Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej metodologii jest szybkie ilościowe określenie pigmentacji jamy brzusznej u muszki owocowej Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii ewolucyjnej, takie jak identyfikacja loci genetycznych, które z kolei leżą u podstaw morfologii zmienności specyficznej dla zaufania, oraz zrozumienie rozwoju i ewolucji fenotypów morfologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala użytkownikom na nieniszczący pomiar różnych aspektów pigmentacji jamy brzusznej, w tym rozprzestrzeniania się i głębokości pigmentacji.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pigmentację brzucha Drosophila melanogaster, można ją również zastosować do innych gatunków Drosophila i łatwo dostosować do pomiaru wzorców pigmentacji u innych owadów i taksonów zwierząt. Przed obrazowaniem muszki mogą być przechowywane w 70% etanolu, aby utrzymać ich pigmentację. Wizualizacja wymaga podkładki montażowej.

Załaduj 60-milimetrową szalkę Petriego około 10 mililitrami 1,25% agaru w wodzie. Pod mikroskopem użyj cienkich kleszczy, aby wykopać w żelu rów o długości 20 milimetrów, szerokości dwóch milimetrów i głębokości jednego milimetra. W jednym naczyniu można wykonać kilka rowów.

Następnie osadzaj muchy w wykopie z powierzchnią do analizy znajdującą się tuż nad powierzchnią żelu. W tym przypadku interesująca jest strona grzbietowa. Teraz napełnij naczynie 70% etanolem, aż muchy zostaną całkowicie zanurzone.

Zmniejsza to odbicia od naskórka, które mogą zasłaniać wzór pigmentacji. Teraz uruchom oprogramowanie do obrazowania i kamerę cyfrową podłączoną do mikroskopu. W przypadku źródła światła wystarczające jest zimne światło z podwójnego urządzenia na gęsiej szyi.

W oprogramowaniu do analizy obrazu ustaw typ obrazu na 8-bitowy. Następnie w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu przełącz ustawienie Na żywo, aby otworzyć okno widoku kamery. Ustaw typ obrazu na Skala szarości.

Teraz ustaw źródło światła na maksymalne natężenie i ustaw światła około 120 milimetrów od sceny. Ustaw mikroskop na 60-krotne powiększenie, tak aby pole widzenia miało trzy milimetry szerokości. Następnie umieść mikrometr dwumilimetrowy stolika w polu view i skup się na nim.

Wracając do oprogramowania, dostosuj czas ekspozycji, aby view mikrometr za pomocą pola znajdującego się w polu ekspozycji. Następnie ustaw skalę. Otwórz narzędzie linii prostej i narysuj długość dwóch milimetrów wzdłuż mikrometru stolika.

Następnie wprowadź tę długość w opcji Ustaw skalę. W oknie powinna zostać wyświetlona skala w pikselach na mikron. Zwróć uwagę na skalę i zaakceptuj regulacje.

Teraz wróć do oprogramowania do przechwytywania obrazu i użyj poleceń Stop i Snap, aby przechwycić obraz mikrometru stołowego. Następnie wróć do oprogramowania do analizy obrazu i zapisz obraz jako plik TIFF. Teraz skup się na grzbietowej linii środkowej dosiadanej muchy.

Linia środkowa powinna być ustawiona prosto do góry, aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania. Odsuń na bok skrzydła i wszelkie inne wystające struktury i dostosuj oświetlenie, aby jak najlepiej oświetlić naskórek. Następnie ustaw ekspozycję w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu, używając histogramu wartości piksela jako przewodnika, aby uchwycić pełny zakres pikseli obrazu bez nasycenia, maksymalizując w ten sposób kontrast.

Zachowaj tę ekspozycję i oświetlenie przez cały czas trwania eksperymentu. Teraz, przed zrobieniem zdjęcia, upewnij się, że interesujące Cię segmenty brzucha są widoczne. Następnie przechwyć obraz i zapisz obraz z numerem identyfikacyjnym próbki w nazwie pliku.

Użyj formatu opisanego w pisemnym protokole. W analizie wykorzystano makro dostarczone przez autorów. Wszystkie serie obrazów do analizy powinny znajdować się w tym samym folderze plików.

