Name: Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów z mezenchymalnych komórek nabłonka sutka. Technika umożliwia transfer właściwości komórek macierzystych do komórek luminalnych w badaniach biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, H.J.L.) oraz z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, H.J.L.).

Wszystkie badania z udziałem zwierząt były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Izolacja i walidacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów
<ol>
	<li>Posiew komórek podstawnych nabłonka sutka, NAMECs4, ze świeżą, pozbawioną surowicy pożywką wykonaną z 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM/F12 z wodorowęglanem sodu (0,2438%); EGF (5 ng/ml); hydrokorytyzon (0,5 μg/ml); insulina (5 μg/ml); ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE; 35 μg/ml); i GW627368X (1 μg/ml) w 15 cm szalkach.</li>
	<li>Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru, wysiewaj 1,2 x 106 komórek w 12 ml pożywki na 15-centymetrową szalkę w dniu 0 przez 4 dni4.</li>
	<li>Po 4 dniach w hodowli odwirować pożywkę hodowlaną o sile 300 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej. Przenieść supernatant do stożkowej rurki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odwirować supernatant o stężeniu 2 000 x g przez 20 minut w wirówce stołowej. Przenieś supernatant do probówki ultrawirówkowej i pozostaw martwe komórki i resztki komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki do ultrawirówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 110 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad EV/egzosomu w PBS (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odwirować supernatant w temperaturze 110 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad EV/egzosomu w PBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zawiesić osad wyizolowany z 240-480 ml pożywki kondycjonowanej NAMEC w 100 μl.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka w zawiesinie EV za pomocą testu białka BCA. Upewnij się, że stężenie wynosi około 20-40 μg/100 μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.</li>
	<li>Zmierz stężenie i wielkość EV/egzosomów za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), jak opisano wcześniej przez Gardinera i wsp.11. Rozcieńczyć EVs/egzosomy (20 μg/100 μL) za pomocą PBS do 10 000-krotnie w celu analizy NTA. 
	UWAGA: Wynik analizy NTA odzwierciedla liczbę i wielkość analizowanych pęcherzyków.</li>
	<li>Zobrazuj EV/egzosomy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), jak opisano wcześniej przez Lin et al4.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie egzosomów za pomocą gradientu gęstości
<ol>
	<li>Zawiesić 110 000 g osadu z kroku 1,7 w 40% (w/v) jodiksanolu w PBS (2 ml). Nałożyć mieszaninę kolejno na podwielokrotności jodiksanolu 30%, 20%, 10% i 5% (m/v) w PBS (po 2 ml każdy) w celu utworzenia gradientu gęstości w probówce ultrawirówkowej.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę przy 200 000 x g przez 8 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać każdą frakcję gradientową (10 frakcji; 1 ml/frakcję) za pomocą pipety od góry probówki.</li>
	<li>Przeanalizuj obecność markerów egzosomów (np. CD81, CD9, CD63 i Tsg101) w każdej frakcji za pomocą SDS-PAGE12 i Western blot. Załadować 50 μl zawiesiny każdej frakcji na 10% żel zawierający 0,1% (w/v) SDS i rozdzielić białka na frakcje za pomocą elektroforezy żelowej.</li>
