Name: Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster przy użyciu analizy obrazu cyfrowego. Technika ta umożliwia nieinwazyjne pomiary rozprzestrzenienia i głębokości pigmentacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Science Foundation przyznaje IOS-1256565 i IOS-1557638 AWS. Dziękujemy Patricii Wittkopp i trzem anonimowym recenzentom za ich pomocne komentarze do wcześniejszej wersji tego artykułu.

1. Montaż próbki
UWAGA: Przechowuj martwe muchy w 70% etanolu w wodzie przed obrazowaniem.
<ol>
	<li>Wlać 10 ml 1,25% agaru rozpuszczonego we wrzącej wodzie na szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i pozostawić do zastygnięcia.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj pary cienkich kleszczyków, aby wykonać rowek o szerokości ~20 mm i głębokości 1 mm na powierzchni żelu. Za pomocą cienkich kleszczy osadź brzuszną stronę dorosłej muchy w rowku, tak aby grzbietowa strona muchy wystawała ponad żel. 
	UWAGA: Luźność żelu pozwala na łatwą zmianę położenia bez uszkodzenia próbki. Ten sam rowek może być używany do wielu próbek, chociaż z czasem stanie się brudny, pokruszony i bezużyteczny. Użytkownik może następnie wykonać kolejny rowek w tym samym żelu. Każda płytka może być użyta do zobrazowania ~200 much.</li>
	<li>Całkowicie pokryj próbkę 70% etanolem w wodzie, aby zmniejszyć wszelkie odbicia światła od woskowego naskórka i zapobiec uszkodzeniu skrzydeł podczas manipulacji próbką.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu
UWAGA: Obrazy są pozyskiwane za pomocą lunety sekcyjnej, bazy światła przechodzącego, aparatu cyfrowego i źródła zimnego światła na gęsiej szyi podłączonego do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do kontroli akwizycji obrazów. Instrukcje dotyczące oprogramowania są specyficzne dla Micro-Manager v1.4.2044, który jest oprogramowaniem typu open source, które zawiera ImageJ45.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop, aparat cyfrowy, podwójne źródło zimnego światła na gęsiej szyi i komputer.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazów, aby otworzyć okno Micro-Manager i okno ImageJ. W oknie ImageJ kliknij "Obraz" > "Typ" > "8-bitowy", aby ustawić wszystkie obrazy jako 8-bitowe. Kliknij "na żywo" w oknie Micro-Manager, aby otworzyć okno "Snap/Live" pokazujące podgląd w czasie rzeczywistym z kamery.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby zmaksymalizuj rozmiar okna "Snap/Live". Wybierz "Skala szarości" w rozwijanym menu "Tryb wyświetlania" w zakładce "Kontrast" w oknie Micro-Manager.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz zimne źródło światła do maksymalnej intensywności i umieść końcówki każdej gęsiej szyi w odległości około 120 mm od stage, jedna po lewej i jedna po prawej. 
	UWAGA: Użytkownicy mogą również korzystać z oświetlacza pierścieniowego, chociaż może to generować pierścień odbitego światła wokół brzucha muchy.</li>
	<li>Ręcznie ustaw powiększenie mikroskopu na 60X, tak aby pole widzenia obejmowało obszar o średnicy około 3 mm na stoliku.</li>
	<li>Umieść na stoliku mikrometr o średnicy 2 mm (w razie potrzeby zmieniając tło na białe). Patrząc na podgląd na żywo, skup się na mikrometrze stolika i dostosuj ekspozycję w oknie Micro-Manager, wprowadzając czas ekspozycji w ms w polu "Ekspozycja".</li>
	<li>Aby skalibrować przestrzennie kamerę, wybierz narzędzie "linia prosta" w oknie ImageJ i narysuj linię o długości mikrometru stolika. W oknie ImageJ kliknij "Analizuj" > "Ustaw skalę", aby otworzyć okno "Ustaw skalę", wprowadź długość mikrometru w μm w polu "Znana odległość" i wprowadź "μm" w polu "Jednostka długości".
	<ol>
		<li>Zobacz, że okno "Ustaw skalę" wyświetla skalę w "pikselach/μm". Zanotuj skalę i kliknij "OK".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oknie "Snap/Live" kliknij "Stop", a następnie "Snap", aby przechwycić obraz mikrometru stolika.</li>
	<li>Zapisz obraz jako 8-bitowy plik TIFF w skali szarości, aby w razie potrzeby zapewnić możliwość ponownej kalibracji przestrzennej obrazów. W oknie ImageJ kliknij "Plik" > "Zapisz jako" > "Tiff..." Określ miejsce zapisania pliku w przeglądarce plików, nazwij plik i kliknij "Zapisz".</li>
	<li>Zmień scenę na czarną i umieść na niej szalkę Petriego z muchą zamontowaną w agarze (kroki 1.1-1.2).</li>
	<li>Spójrz przez mikroskop i ustaw muchę tak, aby upewnić się, że grzbietowa linia środkowa jest prosta do góry, aby jak najlepiej zobaczyć wzór pigmentacji. Poruszaj skrzydłami i przydatkami, aby upewnić się, że widok brzucha jest niezakłócony. Jeśli pigmentowany naskórek (a2-a5) nie jest widoczny, ściśnij brzuch na boki, aż stanie się (chociaż brzuch much zmagazynowanych w 70% etanolu w wodzie rozciąga się, więc zwykle nie jest to konieczne). 
