Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej
April 30th, 2017
Przedstawiamy protokół izolowania fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które reprezentują obiecujące jednostki unaczynienia. Można je szybko wyizolować, nie wymagają przetwarzania in vitro, a tym samym mogą być stosowane do jednoetapowej prewaskularyzacji w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie fragmentów mikronaczyniowych z mysiej tkanki tłuszczowej w celu wytworzenia jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu inżynierii tkankowej dotyczące unaczynienia in vivo substytutów tkankowych. Zaletą tej techniki jest to, że daje ona w pełni funkcjonalne segmenty mikronaczyniowe bez skomplikowanego przetwarzania in vitro, które można wysiewać na rusztowaniach i wszczepiać w ubytki tkanek.
Metoda ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak testy angiogenezy in vitro, aby rozwikłać mechanizmy molekularne leżące u podstaw powstawania i przebudowy sieci mikronaczyniowych. Zacznij od umieszczenia znieczulonego samca czarnej myszy sześciokątnej typu dzikiego C57 w pozycji leżącej pod chirurgicznym mikroskopem stereoskopowym i potwierdź brak reakcji na szczypanie palca. Unieruchom łapy taśmą i zdezynfekuj brzuch.
Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby oddzielić warstwę brzuszną od leżącej pod nią tkanki mięśniowej i wykonaj laparotomię w linii środkowej. Rozłóż bocznie płaty ściany brzucha i obustronnie zidentyfikuj jądra, najądrza i poduszeczki tłuszczowe najądrza. Następnie użyj małych nożyczek przygotowawczych i drobnych kleszczy, aby zebrać poduszeczki tłuszczowe, uważając, aby nie zebrać żadnej tkanki najądrza i umieść poduszeczki tłuszczowe na szalce Petriego zawierającej 15 ml DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W okapie z przepływem laminarnym umyj poduszeczki tłuszczowe na trzech oddzielnych szalkach Petriego zawierających 15 ml PBS i umieść umyty tłuszcz w pustej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml. Użyj skali probówkowej, aby określić objętość zebranego tłuszczu. Następnie za pomocą cienkich nożyczek mechanicznie rozdrobnić tkankę tłuszczową.
Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny tkankowej należy użyć pipety miarowej o pojemności 10 ml w celu przeniesienia tkanki mielonej z dwiema objętościami kolagenazy NB 4G do 50 ml kolby Erlenmeyera zawierającej mieszadło o średnicy 25 milimetrów. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 minut, energicznie mieszając. Następnie obserwuj 10 mcL strawionej tkanki pod mikroskopem.
Najtrudniejszym krokiem w tej procedurze izolacji jest określenie odpowiedniego czasu na zatrzymanie trawienia. Zbyt długie trawienie poduszeczek tłuszczowych spowoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej bez żadnych fragmentów mikronaczyniowych. Jeśli poferment zawiera wolne fragmenty mikronaczyniowe pochodzące z tkanki tłuszczowej obok pojedynczych komórek, należy zneutralizować enzym za pomocą dwóch objętości PBS uzupełnionych 20% FCS i przenieść zawiesinę naczyń komórkowych do nowych probówek polipropylenowych.
Inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby grawitacyjnie oddzielić fragmenty mikronaczyniowe od pozostałego tłuszczu. Następnie należy użyć pipety precyzyjnej o pojemności 1 ml, aby ostrożnie usunąć jeden ml głównego supernatentu tłuszczu, a następnie użyć pipety precyzyjnej o pojemności 100 ml w celu usunięcia reszty supernatentu, aż zawiesina wydaje się być wolna od tłuszczu. Po usunięciu całego tłuszczu należy użyć pipety miarowej o pojemności 10 ml, aby przefiltrować zawiesinę naczynia komórkowego przez sitko o średnicy 50 mikronów nad stożkową probówką o pojemności 50 ml i przenieść przefiltrowaną zawiesinę do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 14 ml dla każdego izolatu fragmentu mikrokrążenia.
Zebrać granulki fragmentu mikronaczyniowego przez odwirowanie i usunąć wszystkie z wyjątkiem ostatniego ml supernatentu z każdej probówki. Zawiesić osady w pozostałych supernatentach. Następnie przenieść każdą zawiesinę do pojedynczych stożkowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i ponownie zagnieździć fragmenty mikronaczyniowe w celu ponownego zawieszenia w odpowiedniej końcowej objętości PBS i 20% FCS do planowanej dalszej analizy.
Tutaj pokazano rozkład długości świeżo wyizolowanych fragmentów mikronaczyniowych od sześciu, siedmiu do dwunastu miesięcznych dzikich myszy czarnych C57, przy średniej obserwowanej długości około 42 mikrometrów. Jak pokazuje ten reprezentatywny rozmaz zawiesiny naczyń komórkowych, duże, średnie i małe fragmenty mikronaczyniowe, a także pojedyncze komórki obserwuje się, gdy tkanka tłuszczowa została wystarczająco strawiona. Większe powiększenie ujawnia, że fragmenty mikronaczyniowe wykazują dojrzałą morfologię mikronaczyń z hierarchicznymi segmentami mikronaczyń.
