Name: Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metodę długoterminowego obrazowania na żywo dysku oka Drosophila w celu badania różnicowania fotoreceptorów i rotacji ommatidiów. Technika umożliwia obserwację przez 10 godzin bez drogiego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Chun-lan Hsu i Yu-Chi Yangowi za przygotowanie pokarmu dla much i utrzymanie ich stada, a także Su-Ping Lee i IMB Imaging Core za pomoc w mikroskopii konfokalnej. Badanie to było wspierane przez granty dla Y.H.S. (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) z Narodowej Rady Nauki oraz Ministerstwa Nauki i Technologii Republiki Chińskiej.

1. Konfiguracja przedeksperymentalna
<ol>
	<li>Zebrać jajo muchy, które wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji jądrowej (GFP) w mδ0,5-Gal4 i hodować je w temperaturze 25 °C przez 5 dni.</li>
	<li>Mikrofalówkę 0,7 g niskotopliwej agarozy w 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aż agaroza całkowicie się rozpuści. Niskotopliwy żel o temperaturze 0,7% należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Sterylizuj cały sprzęt, w tym kleszcze, nożyczki, szkiełka nakrywkowe 42 mm x 0,17 mm, 9-dołkową szklaną płytkę punktową i magnetyczną komorę hodowlaną z 70% etanolem przez ponad 12 godzin.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną3: Pożywka Schneider's Drosophila uzupełniona 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,5% penicyliny-streptomycyny i 1,25 mg/ml insuliny. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przygotować pożywkę w kapturze do hodowli komórkowych. Przygotować pożywkę hodowlaną przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem sekcji wyczyść platformę preparacyjną i ręce eksperymentatora 70% etanolem.</li>
</ol>
2. Sekcja dysku
<ol>
	<li>Wysuszyć cały sprzęt na powietrzu z 70% etanolu.</li>
	<li>Wybierz larwę w trzecim stadium z fiolki na muchy. Aby uniknąć zanieczyszczenia z fiolki na muchy, umyj larwę w 1x PBS 3x, aby usunąć odpady.</li>
	<li>Wyciąć oczyszczoną larwę w 1 ml pożywki hodowlanej (w temperaturze pokojowej) na 9-dołkowej szklanej płytce punktowej pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Chwyć larwę parą kleszczy w około jednej trzeciej odległości od tylnego końca, a kolejne kleszcze w haczyku ustnym. Pociągnij dwa kleszcze w przeciwnych kierunkach, aby uwolnić tkanki wewnętrzne.
	<ol>
		<li>Usuń gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i naskórek z kompleksu oko-mózg przymocowanego do haczyka ustnego. Jeśli rdzeń nerwowy brzuszny jest nadal przyczepiony, odetnij go nożyczkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić haczyk do ust i jednej pary kleszczy, aby usunąć kawałek tkanki łączącej mózg i dyski oczne w części grzbietowej. 
	UWAGA: Jeśli ta tkanka nie zostanie usunięta, dwa krążki oczno-czułkowe będą blisko siebie i mózgu. Krążki oczne nie będą wtedy leżeć płasko na szkiełku nakrywkowym, ponieważ ta tkanka, mózg i dysk oczno-czułkowy utworzą trójkąt.</li>
	<li>Obróć cały kompleks do pozycji brzuszno-górnej. Usuń żarnik, który łączy hak lub dysk z mózgiem. 
	UWAGA: Jeśli filament nie zostanie usunięty, krążek oczno-czułkowy rozpadnie się na dwie części po zdjęciu haczyka na usta.
	<ol>
		<li>Zdejmij haczyk na usta. Uważaj, aby nie uszkodzić krążka oka podczas tego procesu. 