	UWAGA: Podczas ustawiania muchy użytkownik może być zmuszony do użycia mniejszego powiększenia (20X). Przed kontynuowaniem należy przywrócić powiększenie do 60X.</li>
	<li>Ręcznie skoncentruj się na grzbietowym odwłoku muchy. Ręcznie wyreguluj końcówki źródła światła, aby zminimalizować cienie i odbicia na grzbietowej części brzucha.</li>
	<li>Patrząc na podgląd na żywo na ekranie komputera i korzystając z histogramu wartości pikseli w zakładce "Kontrast" w oknie Micro-Manager, dostosuj ekspozycję zgodnie z opisem w kroku 2.4, aby zmaksymalizować zakres wartości pikseli obrazu podglądu.</li>
	<li>Usuń muchę i szalkę Petriego i zastąp je diodą LED (wyjście widmowe 430-660 nm) podłączoną do miernika napięcia, wyśrodkowaną w polu view w tej samej pozycji co mucha. Użyj diody LED i miernika napięcia jako światłomierza46 i zapisz napięcie generowane przez światło padające na diodę LED (~125 mV). 
	UWAGA: Dioda LED i miernik napięcia służą do zapewnienia, że poziomy światła są stałe podczas wielu sesji obrazowania w ramach jednego eksperymentu.</li>
	<li>Przez cały czas trwania eksperymentu nie należy dalej zmieniać położenia ani intensywności źródła światła, powiększenia mikroskopu ani ekspozycji aparatu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie próbek
<ol>
	<li>Umieścić szalkę Petriego z muchą zamontowaną w agarze (kroki 1.1-1.3) na czarnym stoliku mikroskopu. Dostosuj pozycję muchy tak, aby trzeci i czwarty segment brzucha były widoczne, a grzbietowa linia środkowa była wyprostowana do góry, jak opisano w kroku 2.9. Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że powiększenie wynosi 60x.</li>
	<li>Ręcznie ustaw ostrość mikroskopu tak, aby trzeci i czwarty grzbietowy tergit brzuszny były ostre. Użyj oprogramowania do przechwytywania obrazu, aby uzyskać obraz w formacie TIFF 8-bitowej skali szarości, zgodnie z opisem w kroku 2.6. 
	UWAGA: Obraz można uchwycić w kolorze, a następnie przekonwertować na skalę szarości w celu analizy.</li>
	<li>Zapisz obraz jako "SESH000_sampleID.tiff", zgodnie z opisem w kroku 2.7. 
	UWAGA: W tym przypadku [SESH] jest stały, [000] jest numerem sesji i jest zmienny, ale musi mieć długość trzech cyfr, a [sampleID] jest tym, czego życzy sobie użytkownik, chociaż nie może zawierać żadnych dodatkowych znaków podkreślenia (_) i musi mieć stałą długość. [sampleID] powinien zawierać szczegółowe informacje na temat czynników użytych w analizie danych dotyczących pigmentacji (np. temperatura lub pochodzenie), oddzielone charakterystycznym znakiem niealfabetycznym, takim jak łącznik (-). Dzięki temu czynniki te można łatwo przeanalizować z [sampleID] przy użyciu standardowego oprogramowania statystycznego.</li>
	<li>Usuń szalkę Petriego ze sceny i zastąp muchę następnym okazem. Powtarzaj kroki 3.1-3.3, aż wszystkie próbki zostaną zobrazowane, bez dalszej regulacji poziomów oświetlenia, powiększenia lub ekspozycji.</li>
</ol>
4. Obrazowanie w wielu sesjach
<ol>
	<li>Jeśli zdjęcia muszą być robione w wielu sesjach, utrzymuj intensywność światła, ekspozycję i powiększenie między sesjami. Na początku każdej sesji sprawdź kalibrację przestrzenną kamery (krok 2.4) i natężenie światła na scenie (mierzone przez miernik LED/voltage, krok 2.12).</li>
	<li>Uchwyć i zapisz obraz mikrometru stolika (kroki 2.5-2.7), aby w razie potrzeby zapewnić możliwość ponownej kalibracji przestrzennej obrazów.</li>
	<li>Użyj co najmniej 15 próbek kontrolnych i losowo zobrazuj je ponownie w każdej sesji, aby umożliwić wykrycie i wyeliminowanie efektów sesji. Upewnij się, że zduplikowane próbki kontrolne między sesjami mają ten sam [sampleID], ale inny [SESH000]. 