Charakterystyka fragmentów mikrokrążenia za pomocą cytometrii przepływowej wskazuje, że zawierają one CD31-dodatnie komórki śródbłonka, alfa akton-dodatnie komórki przynaczyniowe mięśni gładkich i CD117-dodatnie mezenchymalne komórki macierzyste, komórki eksprymujące marker. Po wstrzyknięciu na substytut skóry większe fragmenty mikrokrążenia są głównie zlokalizowane na powierzchni implantu, a w rdzeniach implantu wykrywane są niektóre segmenty naczyń włosowatych. Barwienie immunohistochemiczne wysianych fragmentów mikronaczyniowych ujawnia ponadto fizjologiczne konfiguracje mikronaczyń z fragmentami przypominającymi tętniczki, komory i naczynia włosowate.
Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować fragmenty mikronaczyniowe z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostki unaczyniające dla inżynierii tkankowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje izolację mikrofragmentów naczyń krwioonośnych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które służą jako efektywne jednostki unaczynienia. Metoda ta pozwala na szybkie izolację bez konieczności przetwarzania in vitro, co sprawia, że jest odpowiednia do jednoetapowego unaczynienia w zastosowaniach inżynierii tkankowej.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biologia mikrokrążenia
- Techniki unaczynienia
Tło
- Mikrofragmenty naczyń krwioonośnych są kluczowe dla zrozumienia unaczynienia tkankowego.
- Obecne metody często wymagają złożonego przetwarzania in vitro.
- To badanie koncentruje się na technice, która upraszcza proces izolację.
- Funkcjonalne segmenty mikrokrążenia są niezbędne dla efektywnej inżynierii tkankowej.
Cel badania
- Izolacja mikrofragmentów naczyń krwioonośnych z mysiej tkanki tłuszczowej.
- Generowanie jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej.
- Ułatwienie in vivo unaczynienia substytutów tkankowych.
Stosowane metody
- Izolacja mikrofragmentów naczyń krwioonośnych od myszy poddanych znieczuleniom.
- Zastosowanie stereomikroskopu chirurgicznego dla precyzji.
- Potwierdzenie znieczulenia poprzez brak reakcji na bodźce.
- Zastosowanie fragmentów w szkieletach do implantacji.
Główne wyniki
- Udana izolacja w pełni funkcjonalnych segmentów mikrokrążenia.
- Fragmenty mogą być wszczepiane na szkieletach do wad tkankowych.
- Metoda nadająca się do in vitro badań angiogeneszy.
- Wgląd w molekularne mechanizmy formowania się sieci mikrokrążenia.
Konkluzje
- Protokół zapewnia prostą metodę izolację mikrofragmentów naczyń krwioonośnych.
- Zwiększa potencjał efektywnego unaczynienia in vitro w inżynierii tkankowej.
- Ta technika może promować badania w dziedzinie biologii naczyń i inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microvascular fragments from adipose tissue addresses a critical bottleneck in tissue engineering: rapid, reliable vascularization of engineered constructs without prolonged in vitro maturation. This approach enables one-step prevascularization strategies that improve construct survival and integration post-implantation, directly supporting de-risking of vascular-dependent tissue therapies. The method provides a scalable, reproducible source of vascular units with inherent mesenchymal stem cell content, enhancing predictive confidence in preclinical vascularization outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular niche contributions to tissue regeneration and stromal cell interactions in engineered microenvironments.
- Operational Value: Provides a standardized, quantifiable vascular unit for functional validation of pro-angiogenic targets in discovery workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of reproducible in vitro angiogenesis assays using isolated microvascular fragments to evaluate compound effects on network formation and stability.
- Operational Value: Yields consistent microvascular morphology and length distribution (~42 µm mean) for assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates in vivo reassembly into hierarchical microvessel networks (arteriolar, venular, capillary-like) post-implantation, validating vascular functionality in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables rapid seeding onto scaffolds (e.g., bone, skin substitutes) for accelerated preclinical evaluation of vascularized tissue constructs.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated microvascular fragments function as a discovery-to-preclinical enabling technology, positioning early vascular validation before lead optimization and supporting go/no-go decisions based on vascularization potential in tissue-engineered systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on angiogenic and lymphangiogenic pathways using CD31+, α-SMA+, and CD117+ cell-containing fragments as a native vascular readout.
- Screening: Delivers standardized vascular units with quantifiable morphology for high-fidelity compound screening in angiogenesis and vasculogenesis assays.
- Analytics: Provides flow cytometry and immunohistochemical outputs (CD31, α-SMA, CD117) to quantify endothelial, perivascular, and mesenchymal stem cell contributions to vascular network formation.
- Translational Research: Supports continuity from fragment isolation to in vivo vascular network reformation, enabling preclinical assessment of construct integration and perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation protocol applicable across tissue types (bone, skin) and models, reducing redevelopment effort in vascularization workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascularization studies by providing native microvascular segments with intact perivascular and stem cell compartments.
- Operational Value: Enables isolation in under two hours with minimal equipment (surgical stereomicroscope, centrifuge, strainer), supporting standardization across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating vascularization capacity early, reducing late-stage failure due to poor construct integration.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vascularized tissue therapies by providing early, predictive vascularization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection and enzymatic digestion optimization to avoid over-processing into single-cell suspensions.
- Dependent on access to collagenase NB 4G, sterile culture incubators, and precision pipetting for fractionation and filtration steps.
- Necessitates standardized neutralization and washing protocols (PBS + 20% FCS) to isolate fat-free microvascular fragment pellets.
- Must account for donor age variability (6–12 months) in fragment yield and morphology when scaling across studies.
- Limited by the need for immediate use or short-term storage in PBS/FCS to maintain fragment integrity and vascular functionality.