		UWAGA: Tarcza oka jest teraz wolna w pożywce i połączona z mózgiem tylko za pomocą łodygi optycznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montaż
<ol>
	<li>Wysuszyć na powietrzu i zmontować elementy komory za pomocą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 42 mm x 0,17 mm. Przymocuj podwójną warstwę pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym do środka szkiełka nakrywkowego, aby przytrzymać agarozę.</li>
	<li>Zmontuj komorę z szkiełkiem nakrywkowym. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 42 mm x 0,17 mm na akceptorze stolika. Umieść silikonowy O-ring na szkiełku nakrywkowym. Umieść podstawę. Zablokuj szafkę plombującą i załóż pokrywę (Rysunek 1).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś wypreparowany kompleks oko-mózg do środka O-ringu za pomocą mikropipety o pojemności 20 μl z końcówką o pojemności 10-200 μl.</li>
	<li>Usunąć większość pożywki i dodać do próbki 12 μl 0,7% niskotopliwej agarozy (w temperaturze 37 °C). 
	UWAGA: Położenie tarczy oka można zmienić za pomocą kleszczy przed zestaleniem się agarozy. Agaroza zestala się w ciągu 5 minut.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej do środka O-ringu; każdy O-ring może załadować do 4 próbek. Upewnij się, że agaroza jest przyklejona do pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym, aby uniknąć dryfowania próbki. 
		UWAGA: Nie jest konieczne napowietrzanie ani cyrkulacja pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Umieść komorę na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na 30 minut, aby wyrównać temperaturę. Może to zapobiec dryfowaniu osi Z podczas obrazowania.</li>
	<li>Przed długotrwałym obrazowaniem na żywo należy sprawdzić, czy tkanka jest nienaruszona za pomocą różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej.</li>
	<li>Aby uniknąć fototoksyczności, należy użyć lasera o mocy poniżej 2 mW. Do obrazowania należy używać obiektywu 40X.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy stosu Z o wielkości 62 μm w ciągu 12 minut w odstępie optycznym 1 μm. Wykonaj 40 cykli skanowania w ciągu łącznie 10 godzin. Upewnij się, że każdy cykl zawiera 12 minut obrazowania i 3 minuty spoczynku.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, S. M. Imaginal disc development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).</li>
<li>Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744(2016).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Development of Drosophila Melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).</li>
<li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li>
<li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li>
<li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li>
<li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK%2FPnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe%2FAF6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li>
<li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li>
<li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li>
<li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li>
<li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li>
<li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół długoterminowego eksperymentu obrazowania na żywo na dyskach wyobrażonych Drosophila . Spędziliśmy dużo czasu ćwicząc staranne preparowanie, aby uniknąć uszkodzenia dysku i umożliwić przymocowanie dysku blisko szkiełek nakrywkowych. Próbowaliśmy poli-L-lizyny (PLL) i niskotopliwej agarozy, aby utrzymać tkankę; Ostatecznie niskotopliwa agaroza wykazała lepszą zdolność do utrzymywania tkanki. Chociaż w tym artykule wykorzystano tylko krążek oka, aby wykazać normalne występowanie różnicowania fotoreceptorów i rotacji ommatidialnej podczas 10-godzinnego okresu obrazowania na żywo, metodę tę można również zastosować do co najmniej jednego innego dysku, dysku skrzydłowego, jak wykazano w poprzednim badaniu3. Co więcej, przygotowanie pożywki hodowlanej i konfiguracja obrazowania na żywo są proste i nie wymagają napowietrzania ani cyrkulacji pożywki.
Ciągłe obrazowanie na żywo może zapewnić wyraźną sekwencję czasową zdarzeń biologicznych. W naszym wcześniejszym raporcie na temat różnicowania i migracji gleju w krążku oka dostarczyliśmy bezpośredniego dowodu na to, że owijający się glej odróżnia się od istniejącego gleju po migracji do przedniej części krążka oka3. Długotrwała hodowla ex vivo pozwala na specyficzne znakowanie komórek aktywowane laserem, takie jak fotokonwersja białka fluorescencyjnego KAEDE, w celu śledzenia ich zachowań3. Może również pomieścić testowanie substancji chemicznych, które są dodawane bezpośrednio do pożywki hodowlanej; Dzięki temu może być używany jako platforma do badań przesiewowych leków. Ponieważ niektóre dynamiczne procesy zachodzą w ciągu kilku minut lub sekund, wymagana jest wysoka rozdzielczość czasowa. Aby zwiększyć rozdzielczość czasową, dobrym rozwiązaniem może być mikroskopia arkuszowa15,16 lub mikroskopia z wirującym dyskiem17.