	<li>Przenieść białka z żelu na błonę PVDF i inkubować błonę z przeciwciałami przeciwko markerom egzosomów (np. CD81, CD9, CD63 i Tsg101) i białkiem porządkowym GAPDH przez noc (tabela materiałów) w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wynik identyfikuje frakcję zawierającą egzosomy.</li>
</ol>
3. Etykietowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów
<ol>
	<li>Zawiesić EVs/egzosomy otrzymane w kroku 1.7 w 10 μM estru dioctanu sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) przy 20 μg białka egzosomalnego/100 μl. Przygotować równoległą próbkę zawierającą tylko CFSE i PBS, przetworzoną w ten sam sposób, jako kontrolę ujemną do późniejszych testów wychwytu EV/egzosomu. Pozostawić mieszaniny w temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
	<li>Zawiesić EV/egzosomy w 50-krotnej objętości PBS i odwirować zawiesinę przy 110 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad EV/egzosom w PBS. Powtórz krok 3.2 jeden raz.</li>
	<li>Zawieś EV/egzosomy w PBS przy stężeniu 20 μg białka egzosomalnego/100 μl, a następnie przefiltruj EV/egzosomy przez błony 0,22 μm przed dodaniem EV/egzosomów do komórek.</li>
</ol>
4. Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów
<ol>
	<li>Aby przygotować pożywkę, wymieszaj 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM/F12 z wodorowęglanem sodu (0,2438%); EGF (5 ng/ml); hydrokorytyzon (0,5 μg/ml); insulina (5 μg/ml); oraz BPE (35 μg/ml)4. Umieść ludzkie komórki HMLE nabłonka sutka w 6-dołkowych szalkach (1 x 106 komórek / dołek) na dzień przed leczeniem EV / egzosomem. Dodać 2 μg/ml EV/egzosom znakowane fluorescencyjnie CFSE, otrzymane w kroku 3.3, do pożywki hodowlanej komórek HMLE przez 2-6 godzin. Komórki HMLE z ujemnej grupy kontrolnej należy potraktować preparatem równoległym, opisanym w kroku 3.1.</li>
	<li>Po 2-6-godzinnej inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 4 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odłącz komórki z 0,25% trypsyny na 10 minut i ponownie zawieś komórki w PBS zawierającym 0,2% FBS. Zmierz wychwyt EV/egzosomu na podstawie intensywności fluorescencji w komórkach za pomocą analizatora komórek fluorescencyjnych4. Zobrazuj komórki poddane działaniu EV / egzosomów lub kontroli negatywnej za pomocą mikroskopii konfokalnej. 
	UWAGA: Zielona fluorescencja w komórkach jest spowodowana wychwytem EV / egzosomu. Zobacz legendę Rysunek 6, aby zapoznać się z ustawieniami mikroskopu.</li>
</ol>
5. Izolacja pierwotnych komórek nabłonka sutka myszy
<ol>
	<li>Przygotuj naczynia pokryte żelatyną, dodając 12 ml 0,1% roztworu żelatyny do 10 cm szalek. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut. Usuń roztwór żelatyny i pozostaw pokrywki z naczyń w okapie z przepływem laminarnym na 4 godziny, aż powłoka żelatynowa wyschnie.</li>
	<li>Wypreparuj gruczoły sutkowe numer 2, 3, 4 i 5 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2) od 12-tygodniowych dziewiczych samic myszy C57BL / 6 za pomocą nożyczek i pokrój gruczoły na małe kawałki (2 mm2) za pomocą brzytwy.</li>
	<li>Następnie rozdzielić gnojowicę gruczołów sutkowych (od 10 myszy) przez 60 minut w temperaturze 37 °C, mieszanie 120 obr./min z 50 ml DMEM/F12 zawierającego 0,2% kolagenazy typu IV, 0,2% trypsyny, 5% FBS, 5 μg/ml gentamycyny i 1x paciorkowcowiec.</li>
	<li>Osadzać organoidy nabłonkowe z mieszaniny przez odwirowanie w temperaturze 350 x g przez 10 min.</li>
