Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie fragmentów mikronaczyniowych z mysiej tkanki tłuszczowej w celu wytworzenia jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu inżynierii tkankowej dotyczące unaczynienia in vivo substytutów tkankowych. Zaletą tej techniki jest to, że daje ona w pełni funkcjonalne segmenty mikronaczyniowe bez skomplikowanego przetwarzania in vitro, które można wysiewać na rusztowaniach i wszczepiać w ubytki tkanek.

Metoda ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak testy angiogenezy in vitro, aby rozwikłać mechanizmy molekularne leżące u podstaw powstawania i przebudowy sieci mikronaczyniowych. Zacznij od umieszczenia znieczulonego samca czarnej myszy sześciokątnej typu dzikiego C57 w pozycji leżącej pod chirurgicznym mikroskopem stereoskopowym i potwierdź brak reakcji na szczypanie palca. Unieruchom łapy taśmą i zdezynfekuj brzuch.

Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby oddzielić warstwę brzuszną od leżącej pod nią tkanki mięśniowej i wykonaj laparotomię w linii środkowej. Rozłóż bocznie płaty ściany brzucha i obustronnie zidentyfikuj jądra, najądrza i poduszeczki tłuszczowe najądrza. Następnie użyj małych nożyczek przygotowawczych i drobnych kleszczy, aby zebrać poduszeczki tłuszczowe, uważając, aby nie zebrać żadnej tkanki najądrza i umieść poduszeczki tłuszczowe na szalce Petriego zawierającej 15 ml DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W okapie z przepływem laminarnym umyj poduszeczki tłuszczowe na trzech oddzielnych szalkach Petriego zawierających 15 ml PBS i umieść umyty tłuszcz w pustej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml. Użyj skali probówkowej, aby określić objętość zebranego tłuszczu. Następnie za pomocą cienkich nożyczek mechanicznie rozdrobnić tkankę tłuszczową.

Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny tkankowej należy użyć pipety miarowej o pojemności 10 ml w celu przeniesienia tkanki mielonej z dwiema objętościami kolagenazy NB 4G do 50 ml kolby Erlenmeyera zawierającej mieszadło o średnicy 25 milimetrów. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 minut, energicznie mieszając. Następnie obserwuj 10 mcL strawionej tkanki pod mikroskopem.

Najtrudniejszym krokiem w tej procedurze izolacji jest określenie odpowiedniego czasu na zatrzymanie trawienia. Zbyt długie trawienie poduszeczek tłuszczowych spowoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej bez żadnych fragmentów mikronaczyniowych. Jeśli poferment zawiera wolne fragmenty mikronaczyniowe pochodzące z tkanki tłuszczowej obok pojedynczych komórek, należy zneutralizować enzym za pomocą dwóch objętości PBS uzupełnionych 20% FCS i przenieść zawiesinę naczyń komórkowych do nowych probówek polipropylenowych.

Inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby grawitacyjnie oddzielić fragmenty mikronaczyniowe od pozostałego tłuszczu. Następnie należy użyć pipety precyzyjnej o pojemności 1 ml, aby ostrożnie usunąć jeden ml głównego supernatentu tłuszczu, a następnie użyć pipety precyzyjnej o pojemności 100 ml w celu usunięcia reszty supernatentu, aż zawiesina wydaje się być wolna od tłuszczu. Po usunięciu całego tłuszczu należy użyć pipety miarowej o pojemności 10 ml, aby przefiltrować zawiesinę naczynia komórkowego przez sitko o średnicy 50 mikronów nad stożkową probówką o pojemności 50 ml i przenieść przefiltrowaną zawiesinę do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 14 ml dla każdego izolatu fragmentu mikrokrążenia.

Zebrać granulki fragmentu mikronaczyniowego przez odwirowanie i usunąć wszystkie z wyjątkiem ostatniego ml supernatentu z każdej probówki. Zawiesić osady w pozostałych supernatentach. Następnie przenieść każdą zawiesinę do pojedynczych stożkowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i ponownie zagnieździć fragmenty mikronaczyniowe w celu ponownego zawieszenia w odpowiedniej końcowej objętości PBS i 20% FCS do planowanej dalszej analizy.

Tutaj pokazano rozkład długości świeżo wyizolowanych fragmentów mikronaczyniowych od sześciu, siedmiu do dwunastu miesięcznych dzikich myszy czarnych C57, przy średniej obserwowanej długości około 42 mikrometrów. Jak pokazuje ten reprezentatywny rozmaz zawiesiny naczyń komórkowych, duże, średnie i małe fragmenty mikronaczyniowe, a także pojedyncze komórki obserwuje się, gdy tkanka tłuszczowa została wystarczająco strawiona. Większe powiększenie ujawnia, że fragmenty mikronaczyniowe wykazują dojrzałą morfologię mikronaczyń z hierarchicznymi segmentami mikronaczyń.

Charakterystyka fragmentów mikrokrążenia za pomocą cytometrii przepływowej wskazuje, że zawierają one CD31-dodatnie komórki śródbłonka, alfa akton-dodatnie komórki przynaczyniowe mięśni gładkich i CD117-dodatnie mezenchymalne komórki macierzyste, komórki eksprymujące marker. Po wstrzyknięciu na substytut skóry większe fragmenty mikrokrążenia są głównie zlokalizowane na powierzchni implantu, a w rdzeniach implantu wykrywane są niektóre segmenty naczyń włosowatych. Barwienie immunohistochemiczne wysianych fragmentów mikronaczyniowych ujawnia ponadto fizjologiczne konfiguracje mikronaczyń z fragmentami przypominającymi tętniczki, komory i naczynia włosowate.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować fragmenty mikronaczyniowe z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostki unaczyniające dla inżynierii tkankowej.