Perfuzja DiI jako metoda wizualizacji naczyń krwionośnych w Ambystoma mexicanum
16 czerwca 2017
Korzystając z lipofilowej techniki barwienia nadchloranem 1,1'-Dioctadecy-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI), Ambystoma mexicanum może ulegać perfuzji naczyniowej, co pozwala na łatwą wizualizację układu naczyniowego.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja unaczynienia aksolotla w unanieniu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej dotyczące zawiłości rewaskularyzacji regenerujących się tkanek u aksolotla. Główną zaletą tej techniki wizualizacji naczyń krwionośnych jest to, że wszystkie naczynia krwionośne zwierzęcia można łatwo zobrazować za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w regenerację kończyn aksolotl, może być również stosowana do innych tkanek, takich jak ogon, serce, oczy, skrzela lub inne narządy. Przed otwarciem klatki piersiowej axolotla najpierw potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez uszczypnięcie palca u nogi. Następnie użyj kleszczy chirurgicznych, aby uszczypnąć skórę wzdłuż centralnej osi klatki piersiowej, tuż poniżej linii ramion.
Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w miejscu, w którym skóra jest podciągnięta do góry i usuń kwadratowy fragment skóry nad klatką piersiową, aby odsłonić dwie płytki chrzęstne. Następnie otwórz okno nad jamą klatki piersiowej i ostrożnie rozerwij tkankę łączną, nie przecinając żadnych głównych naczyń krwionośnych. Użyj kleszczy, aby podnieść każdą płytkę chrząstki z osobna, wycinając każdą płytkę nożyczkami chirurgicznymi.
Ostrożnie uszczypnij odsłonięte osierdzie kleszczami. Podciągnięcie tkanki do góry i nakłucie jej nożyczkami chirurgicznymi, na tyle głęboko, aby usunąć osierdzie bez uszkodzenia serca. Następnie delikatnie usuń osierdzie, aby odsłonić serce i aortę, aby wyraźnie zobaczyć serce w odległości około pięciu milimetrów od aorty, rozgałęziającej się od serca.
Aby wykonać perfuzję aksolotl, umieść stojak zaciskowy z załadowaną igłą motylkową obok ramy z pianki polistyrenowej, tak aby ramieniem zacisku można było łatwo manipulować w celu wprowadzenia igły. Włącz pompę perystaltyczną, aby przepłukać 0,7x PBS przez rurkę pompy i skieruj końcówkę igły w stronę aspektu rostralnego. Wsuń kleszcze pod łuk aorty i lekko podciągnij.
Następnie manewruj kombinacją zacisku igły tak, aby igła biegła wzdłuż aorty w kierunku głowy zwierzęcia i włóż igłę około pięciu milimetrów do aorty, trzymając kleszcze za aortą w celu podparcia. Udane wprowadzenie może być potwierdzone widocznym powiększeniem przedsionków serca. Szybko rozerwij jeden przedsionek i pozwól krwi spłynąć.
Następnie perfaktor aksolotla za pomocą około 20 do 30 mililitrów PBS. Po udanej perfuzji zwierzę powinno zmienić kolor z jasnoróżowego na biały. Gdy cały PBS zostanie przetopiony, wstrzymaj pompę perystaltyczną i przesuń wolny koniec rurki do 15-mililitrowej probówki z roztworem Dil.
Uruchom ponownie pompę, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków w rurkach i przelać zwierzę, używając całego roboczego kolby Dil. W udanej perfuzji aksolotl zmieni kolor na jasnoróżowy, który będzie najbardziej zauważalny w skrzelach. Gdy cały Dil zostanie przetopiony, zatrzymaj pompę i umieść wolny koniec rurki w 4% roztworze paraformaldehydu.
Następnie uruchom ponownie pompę i przelej co najmniej 10 mililitrów utrwalacza. Po podaniu całego paraformaldehydu należy zatrzymać pompę i wyjąć igłę. Przenieś aksolotla na plastikowe naczynie i umieść naczynie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.
Następnie, przy wyłączonych światłach, wybierz filtr, który pozwala na wzbudzenie Dil, który emituje czerwono-pomarańczowe światło. Po udanej perfuzji plama Dil jest widoczna jako czerwony sygnał przyjęcia we wszystkich tkankach aksolotl, w tym w ogonie, kończynach, skrzelach i oczach. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby uważać, aby nie uszkodzić głównych naczyń krwionośnych lub serca podczas otwierania jamy klatki piersiowej i wprowadzić igłę w linii z aortą, aby zapobiec przebiciom. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak przygotowanie szkieletu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biomedycyny do badania unaczynienia różnych gatunków.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać perfuzję serca aksolotla za pomocą barwnika karbocyjaninowego, Dil. Nie zapominaj, że praca z igłami i paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania zabiegu należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia technikę wizualizacji naczyń krwionośnych aksolotla (Ambystoma mexicanum) z wykorzystaniem lipofilnej metody barwienia DiI. Podejście to ma istotne znaczenie dla zrozumienia rewaskularyzacji w medycynie regeneracyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia naczyniowa
- Obrazowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Aksolotl jest znany ze swoich zdolności regeneracyjnych.
- Zrozumienie jego układu naczyniowego jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat regeneracji tkanek.
- Wizualizacja naczyń krwionośnych może pomóc w badaniu różnych procesów regeneracyjnych.
- Technikę tę można zastosować w wielu tkankach aksolotla.
Cel badania
- W celu wizualizacji naczyń krwionośnych aksolotla.
- W celu zbadania rewaskularyzacji regenerujących się tkanek.
- W celu opracowania metody możliwej do zastosowania w różnych narządach aksolotla.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie techniki barwienia DiI do wizualizacji naczyń krwionośnych.
- Perfuzja naczyniowa w celu poprawy klarowności obrazowania.
- Mikroskopia fluorescencyjna do obrazowania naczyń krwionośnych.
- Potwierdzenie poziomu sedacji przed procedurami chirurgicznymi.
Główne wyniki
- Wszystkie naczynia krwionośne mogą zostać łatwo zobrazowane.
- Metoda ta dostarcza informacji na temat regeneracji kończyn.
- Możliwa do zastosowania w innych tkankach, takich jak ogon i serce.
- Ułatwia zrozumienie procesów regeneracyjnych u aksolotli.
Wnioski
- Technika barwienia DiI jest skuteczna w wizualizacji naczyń krwionośnych.
- Metoda ta może wspomóc badania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.
- Otwiera ona możliwości dalszych badań nad regeneracją aksolotla.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja sieci naczyniowych w modelach regeneracyjnych wspomaga walidację celu, wyjaśniając hemodynamiczny wkład w naprawę tkanek. Metoda ta umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka w badaniu szlaków angiogennych w studiach przedklinicznych. Zapewnia ona system istotny w kontekście choroby do oceny dynamiki rewaskularyzacji w regeneracji kończyn i narządów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez naczyniowych w modelach regeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośrednią wizualizację celów śródbłonkowych w celu walidacji funkcjonalnej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę zaangażowania celów angiogennych oraz modulacji szlaków sygnałowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty naczyniowe do przesiewania związków w kontekstach regeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanek w celu uzyskania powtarzalnych obrazów w różnych laboratoriach.
- Skalowalność: Kompatybilna z platformami mikroskopii konfokalnej do analiz o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy obrazowanie naczyniowe z wynikami funkcjonalnymi w regenerujących się tkankach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie rewaskularyzacji podczas gojenia.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera dopasowanie biomarkerów między strukturą naczyniową a skutecznością regeneracji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od testowania hipotez dotyczących celów molekularnych po przedkliniczną walidację modulatorów angiogenezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie odpowiedzi naczyniowych na zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne.
- Przesiewanie: Dostarcza tkanki gotowe do analizy ze zestandaryzowanym znakowaniem DiI w celu oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie gęstości naczyniowej, rozgałęzień i wzorców perfuzji.
- Badania translacyjne: Łączy obrazowanie naczyniowe z histologicznymi i funkcjonalnymi punktami końcowymi w badaniach nad regeneracją.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę wizualizacji naczyniowej dla wielu modeli tkanek aksolotla.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów angiogennych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom perfuzji i barwienia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie bezpośrednich danych o fenotypie naczyniowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów angiogennych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wyniki naczyniowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik mikrochirurgicznych i anatomii naczyniowej.
- Zależność od pomp perfuzyjnych, mikroskopów fluorescencyjnych oraz możliwości pracy z DiI.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójności przygotowania tkanek i obrazowania.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych tkanek aksolotla i etapów rozwoju.
- Ograniczone przez rozmiar tkanek i dostępność łożysk naczyniowych do perfuzji.