	<li>Zawiesić organoidy nabłonkowe w 4 ml DMEM/F12 z 0,1 mg/ml DNazy I na 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 6 ml DMEM/F12 do końcowej objętości 10 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml DMEM/F12. Odwiruj zawieszenie, ale naciśnij hamulec, gdy prędkość osiągnie 400 x g. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Po naciśnięciu hamulca organoidy nabłonkowe są szybko granulowane, podczas gdy fibroblasty, jako pojedyncze komórki, nadal pozostają w supernatancie.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.6 i 5.7 5-7 razy. Dodaj kroplę zawiesiny do hemocytometru, a następnie sprawdź klirens fibroblastów z mieszaniny organoidów pod mikroskopią po każdej rundzie wirowania (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Na płytkę organoidy umieścić w naczyniu pokrytym żelatyną, otrzymanym w kroku 5.1, przez 48 godzin z DMEM/F12 zawierającym 1x ITS, 5% FBS, 50 μg/ml gentamycyny, 10 ng/ml EGF i 1x paciorkowcowiec.</li>
	<li>Po 48 godzinach usunąć pływające komórki z hodowli, zastępując pożywkę świeżą pożywką hodowlaną bez FBS (DMEM/F12 zawierający 1x ITS, 50 μg/ml gentamycyny, 10 ng/ml EGF i 1x pen-strep).</li>
	<li>Potwierdź, że monowarstwa komórek nabłonka sutka migruje i wyrasta z przyczepionych organoidów nabłonkowych w ciągu 3 dni.</li>
</ol>
6. Separacja pierwotnych komórek nabłonka sutka podstawnego/luminalnego myszy
<ol>
	<li>Po 3-dniowej hodowli należy odłączyć pierwotne komórki sutka myszy za pomocą naturalnej mieszaniny enzymów o aktywności enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych na 20 minut. Zneutralizować aktywność enzymatyczną za pomocą 5% FBS w PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 5 mg/ml dypazy na 20 minut. Zneutralizuj aktywność enzymu za pomocą 5% FBS w PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS z 0,2% FBS w stężeniu 10-7 komórek/ml z rozcieńczonymi przeciwciałami anty-CD49f i anty-EpCAM na lodzie przez 1 godzinę w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki PBS, a następnie inkubuj komórki z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem na lodzie przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Umyj i ponownie zawieś komórki w PBS z 0,2% FBS.</li>
	<li>Posortuj komórki nabłonka sutkaEpCAM hi/CD49flo luminal na sortowniku komórek4.</li>
</ol>
7. Leczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów
<ol>
	<li>Wysiewaj posortowane komórki nabłonka sutka EpCAMhi/CD49flo luminal sutk z kroku 6.7 na pokrytych żelatyną 6-dołkowych szalkach (2 x 105 komórek / dołk), a następnie potraktuj je PBS lub EV/egzosomami pochodzącymi z 2 μg / ml NAMEC uzyskanymi w kroku 1.7.</li>
	<li>Aby zapewnić biologiczną skuteczność EV/egzosomów w długotrwałym traktowaniu hodowli, należy co dwa dni zastępować pożywkę do hodowli komórkowych świeżą pożywką zawierającą PBS lub 2 μg/ml EV/egzosomy pochodzące z NAMEC. Nie należy dzielić pierwotnych komórek luminalnych myszy podczas 10-dniowej kuracji.</li>
</ol>
8. Wstrzyknięcie komórek nabłonka sutka do poduszeczki tłuszczowej
<ol>
	<li>Znieczulenie 3-tygodniowej samicy myszy C57BL/6 za pomocą izofluoranu 2-3% środka wziewnego.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na plecach. Usuń sierść na środkowej części brzucha za pomocą kremu do golenia/włosów i oczyść miejsce operacji trzema naprzemiennymi cyklami 70% alkoholu i jodowidonu.</li>
	<li>Wykonaj nożyczkami pionowe nacięcie przez skórę wzdłuż brzusznego odcinka piersiowo-pachwinowego, a następnie na przemian odsłaniaj prawe i lewe 4 poduszeczki tłuszczowe sutka.</li>
	<li>Oczyść każdą poduszeczkę tłuszczową, usuwając miąższ gruczołu nożyczkami. Zlokalizuj węzeł chłonny w poduszce tłuszczowej, a następnie usuń cały miąższ gruczołu poniżej węzła chłonnego. 