	UWAGA: Próbki kontrolne są muchami zebranymi, przechowywanymi i zamontowanymi identycznie jak próbki eksperymentalne, ale są ponownie obrazowane w trakcie sesji. Dokładna liczba próbek kontrolnych będzie zależeć od konfiguracji eksperymentalnej użytkownika. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
UWAGA: Analiza obrazu jest przeprowadzana w ImageJ45 i korzysta z makra "Measurement of Pigmentation.ijm", dostarczonego jako plik uzupełniający.
<ol>
	<li>Umieść wszystkie obrazy do analizy w tym samym folderze.</li>
	<li>Uruchom ImageJ i uruchom makro "Pomiar pigmentacji.ijm", klikając "Wtyczki" > "Makro" > "Uruchom", wybierając "Pomiar pigmentacji.ijm" w przeglądarce plików i klikając "otwórz". 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki znajdują się w makrze. Każdy krok jest indywidualnym poleceniem makra.</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe "Wymagane działanie" z informacją "Wybierz folder, w którym przechowywane są obrazy". Kliknij "OK" i użyj przeglądarki plików, aby wybrać folder zawierający obrazy, a następnie kliknij "wybierz".</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe "Wymagane działanie" z informacją "Wybierz folder, w którym chcesz przechowywać dane". Kliknij "OK" i użyj przeglądarki plików, aby wybrać żądany folder do zapisania profili pigmentacji. Kliknij "wybierz".</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z pytaniem "Ile znaków znajduje się w identyfikatorze próbki?" W polu wprowadzania danych wprowadź liczbę znaków w polu [SampleID], jak określono w kroku 3.3, a następnie kliknij "OK".</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z pytaniem "Jak szeroki jest Twój zwrot z inwestycji?" W polu wprowadzania danych wprowadź szerokość piksela paska przednio-tylnego, wzdłuż którego ma być odczytywany profil pigmentacji (zielony prostokąt, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A i 2A'). Kliknij "OK; " wartość domyślna to 20 pikseli. 
	UWAGA: Profil pigmentacji jest odczytywany w poprzek paska naskórka, a nie linii, aby zredukować szumy spowodowane włosami i włosiem. Szerokość tego paska będzie zależeć od rozdzielczości obrazu, ale powinna wynosić ~1/20 szerokości brzucha w pikselach.</li>
	<li>Zauważ, że makro otworzy obraz pierwszej muchy, a okno dialogowe zapyta, czy zmierzyć bieżący lot (kliknij "Tak"), przejść do następnego lotu (kliknij "Nie"), czy wyjść z makra (kliknij "Anuluj").</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z informacją "Zdefiniuj linię środkową grzbietowego brzucha, od PRZEDNIEGO do TYLNEGO". Narzędzie "linia prosta" będzie już wybrane. Narysuj linię od przodu do tyłu, aby nakreślić linię środkową grzbietowej części brzucha. Kliknij "OK; " patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A i 2A', żółta linia. 
	UWAGA: Służy do zmiany orientacji obrazu tak, aby grzbietowa linia środkowa leżała poziomo w poprzek ekranu, a przednia po lewej stronie, co ułatwia wykonywanie kolejnych kroków.</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z informacją "Zdefiniuj TYLNĄ krawędź Tergite 4 tuż za pasmem pigmentu". Narzędzie "linia prosta" będzie już wybrane. Narysuj linię od tylnej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej, tak aby środek linii (oznaczonej białym kwadratem) znajdował się tuż z tyłu do tylnej krawędzi pasma pigmentowego (naskórek a5). Kliknij "OK; ". Zobacz Rysunek 2A i 2A′, magenta line. 
	UWAGA: Skrypt R automatycznie wykryje tylną krawędź pasma pigmentu na podstawie profilu pigmentacji.</li>
	<li>Zwróć uwagę, że otworzy się okno dialogowe z informacją "Zdefiniuj ANTERIOR EDGE Tergite 4 na przedniej krawędzi pigmentowanego naskórka (a2)". Narzędzie "linia prosta" będzie już wybrane. Narysuj linię od przedniej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej, tak aby środek linii (oznaczonej białym kwadratem) znajdował się na przedniej krawędzi pigmentowanego naskórka (naskórek a2). Kliknij "OK; ". Zobacz Rysunek 2A i 2A', cyjan line. 