Obecna sytuacja kulturowa nie jest idealna. Nie obsługuje wzrostu dysku. Proliferacja komórek jest obsługiwana tylko przez okres do 12 godzin3. Po 12 godzinach w hodowli ex vivo szybkość różnicowania fotoreceptorów zaczyna się zmniejszać3. Może to być spowodowane brakiem niektórych składników odżywczych lub hormonów. Ponieważ główną różnicą w tej pożywce hodowlanej jest wysokie stężenie insuliny, insulina ssaków może częściowo naśladować funkcję endogennych peptydów insulinopodobnych. Dodatek ekstraktu z muchy, trehalozy cukru we krwi owadów i różnych stężeń hormonu linienia 20-hydroksyekdyzonu nie był korzystny3. Jednak 12-18 godzinny okres hodowli jest wystarczający do zbadania wielu procesów rozwojowych. Porównano alternatywne metody hodowli dysków wyobrażeniowych larw3, a nasze warunki hodowli i obrazowania zapewniają najdłuższe okno czasowe i największą przejrzystość obrazowania na żywo. Chociaż dyski w żywych larwach i poczwarkach mogą być obrazowane bezpośrednio 18,19,20,21,22, rozdzielczość i okno czasowe dla obserwacji są ograniczone. Późne krążki larwalne i poczwarkowe mogą być hodowane przez długi czas 23,24, ale krążki ulegają znacznej morfogenezie. Aby wykorzystać płaskie, 2D krążki larwalne, nasza metoda hodowli i obrazowania jest jak dotąd najlepszym rozwiązaniem.

Dyski wyobrażone larw Drosophila były preferowanym systemem eksperymentalnym do badania szerokiej gamy mechanizmów biologicznych. Krążki te wnikają w nabłonek embrionalny i stają się strukturami podobnymi do worków, zbudowanymi przez dwie warstwy nabłonka, nabłonek okołopodialny (PE) i dysk właściwy (DP)1,2. Wyimaginowane komórki dysku namnażają się i stopniowo różnicują w stadiach larwalnych i poczwarkowych, a ostatecznie przekształcają się w struktury dorosłego ciała. Ze względu na płaską i prostą dwuwarstwową strukturę wyimaginowanych dysków, są one łatwe do zaobserwowania po wypreparowaniu z larw. Jednakże, pomimo wielu wysiłków wielu grup, obecne metody długoterminowego hodowania dysków wyobrażeniowych nie są zadowalające. Niedawno opracowaliśmy metodę hodowli, która może utrzymać normalny rozwój wielu dysków wyobrażeniowych przez okres do 18 godzin i która umożliwia obrazowanie na żywo3. Metoda hodowli może wspomagać różnicowanie i migrację komórek, ale może wspierać proliferację komórek tylko przez 7-12 godzin i nie może wspierać wzrostu dysku. Główną różnicą w pożywce hodowlanej jest wysokie stężenie insuliny3. Metoda jest prosta i nie jest wymagane specjalne napowietrzanie ani cyrkulacja medium.
Jednym z najlepiej zbadanych dysków wyobrażeniowych jest dysk oczno-czułkowy. Oko Drosophila składa się z około 800 ommatidiów. Każde ommatidium składa się z ośmiu komórek fotoreceptorowych (R1-R8). W krążku oka larwalnego komórki fotoreceptora różnicują się w wyniku przejścia bruzdy morfogenetycznej (MF), która przebiega przez tarczę oka od tylnej do przedniej4,5. Fotoreceptory w ommatidium różnicują się w sekwencji, zaczynając od R8, a następnie R2/R5, R3/R4, R1/R6 i R76. Ommatydia w grzbietowej i brzusznej połowie tarczy oka podlegają obrotowi o 90° w przeciwnych kierunkach, co skutkuje przeciwną chiralnością7,8. Proces rotacji przebiega w dwóch etapach: po pierwsze, obrót o 45° rozpoczyna się w szóstym rzędzie ommatidia za MF i kończy się w nim; Drugi obrót o 45° jest zakończony mniej więcej w rzędzie 169,10. W badaniu tym wykorzystano rotację ommatydialną, oznaczoną specyficznym dla R3 / 4 mδ0,5-Ga411, aby zademonstrować normalne różnicowanie i dynamikę komórkową, które można zaobserwować za pomocą tej metody w celu hodowli i obrazu na żywo dysku oka.

<table><tbody><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>AMRESCO&nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 42 mm x 0,17 mm&nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila średni&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Insulina Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Komora hodowlana&nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 System do hodowli komórek</td></tr><tr>Obiektyw <td></td><td></td><td>40X</td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Obiektyw Korr&nbsp;</td></tr><tr><td>Szczep muchy: nls. </td><td>GFP Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka drosophila

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Obrazowanie na żywo zapewnia możliwość ciągłego śledzenia dynamicznych procesów komórkowych i rozwojowych w czasie rzeczywistym. Dyski wyobrażeniowe larw Drosophila zostały wykorzystane do badania wielu procesów biologicznych, takich jak proliferacja komórek, różnicowanie, wzrost, migracja, apoptoza, konkurencja, sygnalizacja komórka-komórka i tworzenie granic kompartmentowych. Jednak metody długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo dysków wyobrażeniowych nie były zadowalające, pomimo wielu wysiłków. Niedawno opracowaliśmy metodę długotrwałej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo dysków wyobrażeniowych przez okres do 18 godzin. Oprócz zastosowania wysokiego stężenia insuliny w pożywce hodowlanej, do osadzenia krążka użyto również agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby zapobiec jej dryfowaniu w okresie obrazowania. W niniejszym raporcie jako przykład użyto dysków oczno-czułkowych. Obserwowano ekspresję mδ0,5-Ga4 specyficzną dla fotoreceptora R3/4, aby wykazać, że różnicowanie fotoreceptorów i rotacja ommatidialna mogą być obserwowane podczas 10-godzinnego okresu obrazowania na żywo. Jest to szczegółowy protokół opisujący tę prostą metodę.

W niniejszym przykładzie fotoreceptory R3/R4 zostały znakowane mδ0.5-Ga4 w celu monitorowania różnicowania fotoreceptorów. mδ0.5-Ga4 zapewnia silną ekspresję w R4 i słabszą ekspresję w R31, co czyni go doskonałym markerem dla R3 i R4, a także dla procesu rotacji ommatidiów. W Filmie 1 R3 i R4 zostały znakowane GFP. Na początku 10-godzinnej sesji obrazowania na żywo obecnych było 8 rzędów klastrów ommatidialnych (Rysunek 2A i Film 1), a na koniec sesji było to 14 rzędów klastrów ommatidialnych (Rysunek 2B). Tempo różnicowania ommatidialnego wynosiło 1,67 h na rząd, co jest zbliżone do tempa 1,5-2 h/rząd w dyskach in vivo 7,8,9,10,1,12,13,14. Na podstawie względnych pozycji R3 i R4 stwierdzono, że rotacja ommatidialna wystąpiła w dysku hodowanym ex vivo podczas obrazowania na żywo (Rysunek 2A', A'', B' i B''). Pojedynczy klaster R3/R4 został zaznaczony białą sferą w pierwszej klatce Filmu 2. Na początku oś R3/R4 wydaje się być prostopadła do równika (Rysunek 2C i Film 2). Następnie wydaje się rotować odpowiednio o 15°, 30° i 45° w czasie 3 (Rysunek 2C'), 6 (Rysunek 2C'') i 9 (Rysunek 2C''') h. Dane te sugerują, że metoda ta pozwala na utrzymanie różnicowania fotoreceptorów podczas 10-godzinnego obrazowania na żywo.
<img alt="Widok rozstrzelony zestawu szkiełka przedmiotowego; schemat z opisaniem części: przykrywka, uszczelnienie, podstawa, o-ring." src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schemat montażu komory. Schematyczny rysunek zestawu komory: (1) Umieść deksel z przymocowaną dwuwarstwową uszczelką typu O-ring na odbiorniku stolika. (2) Umieść silikonową uszczelkę typu O-ring na szkiełku nakrywkowe. (3) Umieścić podstawę. (4) Zablokować blokadę uszczelniającą. (5) Nanieś próbkę na środek pierścienia uszczelniającego (O-ring) i nałóż pokrywkę. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Time-lapse mikroskopowy obrazujący dynamikę komórkową z użyciem markerów fluorescencyjnych; schemat rozmieszczenia białek." src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Obrazowanie na żywo różnicowania i rotacji R3/R4. Neurony R3/R4 znakowane mδ0.5-Gal4 wykazujące ekspresję jądrowej formy GFP podczas 10 h obrazowania na żywo. Wszystkie obrazy zostały pobrane z Film 1. (A) Obraz wykonany na początku. (A'-A") Powiększenie obrazu z zaznaczonego ramką obszaru po lewej stronie (A') i prawej (A). (B) Zdjęcie wykonane po zakończeniu 10-godzinnego okresu. (B'-B") Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką po lewej stronie (B') i prawą (B"). (C-C''') Pojedyncza para R3/R4 (oznaczona strzałką w A') jest śledzona w czasie, aby pokazać rotację pary R3/R4. Paski skali = 15 µm, 10 µmi 5 µm odpowiednio w A, B i C. Wszystkie rysunki stanowią projekcje maksymalnej intensywności w osi z. Skala czasu jest podana w formacie h:min. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, zabarwione jądra komórkowe zarodka Drosophila, wykazujące regularny wzór." src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 1"> 
Film 1: <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii konfokalnej fluorescencyjnych komórek; struktury subkomórkowe; analiza dynamiki komórkowej." src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 2"> 
Film 1: <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Ogólnym celem tej metody jest obrazowanie na żywo tarcz imaginalnych, które są popularnymi obiektami doświadczalnymi w badaniach nad szerokim spektrum zjawisk biologicznych, w tym proliferacją, różnicowaniem, apoptozą i konkurencją komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju, takie jak morfologia i migracja komórek w konkretnych tkankach. Główną zaletą tej techniki jest to, że ciągłe obrazowanie pozwala uzyskać więcej informacji niż analiza utrwalonych tkanek, na przykład w zakresie migracji komórek.Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ sekcja i montowanie preparatu są wymagające. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, gdyż etapy rotacji i przenoszenia są trudne do opanowania, a niewłaściwa sekcja prowadzi do niskiej rozdzielczości obrazu. Aby rozpocząć protokół, należy zdezynfekować sprzęt 70% ethanol i pozwolić mu wyschnąć na powietrzu.Następnie wybierz larwę trzeciego stadium z fiolki z muchami i przemyj ją w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby zapobiec kontaminacji z fiolki. Umieść oczyszczoną larwę w jednym mililitrze pożywki w temperaturze pokojowej w dziewięciodoborowej szklanej płytce do nakrapiania, korzystając z mikroskopu stereoskopowego. Chwyć larwę pęsetą w odległości 1/3 od końca tylnego, a drugą pęsetą chwyć haczyk gębowy.Rozciągnij pęsety w przeciwnych kierunkach, aby uwolnić tkanki wewnętrzne. Następnie usuń gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i kutykulę z kompleksu oko-mózg przymocowanego do haka gębowego. Jeśli sznur nerwowy brzuszny jest nadal przyczepiony, odetnij go nożyczkami.Użyj jednej pary pęsety, aby uchwycić hak do otworu gębowego. Za pomocą drugiej pary pęsety usuń tkankę łączącą dyski mózgu i oczu w obszarze grzbietowym. Następnie obróć cały kompleks tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry.Usuń włókno łączące haczyk lub dysk z mózgiem. Następnie usuń haczyk jamny, uważając, aby podczas tego procesu nie uszkodzić dysku oka. Dysk oka znajduje się teraz swobodnie w medium i jest połączony z mózgiem jedynie za pomocą szypuły nerwu wzrokowego.Do środka szkiełka nakrywkowego o wymiarach 42 mm by 0,17 mm przymocuj podwójną warstwę o-ringów, aby utrzymać agarozę. Następnie złóż komorę wraz ze szkiełkiem nakrywkowym. Umieść szkiełko nakrywkowe na akceptorze stolika.Następnie umieść silikonowy pierścień O na szkiełku nakrywce. Potem ustaw podstawę, zablokuj zatrzask uszczelniający i nałóż pokrywę. Używając mikropipety 20 µL z końcówką 10-200 µL, ostrożnie przenieś wypreparowany kompleks oko-mózg na środek pierścienia O.Usunąć większość pożywki i dodać 12 µL 0,7% niskotopiącej agarozy o temperaturze 37 °C do próbki. Ustawić probówkę z agarozy i próbką w pozycji pionowej, aby utrzymać tkankę blisko szkiełka nakrywkowego i zapobiec przesunięciu się próbki. Dodać 1 mL pożywki hodowlanej w temperaturze pokojowej do centrum pierścienia O.Upewnij się, że agaroza przylega do pierścienia O-ring, aby zapobiec przemieszczaniu się próbki. Umieść przygotowaną komorę na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na 30 minut w celu wyrównania temperatury. Przed długotrwałym obrazowaniem na żywo sprawdź, czy tkanka jest nieuszkodzona, wykorzystując mikroskopię kontrastową DIC.Zmień obiektyw na 40x w celu obrazowania. Na koniec wykonaj obrazy w stosie Z o rozmiarze 62 µm w czasie 12 minut, przy odstępie optycznym wynoszącym 1 µm. Przeprowadź 40 cykli skanowania w ciągu łącznie 10 godzin, upewniając się, że każdy cykl obejmuje 12 minut obrazowania i trzy minuty odpoczynku.R3 i R4 zostały znakowane GFP. Na początku 10-godzinnej sesji obrazowania na żywo widocznych było osiem rzędów klastrów ommatidialnych, a na końcu 14 rzędów klastrów ommatidialnych. Na podstawie względnych pozycji R3 i R4 stwierdzono, że w hodowanym ex vivo tarczce doszło do rotacji ommatidialnej podczas obrazowania na żywo.Na początku oś R3/R4 wydaje się być prostopadła do równika. Następnie widać, że obraca się ona o 15 stopni w ciągu trzech godzin, 30 stopni w ciągu sześciu godzin i 45 stopni w ciągu dziewięciu godzin, co sugeruje, że metoda ta pozwala na utrzymanie różnicowania fotoreceptorów podczas 10 godzin obrazowania na żywo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat prawidłowej dyssekcji tarczy oka Drosophila oraz przeprowadzania obrazowania na żywo.

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Metoda Tomato/GFP-FLP/FRT polega na wizualizacji mozaikowych komórek fotoreceptorowych u żywych Drosophila. Może być używany do śledzenia losów poszczególnych komórek fotoreceptorowych w siatkówce przez kilka dni lub tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do badań nad zwyrodnieniami siatkówki i chorobami neurodegeneracyjnymi czy rozwojem komórek fotoreceptorowych.

Metoda pomidorów/GFP-FLP/FRT do obrazowania na żywo mozaikowych dorosłych komórek fotoreceptorowych Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę długoterminowego obrazowania na żywo dysku oka Drosophila w celu badania różnicowania fotoreceptorów i rotacji ommatidiów. Technika umożliwia obserwację przez 10 godzin bez drogiego sprzętu.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Przeglądaj więcej filmów