	UWAGA: Dwie trzecie poduszeczki tłuszczowej powinno pozostać na swoim miejscu.</li>
	<li>Oderwać komórki otrzymane w kroku 7.2 za pomocą naturalnej mieszaniny enzymów (patrz tabela materiałów) o aktywności enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych przez 10 minut. Zneutralizować aktywność enzymu za pomocą 5% FBS w PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zawiesić komórki w PBS w stężeniu tak, aby 15 μl zawierało pożądaną dawkę komórek (10,4-10,2 komórki/podkładkę).</li>
	<li>Wstrzyknąć 15 μl zawiesiny komórek nabłonka sutka do poduszeczki tłuszczowej za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 100 μl przymocowanej do igły 27G.</li>
	<li>Powtórz kroki 8.4-8.7 dla poduszeczki tłuszczowej po drugiej stronie.</li>
	<li>Zamknij skórę klipsami do ran.</li>
</ol>
9. Gruczoł sutkowy Całe wierzchowiec
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 plus zwichnięcie szyjki macicy po 8 tygodniach od wstrzyknięcia komórki (krok 8.7).</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie przez warstwę skóry od okolicy piersiowej do okolicy pachwinowej za pomocą nożyczek, a następnie odsłoń zarówno prawą, jak i lewą4-tą poduszeczkę tłuszczową sutka. Usuń 4 gruczoł sutkowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Rozprowadź poduszeczki tłuszczowe na szklanych szkiełkach mikroskopowych i utrwal poduszeczki tłuszczowe utrwalaczem Kahlego (4% formaldehydu, 30% EtOH i 2% lodowatego kwasu octowego) w temperaturze pokojowej przez noc. 
	Uwaga: Utrwalacz Kahlego jest substancją drażniącą. Wykonaj ten krok w okapie chemicznym.</li>
	<li>Płucz poduszeczki tłuszczowe w 250 ml 70% EtOH przez 15 min, a następnie w 250 ml dH2O przez 5 min. Poduszeczki tłuszczowe zabarwić karminowym ałunem (1 g karminu i 2,5 g siarczanu glinowo-potasowego w 500 ml dH2O) w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Myj poduszeczki tłuszczowe 250 ml 70% EtOH przez 15 minut, 250 ml 95% EtOH przez 15 minut i 250 ml 100% EtOH przez 15 minut.</li>
	<li>Czyść poduszeczki tłuszczowe w ksylenie przez kilka dni i przerwij inkubację ksylenu, gdy poduszeczki tłuszczowe staną się przezroczyste. 
	Uwaga: Ksylen jest substancją drażniącą. Wykonaj ten krok w okapie chemicznym.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka za pomocą podłoża montażowego i zrób zdjęcia (2 400 dpi) poduszek tłuszczowych za pomocą cyfrowego skanera do slajdów.</li>
</ol>

<ol><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes--vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication.</a> Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Boelens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+Transfer+from+Stromal+to+Breast+Cancer+Cells+Regulates+Therapy+Resistance+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-507 (2014).</li>
<li>Lin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2+%2FEP4+Signaling+Controls+the+Transfer+of+the+Mammary+Stem+Cell+State+by+Lipid+Rafts+in+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles.</a> Stem Cells. , (2016).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li>
<li>György, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Olver, C., Vidal, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4020-5943-8_7">Proteomic analysis of secreted exosomes.</a> Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Prater, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+stem+cells+have+myoepithelial+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary stem cells have myoepithelial cell properties.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+exosome+release+from+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells+-+a+new+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway.</a> Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>Outzen, H. C., Custer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+normal+and+neoplastic+mammary+tissues+in+the+cleared+mammary+fat+pad+of+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse.</a> J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).</li>
<li>Sheffield, L. G., Welsch, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+breast+epithelia+to+mammary-gland-free+fat-pads+of+athymic+nude+mice%3A+influence+of+mammotrophic+hormones+on+growth+of+breast+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia.</a> Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Egzosomy często mają cechy komórek, które je uwolniły, a ilość uwolnionych egzosomów może być indukowana przez bodźce4. Pożywkę hodowlaną komórek można zebrać i poddać ultrawirowaniu różnicowemu w celu zebrania EV/egzosomu (ryc. 1). Obecnie nie ma ogólnej zgody co do idealnej metody izolowania EV/egzosomów. Optymalna metoda zastosowana w tym przypadku została określona przez dalszą aplikację14. Ultrawirowanie jest stosunkowo szybką metodą izola...