Teraz uruchom makro i postępuj zgodnie z wyświetlanymi poleceniami. Najpierw zidentyfikuj lokalizację przechowywanych plików. Następnie zidentyfikuj lokalizację, w której mają być przechowywane dane analizy.

Następnie wprowadź liczbę znaków, które zostały użyte w nazwach plików, aby oprogramowanie poprawnie odczytało serię obrazów. Następny monit dotyczy szerokości obszaru zainteresowania. Tutaj wprowadź liczbę pikseli wzdłuż paska przednio-tylnego, który należy przeanalizować.

Teraz, po wyświetleniu monitu, dokonaj wyboru, aby przeanalizować pierwszy obraz z serii. Inne opcje to przeanalizowanie następnego obrazu w serii lub zakończenie analizy. Narzędzie linii zostanie wybrane automatycznie.

Użyj go, aby zidentyfikować linię środkową na obrazie, rysując wzdłuż niej linię w kierunku od przodu do tyłu. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami makr, aby zidentyfikować tylną krawędź Tergite4 za pomocą narzędzia linii. Narzędzie do rysowania linii jest dostępne do rysowania linii od tylnej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej, tak aby środek linii znajdował się tuż za tylną krawędzią pasma pigmentowego.

Następnie nakreśl przednią krawędź Tergite4 za pomocą narzędzia linia. Narysuj linię od przedniej krawędzi linii środkowej do prawej krawędzi bocznej. Środek linii wyznaczonej białym kwadratem powinien znajdować się na przedniej krawędzi lekko naskórka.

Dzięki tym informacjom makro generuje teraz profil pigmentacji. Jednak profil może być niedokładny, jeśli włosie lub inne skazy przecinają pasek, wzdłuż którego mierzony jest profil. Aby to skorygować, wybierz podgląd na żywo w oknie histogramu i dostosuj linię tak, aby profil był gładki.

Aby pasek do analizy obrazu mógł dokładnie uchwycić różne aspekty pigmentacji, konieczne jest zidentyfikowanie obszaru analizy, w którym będzie występował minimalny szum spowodowany nierównościami obrazu lub próbki. Teraz przejdź do analizy Tergite3 na tym samym obrazie, a następnie przejdź do następnego obrazu. Opisana procedura została wykorzystana do zbadania znanej zmiany w pigmentacji jamy brzusznej spowodowanej temperaturą odchowu.

Trzeci i czwarty tergit badano kilkakrotnie w różnych warunkach oświetleniowych i ekspozycyjnych. Badano różne aspekty pigmentacji. W szczególności stwierdzono, że pasma pigmentacji były szersze, gdy muchy były hodowane w niższych temperaturach.

Obliczone wartości zostały następnie porównane z ogólnymi, subiektywnymi pomiarami wykonanymi na tych samych muchach przez pięciu różnych obserwatorów. W ocenie 45 samic muszek średnia obserwowana ranga szerokości czwartego pasma pigmentacji brzucha była ściśle skorelowana z automatycznym pomiarem makro. Ten sam pas pigmentacyjny został również ręcznie zmierzony za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Wyniki te były również silnie skorelowane z pomiarami wygenerowanymi za pomocą makra. Oprogramowanie zostało następnie przetestowane w celu zmierzenia pigmentacji u samic mutantów hebanu, o których wiadomo, że mają zwiększoną pigmentację w trzecim i czwartym paśmie pigmentowym. Metodę wykorzystano również do pomiaru piątego i szóstego pasma brzusznego samic typu dzikiego.

Zautomatyzowana technika zawsze zapewniała użyteczne pomiary gęstości pigmentu i rozmiaru pasma. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko i precyzyjnie określić ilościowo pigmentację brzucha u Drosophila. Opanowanie tej techniki wymaga przede wszystkim głębokiego użycia kleszczy.

Po opanowaniu, część obrazowania tej techniki można wykonać z szybkością 50 próbek na godzinę. Wyodrębnianie miar pigmentacji z tych obrazów może odbywać się w tempie 70 obrazów na godzinę.