	UWAGA: Skrypt R zdefiniuje ten punkt jako przednią krawędź pigmentowanego naskórka tergitu. Na obrazie makro pokaże obszar zainteresowania (ROI), wzdłuż którego odczytywany jest profil pigmentacji (zielony prostokąt, <silna klasa="xfig">Rysunek 2A i 2A′, powiększony w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B i 2B′). Makro otworzy również drugie okno pokazujące profil pigmentacji dla ROI (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C i 2C′), gdzie oś x to pozycja wyrażona jako liczba pikseli od tylnej krawędzi profilu, a oś y to średnia wartość piksela w każdej pozycji.</li>
	<li>Wyświetl wykresy profilu pigmentacji, które zostaną otwarte przez makro. W razie potrzeby kliknij "Na żywo" w oknie profilu, aby dostosować położenie ROI tak, aby nie zawierało żadnych struktur (np. włosia), które miałyby wpływ na profil pigmentacji. Gdy profil będzie zadowalający, kliknij "OK".</li>
	<li>Powtórz kroki 5.8-5.11 dla Tergite 3. 
	UWAGA: Następnie makro eksportuje profile pigmentacji jako dwa pliki CSV, z których każdy nosi nazwę "SESH000_samplename_TX_profile.csv", gdzie [SESH000_samplename] to nazwa obrazu, a [TX] to T3 lub T4 odpowiednio dla trzeciego i czwartego tergitu.</li>
	<li>Zwróć uwagę, że makro otwiera następny obraz. Powtarzaj kroki 5.7-5.13, aż wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane.</li>
</ol>
6. Wstępne przetwarzanie, analiza i korekta sesji danych
UWAGA: Wszystkie analizy danych są przeprowadzane w R47 i korzystają z dostarczonego skryptu "Analysis of Pigmentation.R". Poniżej "L..." wskazuje, które wiersze skryptu mają być uruchamiane dla każdej części analizy. Zapoznaj się z informacjami uzupełniającymi, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat sposobu przeprowadzania analizy.
<ol>
	<li>Edytuj skrypt języka R, aby ustawić katalog roboczy (L6) i zdefiniować ścieżkę pliku do folderu zawierającego profile the.csv (L11).</li>
	<li>Uruchom L13-15, aby wygenerować listę profili pigmentacji przechowywanych w folderze profili.</li>
	<li>Załaduj i uruchom funkcje "reader" i "addPrimaryKey" (L17-41), aby odczytać profile do jednej ramki danych.</li>
	<li>Edytuj skrypt w L43, aby określić kalibrację przestrzenną obrazów w μm/pikselach, jak określono w kroku 2.5.</li>
	<li>Załaduj i uruchom funkcję "regulacje" (L46-58), aby przekonwertować pozycję profilu (oś x, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C i 2C′) z pikseli z-tylnej-krawędzi-ROI na μm od-przedniej-krawędzi ROI i wartość profilu (oś y, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2C i 2C′) z wartości piksela (0 =, 255 = biały) na wartość pigmentacji (0 = brak pigmentu, 255 = maksymalna ilość pigmentu).</li>
	<li>Załaduj i uruchom funkcję "spline.der.er" (L60-71), aby wygenerować sześcienny splajn profili pigmentacji oraz jego pierwszej i drugiej pochodnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D-2F i 2D′-2F′).</li>
	<li>Załaduj i uruchom funkcje "coord" i "assmbly.coord" (L74-163), najpierw, aby wyodrębnić pozycję tylnej (T3) i przedniej (T2) krawędzi pasma pigmentu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D i 2D′) oraz tylną krawędź naskórka a2 (T1, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D i 2D′), a następnie wyodrębnij maksimum (Pmax) i minimum (Pmin) wartości pigmentacji, przyjęte odpowiednio dla T3 i T1. 
	UWAGA: Przednia krawędź naskórka a2 została już zdefiniowana w kroku 5.9.</li>
	<li>Opcjonalnie: Załaduj i uruchom funkcję "chek" (L165-175), aby sprawdzić, czy funkcja "koordynacja" prawidłowo identyfikuje pozycje T1-3 dla losowo wybranego profilu pigmentacji.</li>
	<li>Załaduj i uruchom funkcje indeksu i metryk (L178-193), aby wygenerować tabelę danych z nagłówkami "Sesja", "Próbka", "Tergite", "id" (konkatenacja Sample i Tergite), "Pmax", "Pmin", "Wband" (szerokość pasma pigmentu, = T3 - T2) i "Wtergite" (szerokość pigmentowanych skórek a2-a5, = T3).</li>
	<li>Załaduj i uruchom funkcję "korekcji" (L196-234), aby wygenerować tabelę danych, która koryguje Pmax i Pmin o wszelkie uciążliwe czynniki powstające w wyniku efektów sesji. Użyj średniego wzrostu (lub spadku) P, max lub Pmin z próbek kontrolnych ponownie zobrazowanych w czasowo sąsiadujących sesjach.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metodologia ta pozwala na precyzyjne, szybkie i powtarzalne pozyskiwanie danych dotyczących pigmentacji w formie ilościowej odpowiedniej do wielu dalszych analiz. Metodę wykorzystano do pozyskania danych na temat wpływu temperatury na pigmentację jamy brzusznej w izogenicznej linii much. Jednak metodologia ta może być wykorzystana w badaniach genetyki przyszłościowej w celu identyfikacji genów, które leżą u podstaw różnic pigmentacyjnych między osobnikami, populacjami lub gatunkami, lub w badaniach genetyki odwrotnej w c...