Egzosomy mogą pośredniczyć w komunikacji komórkowej, przenosząc błonowe i cytozolowe białka, lipidy i RNA między komórkami1. Wykazano, że komunikacja za pośrednictwem egzosomów jest zaangażowana w wiele procesów fizjologicznych i patologicznych (tj. prezentacja antygenu, rozwój tolerancji 2 i progresja nowotworu3). Egzosomy często mają zawartość podobną do tych, które mają komórki źródłowe, które je uwalniają. W ten sposób egzosomy mogą przenosić określone właściwości komórek z komórek źródłowych i przenosić te właściwości do komórek, które je spożywają4.
Egzosomy to dwuwarstwowe pęcherzyki błonowe o długości od 50 do 150 nm, które mają specyficzne markery (np. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix i TSG101). Tak więc egzosomy muszą charakteryzować się różnymi metodami dla różnych aspektów. Transmisyjna mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do wizualizacji pęcherzyków błonowych, takich jak egzosomy4,5. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) i analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS) są używane do pomiaru wielkości i liczby oczyszczonych egzosomów4. Zawartość błony lipidowej egzosomów można zweryfikować za pomocą gradientu gęstości. Markery egzosomalne, takie jak CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix i TSG1016,7, można mierzyć metodą Western blot.
Komórki podstawne sutka mają zdolność generowania gruczołów sutkowych po wszczepieniu do poduszek tłuszczowych, podczas gdy komórki luminalne nie mogą8,9,10. W związku z tym komórki podstawne sutka są również określane jako jednostki rezapulujące sutek. Korzystając z modelu komórek podstawnych i luminalnych sutka, można zbadać zdolność EV/egzosomów do przenoszenia cech komórek między różnymi populacjami komórek. W pracy przedstawiono metodę przenoszenia zdolności tworzenia gruczołów z komórek podstawnego nabłonka sutka do komórek nabłonka światła sutka za pomocą EVs/egzosomów pochodzących z komórek podstawnych nabłonka sutka. Luminalne komórki nabłonka sutka uzyskały właściwości komórek podstawnych po spożyciu EV/egzosomów wydzielanych z komórek podstawnych, a następnie mogą tworzyć gruczoły sutkowe4.

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>do analizy śledzenia nanocząstek (NTA)</td></tr><tr><td>Optiprep&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (w/v) roztwór jodiksanolu w wodzie (sterylny).</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD81</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1,000 w 5% w/v beztłuszczowym mleku w proszku, 1x TBS, 0,1% Tween 20 przy 4 &deg; C, nocleg&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD9</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1,000 w 5% w/v beztłuszczowym mleku w proszku, 1x TBS, 0,1% Tween 20 przy 4 & deg; C, nocleg&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD63</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1,000 w 5% w/v beztłuszczowym mleku w proszku, 1x TBS, 0,1% Tween 20 przy 4 & stopniach; C, nocleg&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało TSG101</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1,000 w 5% w/v beztłuszczowym mleku w proszku, 1x TBS, 0,1% Tween 20 przy 4 &deg; C, nocleg&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6 000 w 5% w/v beztłuszczowym mleku w proszku, 1x TBS, 0,1% Tween 20 przy 4 &deg; C, nocleg&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (ester dioctanu karboksyfluoresceiny sukcynimidylu)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>analizator komórek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>kolagenaza Typ IV&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>Thermo</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>mieszanina rekombinowanej insuliny ludzkiej, ludzkiej transferyny i seleninu sodu</td></tr><tr><td>akutaza</td><td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>naturalna mieszanina enzymów o aktywności enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych</td></tr><tr><td>dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/ml = 5 U/ml</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD49f</td><td>Biolegend</td><td>313611</td> przeciwciało anty-EpCAM <td>1:50</td></tr><tr><td></td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>sorter</td></tr><tr><td>komórek