biologie , INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>Potrzebne są 2 pary kleszczyków</td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki, proste, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe, proste, delikatne, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Filtr membranowy Isopore z powłoką Delta Thermo Fisher Scientific , poliwęglanowy, hydrofilowy, 5.0 i mikro; m, 13 mm, biały, gładki</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish 4 dołki, płaskie dno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe mikroskopu o grubości 24 x 50 mm. Nr 1.5H 0,17+/-0,005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Szkła nakrywkowe Nr 1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy ~76 x 26 x 1, 1/2-w. szlifowane zwykłe</td><td>Nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki VWR VWR</td><td></td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki</td> wirówkowe <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td> Wysokiej jakości bibuła filtracyjna <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman, klasa 113V, krepowana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Mirkoskop badawczy</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 myszy wsobne, samiec, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M Czarne</td><td></td></tr><tr><td>6 myszy wsobne, samica, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Greenough Leica</td><td>Leica S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Celem tego protokołu jest opisanie metody preparacji, izolacji i hodowli podstaw metanefrycznych myszy. 
Podczas rozwoju nerek u ssaków, dwie struktury progenitorowe, pączek moczowodu i mezenchyma metanefrycznego, komunikują się i wzajemnie indukują mechanizmy komórkowe, aby ostatecznie utworzyć system zbierania i nefrony nerki. Ponieważ zarodki ssaków rosną wewnątrzmacicznie i dlatego są niedostępne dla obserwatora, opracowano hodowlę narządów. Dzięki tej metodzie możliwe jest badanie oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych i zachowania komórkowego podczas organogenezy nerek. Ponadto można zbadać pochodzenie wrodzonych wad rozwojowych nerek i dróg moczowo-płciowych. Po dokładnym rozbiorzeniu zaczątki śródnercza przenosi się do filtra, który unosi się na pożywce hodowlanej i może być trzymany w inkubatorze do hodowli komórkowych przez kilka dni. Należy jednak mieć świadomość, że warunki te są sztuczne i mogą wpływać na metabolizm w tkance. Również przenikanie badanych substancji może być ograniczone ze względu na macierz zewnątrzkomórkową i błonę podstawną obecne w eksplantacie.
Jedną z głównych zalet hodowli organów jest to, że eksperymentator może uzyskać bezpośredni dostęp do organu. Technologia ta jest tania, prosta i pozwala na wiele modyfikacji, takich jak dodawanie substancji biologicznie czynnych, badanie wariantów genetycznych i stosowanie zaawansowanych technik obrazowania.

Zraziki nerki metanefrycznej pobrano od ciężarnych myszy inbredowych szczepu Black-6 w dniu E11.5 i poddano hodowli. Po 3 dniach pączek moczowodowy podzielił się do 5 razy, co doprowadziło do rozgałęzienia początkowo T-kształtnego pączka moczowodowego. Wykonano zdjęcia każdego eksplantu, a następnie policzono liczbę segmentów i punktów końcowych, aby określić generacje rozgałęzień oraz obliczyć liczbę punktów końcowych na pojedynczą gałązkę (Rysunek 1). ImageJ (rd</s...

Ten protokół opisuje metodę izolowania i hodowli podstaw metanefrycznych z embrionów myszy.

Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i hodowla zalążków metanefrycznych z embrionów myszy oraz obserwacja wpływu specyficznych zabiegów na morfologię rozgałęzień pączka moczowodowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące organogenezy nerek w zakresie kontroli morfogenezy rozgałęzień cewkowych, interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych oraz pochodzenia wad wrodzonych. Głównymi zaletami tej techniki są: umożliwienie bezpośredniego dostępu do organu, prostota, niski koszt oraz łatwość modyfikacji.Przed rozpoczęciem sekcji należy za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie umieścić jeden filtr membranowy z poliwęglanu o rozmiarze porów 5 µm w każdym dołku płytki czterodotykowej zawierającej 500 µl świeżej pożywki hodowlanej. Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnie za pomocą żyletki odciąć końcówki około 30 końcówek do mikropipety o pojemności 100 µl w odległości około 1 mm od wierzchołka, aby poszerzyć otwory końcówek, a następnie umieścić końcówki z powrotem w statywie.Po przygotowaniu końcówek, umieść embrion w 11,5 dniu rozwoju w PBS pod mikroskopem operacyjnym. Dla każdego embrionu używaj nowej szalki. Następnie za pomocą pęsety

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Opisano metodę umożliwiającą bezpośrednią manipulację farmakologiczną embrionów myszy podczas neurulacji z pominięciem metabolizmu matczynego. Technikę tę można dostosować do badania różnych aspektów neurulacji poprzez zmianę punktu czasowego oraz zastosowanego czynnika farmakologicznego.

Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

Surowica stosowana w hodowlach embrionów zawiera nieznane składniki, które mogą wpływać na wynik eksperymentów, szczególnie w badaniach dotyczących interakcji sygnałowych. Tutaj wykorzystaliśmy system hodowli natlenionej bez surowicy i wykazaliśmy, że zarodki myszy w połowie ciąży hodowane przez 16-40 godzin wykazują rozwój morfologiczny porównywalny z zarodkami rozwijającymi się w macicy.

Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje metodę hodowli i analizy wyrostków komórek kłębuszkowych nabłonków ciemieniowych zamkniętych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Metoda ta może być stosowana do badania szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego.

Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Poznaj metodę izolacji i hodowli zarodkowych zawiązków nerek myszy do badania morfogenezy rozgałęziania pęcherzyków moczowych. Prosta technika umożliwia obserwację rozwoju nerek in vitro.

Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

Przeglądaj więcej filmów