Pigmentacja pokazuje ogromne zróżnicowanie fenotypowe między gatunkami, populacjami i osobnikami, a nawet wewnątrz osobników podczas ontogenezy1,2,3,4,5,6. Chociaż istnieje niezliczona ilość badań nad pigmentacją u wielu różnych zwierząt, pigmentacja została prawdopodobnie najlepiej zbadana u Drosophila melanogaster, gdzie wykorzystano pełną moc genetyki molekularnej do wyjaśnienia rozwojowych i fizjologicznych mechanizmów regulujących pigmentację oraz ewolucji tych mechanizmów1,6. Wiele wiadomo o genach regulujących biochemiczną syntezę pigmentów u D. melanogaster7,8 oraz genach kontrolujących czasowy i przestrzenny rozkład tej biosyntezy9,10,11,12,13. Co więcej, mapowanie genetyczne zidentyfikowało loci genetyczne leżące u podstaw wewnątrz- i międzygatunkowych różnic w pigmentacji u D. melanogaster14,15,16,17. Zbadano również związki między pigmentacją a cechami plejotropowymi, takimi jak zachowanie18,19 i immunity19,20, podobnie jak adaptacyjne znaczenie wzorców pigmentacji15,21,22. W związku z tym pigmentacja u D. melanogaster stała się potężnym, ale prostym modelem rozwoju i ewolucji złożonych fenotypów.
Pigmentacja u dorosłego D. melanogaster charakteryzuje się wyraźnymi wzorcami melanizacji na całym ciele, szczególnie na skrzydłach i grzbietowej klatce piersiowej oraz brzuchu. Najwięcej uwagi badań poświęcono jednak pigmentacji każdej płytki naskórka (tergitu) na grzbietowej części brzucha. Istnieje znaczna zmienność w tej pigmentacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-F), zarówno ze względu na czynniki genetyczne17,23, jak i environmental24,25. Naskórek tergitu brzusznego składa się z przednich i tylnych przedziałów rozwojowych (<silna klasa="xfig">Ryc. 1G), z których każdy można dalej podzielić w zależności od pigmentacji i ornamentacji26. Przedział przedni obejmuje sześć typów naskórka (a1-a6), a przedział tylny zawiera trzy (p1-p3) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G). Spośród nich naskórek p1, p2 i a1 jest zwykle zawinięty pod tergitem w nierozciągnięte brzuchy, tak aby były ukryte. Niezawodnie widoczny naskórek charakteryzuje się pasmem ciężkiej pigmentacji, tutaj określanym jako "pasmo pigmentowe", składającym się z typów naskórka a4 (owłosione z umiarkowanym włosiem) i a5 (owłosione z dużym włosiem), przy czym tylna krawędź pasma jest intensywniej pigmentowana niż przednia krawędź (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1G). Przed tym pasmem znajduje się obszar lekko pigmentowanej, owłosionej naskórka, która ma włosie z tyłu (a3), ale nie z przodu (a2). Różnice w pigmentacji między muszkami obserwuje się zarówno w intensywności pigmentacji, jak i w szerokości pasma pigmentowego. Ogólnie rzecz biorąc, zmienność jest największa w najbardziej tylnych segmentach (segmenty brzuszne 5, 6 i 7), a mniejsza w bardziej przednich segmentach (segmenty brzuszne 3 i 4)24. Co więcej, występuje dymorfizm płciowy w pigmentacji D. melanogaster, przy czym samce na ogół mają całkowicie pigmentowane piąte i szóste tergity brzuszne (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 4C).
W większości badań nad pigmentacją jamy brzusznej u D. melanogaster, pigmentacja była traktowana jako cecha kategoryczna lub porządkowa, a wzór mierzony jakościowo27,28,29 lub częściowo ilościowo na skali14,15,16,17,24,30,31,32,33,34,35,36,37. Metody te nieuchronnie cierpią z powodu braku precyzji, a ponieważ opierają się na subiektywnej ocenie pigmentacji, trudno jest porównać dane z różnych badań. Kilku autorów określiło ilościowo wymiary przestrzenne pigmentacji38,39, intensywność pigmentacji określonego typu naskórka23,25,39,40, czyli średnia intensywność pigmentacji na całym tergicie brzusznym41,42,43. Niemniej jednak te metody kwantyfikacji nie mierzą jednocześnie zarówno intensywności, jak i rozkładu przestrzennego pigmentacji brzucha, a zatem nie wychwytują niuansów zmian pigmentacji w tergicie brzusznym. Co więcej, kilka z tych metod kwantyfikacji38,41,42,43 wymaga sekcji i zamontowania naskórka brzusznego. Jest to zarówno czasochłonne, jak i niszczy próbkę, uniemożliwiając jej przeprowadzenie dodatkowych analiz morfologicznych. Wraz z pogłębianiem się wiedzy na temat rozwoju i ewolucji pigmentacji jamy brzusznej potrzebne będą bardziej wyrafinowane narzędzia do szybkiego i precyzyjnego pomiaru zarówno rozkładu przestrzennego, jak i intensywności pigmentacji.
Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie cyfrowej analizy obrazu do uzyskania powtarzalnego i bardziej precyzyjnego pomiaru pigmentacji brzucha u D. melanogaster. Metodologia składa się z trzech etapów. Najpierw dorosła mucha jest nieniszcząco dosiadana i wykonywane jest cyfrowe zdjęcie grzbietowego brzucha. Po drugie, za pomocą makra ImageJ, użytkownik definiuje przednio-tylny pasek pikseli, który rozciąga się od przedniej części naskórka a2 do tylnej części naskórka a5 (zielona ramka, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G) zarówno na trzecim, jak i czwartym segmencie brzucha. Średnia wartość piksela na całej szerokości tego paska jest następnie wyodrębniana wzdłuż jego długiej osi, generując profil, który oddaje rozkład przestrzenny i intensywność pigmentacji podczas zmiany z przedniej na tylną część tergitu. Po trzecie, skrypt R służy do matematycznego opisu profilu pigmentacji za pomocą sześciennego splajnu. Skrypt R następnie wykorzystuje splajn oraz jego pierwszą i drugą pochodną do wyodrębnienia szerokości naskórka a2-a5, szerokości pasma pigmentu oraz maksymalnego i minimalnego poziomu pigmentacji. W związku z tym metoda określa ilościowo zarówno charakterystykę przestrzenną, jak i głębokość pigmentacji jamy brzusznej.
Ta metodologia określa ilościowo pigmentację trzeciego i czwartego tergitu brzusznego, które były przedmiotem wielu poprzednich badań1,15,23,24,25,28,33,39,42, wyłącznie lub w połączeniu z bardziej tylnymi tergitami. Chociaż mniej zmienne niż piąty i szósty tergit brzuszny, trzeci i czwarty tergit nie są całkowicie pigmentowane u samców, więc protokół ten można zastosować zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. Niemniej jednak, jak pokazano tutaj, protokół może być stosowany do pomiaru pigmentacji w piątym i szóstym tergicie brzusznym u samic. Ponadto niewielkie modyfikacje skryptów stosowanych do wyodrębnienia cech profilu pigmentacji powinny pozwolić na zastosowanie metody do ilościowego określenia zmienności pigmentacji w wielu różnych innych organizmach.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Szczypce biologiczne</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Gęsia szyja Źródło zimnego światła</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Obraz Oprogramowanie do kontroli akwizycji</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Multimetr Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fluke Fluke</td><td>75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm x 15 mm</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr stopniowy</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>Zobacz materiał KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentacja jest morfologicznie prostą, ale bardzo zmienną cechą, która często ma znaczenie adaptacyjne. Służył on szeroko jako model do zrozumienia rozwoju i ewolucji fenotypów morfologicznych. Pigmentacja jamy brzusznej u Drosophila melanogaster okazała się szczególnie przydatna, umożliwiając naukowcom zidentyfikowanie loci, które leżą u podstaw między- i wewnątrzgatunkowych różnic w morfologii. Do tej pory jednak pigmentacja jamy brzusznej D. melanogaster była w dużej mierze badana jakościowo, poprzez punktację, a nie ilościowo, co ogranicza formy analizy statystycznej, które można zastosować do danych dotyczących pigmentacji. W pracy opisano nową metodologię, która pozwala na ilościowe określenie różnych aspektów wzorca pigmentacji jamy brzusznej dorosłego osobnika D. melanogaster. Protokół obejmuje montowanie próbek, przechwytywanie obrazów, ekstrakcję i analizę danych. Całe oprogramowanie używane do przechwytywania i analizy obrazów zawiera makra napisane do analizy obrazów typu open source. Zaletą tego podejścia jest możliwość precyzyjnego pomiaru cech pigmentacji przy użyciu metodologii, która jest wysoce odtwarzalna w różnych systemach obrazowania. Chociaż technika ta została wykorzystana do pomiaru zmienności wzorów pigmentacji tergalu u dorosłych osobników D. melanogaster, metodologia ta jest elastyczna i ma szerokie zastosowanie do wzorów pigmentacji u niezliczonych różnych organizmów.

Protokół ten został wykorzystany do zbadania wpływu temperatury hodowli na pigmentację odwłoka. Wcześniejsze badania wykazały, że wzrost temperatury rozwojowej prowadzi do zmniejszenia zasięgu pigmentacji odwłoka u kilku gatunków Drosophila, w tym u D. melanogaster30,32. W szczególności, w trzecim i czwartym tergicie odwłoka, stopień pigmentacji (szerokość pasma pigmentowego) maleje w zakresie od 17 °C do 25 °C i...