ałun karminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie komórki nabłonka sutka (komórki HMLE, NAMC)</td><td></td><td></td><td>prezenty od dr. Roberta Weinberga</td></tr><tr><td>permount</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocoritisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (ekstrakt z przysadki bydlęcej)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>Kajman</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>15 cm naczynie hodowlane</td><td>Sokół&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>wirówka stołowa</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>Wirówka 3415R</td><td></td></tr><tr><td>ultrawirówka probówka</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)&nbsp;</td>Test białkowy <td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>żelatyna&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie hodowlane</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>6-dołkowe naczynie hodowlane</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>samica myszy C57BL/6</td><td>NLAC (National Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bull Bevine Serum)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>izofluoran&nbsp;</td><td>Halocarbon</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (etanol)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>lodowaty kwas octowy</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>siarczan glinowo-potasowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen&nbsp;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m membrany</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Klipsy do nawijania, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Aplikator do spinania ran</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; Głęboka czerwień</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C10046</td><td>plama błony plazmatycznej</td></tr></tbody></table>

przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Komórki mogą komunikować się za pomocą egzosomów, pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ~100-nm (EV), które zawierają białka, lipidy i kwasy nukleinowe. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka (NAMEC) można wyizolować z podłoża NAMEC za pomocą ultrawirowania różnicowego. W zależności od ich gęstości, EV mogą być oczyszczane przez ultrawirowanie w temperaturze 110 000 x g. Preparat EV z ultrawirowania można dalej oddzielać za pomocą ciągłego gradientu gęstości, aby zapobiec zanieczyszczeniu rozpuszczalnymi białkami. Oczyszczone EV można następnie poddać dalszej ocenie za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, która mierzy rozmiar i liczbę pęcherzyków w preparacie. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o wielkości od 50 do 150 nm to egzosomy. EV/egzosomy pochodzące z NAMEC mogą być spożywane przez komórki nabłonka sutka, które można mierzyć za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej. Niektóre właściwości komórek macierzystych sutka (np. zdolność do tworzenia gruczołów sutkowych) mogą być przenoszone z komórek macierzystych podobnych do NAMEC do komórek nabłonka sutka za pośrednictwem EV / egzosomów pochodzących z NAMEC. Izolowane pierwotne komórki nabłonka sutkaEpCAM hi/CD49flo luminal nie mogą tworzyć gruczołów sutkowych po przeszczepieniu do mysich poduszek tłuszczowych, podczas gdy EpCAMlo / CD49fhi podstawowe komórki nabłonka sutka tworzą gruczoły sutkowe po przeszczepie. Wychwyt EV/egzosomów pochodzących z NAMEC przez EpCAMhi/CD49flo luminal sutk epithelial cells pozwala im na wytwarzanie gruczołów sutkowych po przeszczepieniu do poduszek tłuszczowych. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg przenoszą zdolność tworzenia gruczołu sutkowego do komórek nabłonka sutka EpCAMhi / CD49flo luminal.

Ponieważ wykazano, że blokowanie sygnalizacji PGE2/EP4 wywołuje uwalnianie EV/egzosomów z podstawiopodobnych komórek macierzystych piersi4, niniejsza praca przedstawia metodę izolacji indukowanych EV/egzosomów z hodowli podstawnych komórek nabłonkowych piersi (NAMEC). Ponieważ komórki NAMEC są hodowane w medium bezzasadkowym, w medium nie występują wcześniej obecne EV/egzosomy pochodzące z surowicy13. W przypadku komóre...

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów przenoszących cechy macierzystości z komórek macierzystych oraz ocena zdolności tych nanocząstek do przekazywania cech macierzystości. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące tego, czy pochodne komórek macierzystych przenoszą cechy te bezpośrednio, czy za pośrednictwem pęcherzyków.Egzosomy mogą przekazywać właściwości komórek macierzystych komórkom niebędącym komórkami macierzystymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że indukowane komórki macierzyste powstają w pęcherzykach transportujących. Ponadto egzosomy mogą być wykorzystywane do bezpośredniego przeprogramowania komórek niebędących komórkami macierzystymi w komórki macierzyste.Procedurę zaprezentuje badacz postdoctoral LeMonsier wraz z asystentami chirurgicznymi: Pei-Ling, Wen-Tin oraz Shih-Yin, wszyscy z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od wysiania $1,2 \times 10^6$ nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonkowych piersi (NAMECs) w 12 ml pożywki na szalkę 15 cm i inkubowania przez cztery dni w inkubatorze do hodowli komórkowych. W czwartym dniu należy zebrać pożywkę hodowlaną do wirowania na wirówce laboratoryjnej.Następnie przenieś nadsącz do probówki stożkowej w celu drugiego wirowania na wirówce stołowej. Dalej, przelej nadsącz do nowej probówki do ultrawirówki i przeprowadź ultrawirowanie przez 30 minut. Po zakończeniu wirowania przenieś nadsącz do nowej probówki do ultrawirówki i ponownie poddaj go ultrawirowaniu.Usuń nadsącz i ponownie zawieś osad egzosomów z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w PBS w celu trzeciego ultrawirowania. Następnie ponownie zawieś osad w świeżym PBS i przeprowadź ostatnie ultrawirowanie cząstek komórkowych. Usuń nadsącz i ponownie zawieś osad egzosomów z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w 100 µL PBS.Następnie należy zmierzyć stężenie białka w zawiesinie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą testu kwasu bicinchoniniowego. Stężenie powinno wynosić w przybliżeniu od 20 do 40 µg na 100 µL. Aby zmierzyć stężenie i wielkość pęcherzyków zewnątrzkomórkowych oraz egzosomów, należy rozcieńczyć cząstki komórkowe do stężenia 2 µg białka na 100 mL PBS.Następnie należy przeanalizować cząstki za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Aby oczyścić egzosomy za pomocą gradientu gęstości, po trzecim wirowaniu w ultrawirówce należy zawiesić osad w 2 mL 40% jodiksanolu w PBS. Następnie na zawiesinę komórkową należy nałożyć sekwencyjnie objętości 2 mL jodiksanolu o stężeniach 30%, 20%, 10% i 5%.Frakcję komórkową rozdziel za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości, wykorzystując pipetę do pobrania każdej z dziesięciu warstw gradientu po zakończeniu wirowania. Następnie przeanalizuj obecność markerów egzosomów w każdej frakcji za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i western blotu zgodnie ze standardowymi protokołami, stosując przeciwciała przeciwko odpowiednim, interesującymi markerami egzosomów.Aby poddać komórki nabłonka gruczołu mlekowego działaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów, najpierw wysiej 2 × 10⁵ posortowanych przepływowo luminalnych komórek nabłonka gruczołu mlekowego epcam hi-CD 49F low na płytki sześciodołkowe pokryte żelatyną. Następnie potraktuj każdą hodowlę komórkową pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi i egzosomami pochodzącymi z NAMEC w stężeniu 2 µg/mL. Wymieniaj pożywkę hodowlaną na świeżą porcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów co dwa dni przez okres dziesięciu dni.Po zakończeniu okresu leczenia trzymyletnią samicę znieczulonej myszy 57 BL6 ułożyć w pozycji grzbietnej i usunąć futro z okolicy środkowej brzucha. Miejsce operacji zdezynfekować, stosując trzy naprzemienne cykle 70% alkoholu i powidonu jodowego. Następnie wykonać nacięcie pionowe o długości 1,5 cm przez skórę, wzdłuż brzusznej części klatki piersiowej i regionu pachwinowego.Naprzemiennie odsłoń prawe i lewe czwarte poduszki tłuszczowe gruczołu piersiowego. Zlokalizuj węzeł chłonny w każdej poduszce tłuszczowej i usuń cały gruczoł poniżej węzła chłonnego. Następnie użyj naturalnego enzymu o aktywności prodialitycznej i kolagenolitycznej, aby odseparować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oraz traktowane egzosomami luminalne komórki nabłonka gruczołu piersiowego.Neutralizacja aktywności enzymu przy użyciu 5% FBS w PBS po dziesięciu minutach. Zbiór komórek poprzez wirowanie i usunięcie supernatantu. Po przeliczeniu komórek, rozcieńczenie ich do stężenia od 1 × 10² do 1 × 10⁴ komórek w 15 µL PBS.Następnie należy użyć szklanej strzykawki o pojemności 100 µL wyposażonej w igłę 27G, aby wstrzyknąć 15 µL zawiesiny komórek nabłonka gruczołu mlekowego do każdej poduszki tłuszczowej. Po tym czasie należy zamknąć skórę za pomocą klipsów chirurgicznych. Osiem tygodni po iniekcji należy wykonać pionowe nacięcie skóry od obszaru klatki piersiowej do obszaru pachwinowego i odsłonić czwarte poduszki tłuszczowe gruczołów mlekowych po prawej i lewej stronie.Usuń czwarty gruczoł mlekowy i rozłóż poduszki tłuszczowe na pojedynczych szklanych szkiełkach przedmiotowych. Następnie przenieś szkiełka do dygestorium i utrwal poduszki za pomocą utrwalacza Collies przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka przemyj próbki w 250 mililitrach 70% etanolu przez 15 minut.Następnie płucz przez pięć minut w 250 mililitrach wody destylowanej. Po płukaniu wodą destylowaną zabarw poduszeczki tłuszczowe karminem alumnowym, pozostawiając je przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź dehydratację w serii 15-minutowych inkubacji w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu.Po ostatnim odwadnianiu przenieś próbki do ksylenu w dygestorium, aż tkanka tłuszczowa stanie się przezroczysta. Następnie zamocuj preparaty za pomocą medium montażowego i użyj cyfrowego skanera slajdów, aby obrazować tkankę tłuszczową z rozdzielczością 2 400 dots per inch. Wielkość wyizolowanych pęcherzyków oraz osadu z ultrawirówki wynosi zazwyczaj około 100 nanometers, co zostało zmierzone za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.Ponadto analiza frakcji po ultrawirowaniu medium kondycjonowanego NAMEC za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawnia obecność licznych pęcherzyków błonowych. Po rozdzieleniu w gradiencie gęstości, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, markery egzosomów można wykryć w 20-procentowej frakcji jodiksanolu. Analiza cytometryczna przepływowa ludzkich luminalnych komórek nabłonka gruczołu mlekowego inkubowanych z pochodzącymi z NAMEC pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi i egzosomami znakowanymi CFSE wykazuje dziesięciokrotnie silniejszy sygnał CFSE w kulturach traktowanych egzosomami.Wskazuje to na specyficzne pobieranie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów znakowanych CFSE przez komórki nabłonka gruczołu mlekowego. Co więcej, podczas gdy kontrola negatywna w postaci komórek nabłonka gruczołu mlekowego traktowanych PBS nie wykazuje sygnału CFSE, dowody na pobieranie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów pochodzących z NAMEC przez komórki traktowane egzosomami można zaobserwować za pomocą mikroskopii konfokalnej. Warto zaznaczyć, że poduszeczki tłuszczowe myszy, którym wstrzyknięto posortowane metodą przepływową luminalne komórki nabłonka gruczołu mlekowego epCAMhi/CD49Flo traktowane pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi i egzosomami pochodzącymi z NAMEC przez dziesięć dni, nabyły zdolność do tworzenia gruczołów mlekowych.Po opracowaniu technologia ta utorowała drogę naszym badaczom w dziedzinie biologii komórek macierzystych do zbadania zastosowania pochodnych z komórek macierzystych komórek trans i pęcherzyków oraz egzosomów w medycynie regeneracyjnej i bezpośrednim przeprogramowaniu komórek.

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Różnicowanie laktogenne komórek HC11 można scharakteryzować poprzez tworzenie się struktur kopułkowatych, określanych jako mammosfery. Struktury te można zliczyć za pomocą mikroskopii fazowej, co ułatwia ilościowe określenie stopnia różnicowania laktogennego.

Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i egzosomów z mezenchymalnych komórek nabłonka sutka. Technika umożliwia transfer właściwości komórek macierzystych do komórek luminalnych w badaniach biologii komórkowej.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów (Wideo) | JoVE Journal

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Przeglądaj więcej filmów