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Ogólnym celem tej metodologii jest szybka kwantyfikacja pigmentacji odwłoka u muszki owocówki Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii ewolucyjnej, takie jak identyfikacja loci genowych leżących u podstaw specyficznych dla danej grupy różnic w morfologii oraz zrozumienie rozwoju i ewolucji fenotypów morfologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona użytkownikom na nieniszczący pomiar różnych aspektów pigmentacji odwłoka, w tym zasięgu i intensywności pigmentacji.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat pigmentacji odwłoka Drosophila melanogaster, może zostać ona również zastosowana do innych gatunków Drosophila oraz łatwo zaadaptowana do pomiaru wzorów pigmentacji u innych owadów i taksonów zwierząt. Przed obrazowaniem muchy można przechowywać w 70% ethanol, aby zachować ich pigmentację. Do wizualizacji wymagany jest podkład do montażu.Do szalki Petri o średnicy 60 mm wlej około 10 ml 1,25% agaru w wodzie. Pod mikroskopem, używając precyzyjnej pęsety, wykonaj w żelu rów o długości 20 mm, szerokości 2 mm i głębokości 1 mm. W jednej szalce można wykonać kilka takich rowów.Następnie osadź muchy w rowku w taki sposób, aby powierzchnia przeznaczona do analizy znajdowała się tuż nad powierzchnią żelu. W tym przypadku interesuje nas strona grzbietowa. Teraz wypełnij szalkę 70% etanolem, aż muchy zostaną całkowicie zanurzone.Zmniejsza to odblaski od kutykuli, które mogą przesłaniać wzór pigmentacji. Teraz należy uruchomić oprogramowanie do obrazowania oraz aparat cyfrowy podłączony do mikroskopu. Jako źródło światła wystarczy zimne światło z urządzenia z podwójnym ramieniem gęsim.W oprogramowaniu do analizy obrazu ustaw typ obrazu na 8-bitowy. Następnie w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu przełącz ustawienie Live, aby otworzyć okno podglądu z kamery. Ustaw typ obrazu na skalę szarości.Następnie ustaw źródło światła na maksymalną intensywność i umieść oświetlenie w odległości około 120 milimetrów od stolika. Ustaw mikroskop na powiększenie 60x, tak aby szerokość pola widzenia wynosiła trzy milimetry. Następnie umieść dwumilimetrowy mikrometr przedmiotu w polu widzenia i ustaw ostrość.Powracając do oprogramowania, dostosuj czas ekspozycji w polu w sekcji ekspozycji, aby widzieć mikrometr. Następnie ustaw skalę. Otwórz narzędzie linii prostej i narysuj odcinek o długości dwóch milimetrów wzdłuż mikrometru przedmiotowego.Następnie wpisz tę długość w opcji Set Scale. W oknie powinna wyświetlić się skala w pikselach na mikron. Zanotuj wartość skali i zatwierdź ustawienia przyciskiem OK.Teraz powróć do oprogramowania do przechwytywania obrazów i użyj poleceń Stop oraz Snap, aby zarejestrować obraz mikrometru przedmiotowego. Następnie przejdź do oprogramowania do analizy obrazu i zapisz obraz jako plik Tiff. Teraz ustaw ostrość na linię pośrodkową grzbietową zamontowanej muchy.Linia środkowa powinna być ustawiona pionowo, aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania. Odsuń skrzydła oraz wszelkie inne wystające struktury i dostosuj oświetlenie tak, aby najlepiej doświetlić kutykulę. Następnie ustaw czas ekspozycji w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu, korzystając z histogramu wartości pikseli jako wskazówki, aby zarejestrować pełny zakres pikseli obrazu bez nasycenia, maksymalizując tym samym kontrast.Zachowaj taką samą ekspozycję i oświetlenie przez cały czas trwania eksperymentu. Przed wykonaniem zdjęcia upewnij się, że interesujące segmenty odwłoka znajdują się w polu widzenia. Następnie wykonaj zdjęcie i zapisz je, podając w nazwie pliku numer identyfikacyjny próbki.Należy zastosować format opisany w protokole pisemnym. Analiza ta wykorzystuje makro dostarczone przez autorów. Serie obrazów do analizy powinny znajdować się w tym samym folderze z plikami.Teraz uruchom makro i postępuj zgodnie z wyświetlanymi poleceniami. Najpierw wskaż lokalizację zapisanych plików. Następnie określ folder, w którym mają zostać zapisane dane z analizy.Następnie wprowadź liczbę znaków użytych w nazwach plików, aby oprogramowanie poprawnie odczytało serię obrazów. Kolejny komunikat dotyczy szerokości obszaru zainteresowania. Tutaj wprowadź liczbę pikseli wzdłuż pasa przednio-tylnego, który ma zostać poddany analizie.Teraz, w odpowiedzi na monit, wybierz analizę pierwszego obrazu z serii. Pozostałe opcje to analiza następnego obrazu w serii lub wyjście z analizy. Narzędzie linii zostaje wybrane automatycznie.Użyj go do zidentyfikowania linii środkowej na obrazie, rysując wzdłuż niej linię w kierunku od przedniego do tylnego. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami makro, aby zidentyfikować tylną krawędź Tergite4 za pomocą narzędzia linii. Narzędzie linii służy do narysowania linii od tylnej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej w taki sposób, aby środek linii znajdował się tuż za tylną krawędzią pasma pigmentowego.Następnie zdefiniuj przednią krawędź Tergite4 za pomocą narzędzia linii. Narysuj linię od przedniej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej. Środek linii, zaznaczony białym kwadratem, powinien znajdować się na przedniej krawędzi lekko pigmentowanej kutykuli.Na podstawie tych informacji makro generuje teraz profil pigmentacji. Profil ten może być jednak niedokładny, jeśli włoski lub inne skazy przecinają pas, wzdłuż którego pomiar profilu jest wykonywany. Aby to skorygować, wybierz opcję Live preview w oknie histogramu i dostosuj linię tak, aby profil był gładki.Aby pasek analizy obrazu mógł dokładnie uchwycić poszczególne aspekty pigmentacji, kluczowe jest zidentyfikowanie obszaru analizy, w którym szum spowodowany nieprawidłowościami obrazu lub preparatu będzie minimalny. Następnie należy przeprowadzić analizę Tergite3 na tym samym obrazie, a potem przejść do kolejnego zdjęcia. Opisana procedura została wykorzystana do zbadania znanej zmiany pigmentacji odwłoka wywołanej temperaturą hodowli.Trzeci i czwarty tergit badano wielokrotnie przy różnym oświetleniu i ekspozycji. Przeanalizowano różne aspekty pigmentacji. W szczególności stwierdzono, że pasy pigmentacyjne były szersze u much hodowanych w niższych temperaturach.Obliczone wartości porównano następnie z ogólnymi pomiarami subiektywnymi, wykonanymi na tych samych muchach przez pięciu różnych obserwatorów. W ocenie 45 samic much średni obserwowany ranking szerokości czwartego pasa pigmentacyjnego odwłoka był ściśle skorelowany z automatycznym pomiarem wykonanym przez makro. Ten sam pas pigmentacyjny zmierzono również ręcznie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.Wyniki te były również silnie skorelowane z pomiarami wykonanymi za pomocą makra. Następnie przetestowano oprogramowanie w celu pomiaru pigmentacji u samic mutantów ebony, o których wiadomo, że wykazują zwiększoną pigmentację w trzecim i czwartym prążku pigmentowym. Metodę tę zastosowano również do pomiaru piątego i szóstego prążka brzusznego u samic typu dzikiego.Zautomatyzowana technika zawsze dostarczała użytecznych pomiarów gęstości pigmentu oraz rozmiaru pasma. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko i precyzyjnie kwantyfikować pigmentację odwłoka u Drosophila. Opanowanie tej techniki wymaga przede wszystkim wprawy w posługiwaniu się pęsetą.Po opanowaniu metody, część obrazowania w tej technice może być wykonywana w tempie 50 próbek na godzinę. Ekstrakcja pomiarów pigmentacji z tych obrazów może być przeprowadzana w tempie 70 obrazów na godzinę.

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Zróżnicowanie fenotypowe cech może wynikać z mutacji w sekwencjach elementów cis-regulatorowych (CRE), które kontrolują wzorce ekspresji genów. Metody opracowane do zastosowania u Drosophila melanogaster pozwalają na ilościowe porównanie poziomów przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów pośredniczonych przez zmodyfikowane lub naturalnie występujące warianty CRE.

Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Opisano protokoły dotyczące okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Klasyfikacja i kwantyfikacja pigmentacji stanowią solidną podstawę do badania mechanizmów rozwojowych cech dorosłych i umożliwiają międzygatunkowe porównanie rozwoju cech.

Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera

Drosophila to szeroko stosowany model eksperymentalny, odpowiedni do badania przesiewowego leków o potencjalnym zastosowaniu w terapii raka. W tym miejscu opisujemy zastosowanie barwnych fenotypów oczu Drosophila jako metody badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny.

Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

Poliploidyzacja wywołana raną to zachowana strategia naprawy tkanek, w której komórki rosną zamiast dzielić, aby zrekompensować utratę komórek. Oto szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać muszkę owocową jako model do pomiaru ploidalności i jej regulacji genetycznej w naprawie ran nabłonkowych.

Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.

Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.

Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Poznaj metodę kwantyfikacji pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster przy użyciu analizy obrazu cyfrowego. Technika ta umożliwia nieinwazyjne pomiary rozprzestrzenienia i głębokości pigmentacji.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów