Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni
24 stycznia 2018
Opisujemy tutaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzonia, który wykorzystuje igły kwarcowe. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Co więcej, mogą być dostosowywane do potrzeb badawczych poprzez spersonalizowane projekty i mogą być ponownie wykorzystywane.
Ogólnym celem tej metodologii jest udoskonalenie protokołu mikroiniekcji mózgu przy użyciu spersonalizowanej igły kwarcowej wielokrotnego użytku, która nie powoduje wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewnia niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak patofizjologia chorób neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych oraz efekty terapii genowej i komórkowej za pomocą wektorów wirusowych i przeszczepów komórkowych. Główną zaletą jest to, że igły te nie powodują żadnych wykrywalnych uszkodzeń tkanek, co zapewnia niezawodne dostarczanie do głębokich obszarów mózgu.
Są ekonomiczne, ponieważ można je czyścić i ponownie używać. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść i wysterylizuj naczynia włosowate kwarcowe, umieszczając je na pięć minut w wodzie destylowanej. Pięć minut w 99% etanolu, a następnie pięć minut w eterze dietylowym.
Następnie pozostaw naczynia włosowate pod maską na co najmniej godzinę do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie przygotuj długie i cienkie igły za pomocą ściągacza laserowego. Następnie umieść igły na szalce Petriego uprzednio oczyszczonej 70% etanolem.
Przykryj naczynie plastikową folią parafinową. Następnie przetnij naczynia włosowate w mikro dysektorze. Mocno przymocuj igłę do stołu mikroskopu i umieść jej końcówkę na środku ekranu komputera.
Na pasku menu kliknij ikonę ołówka i użyj jej, aby narysować znak do przecięcia igły. W funkcji paska bocznego wybierz flagę zawierającą przycisk Start Cut, aby umożliwić laserowi przecięcie wcześniej zaznaczonego miejsca. W razie potrzeby wytnij boczne otwory, rysując znak i powtarzając procedury cięcia bez zmiany położenia igły.
Po przecięciu igły podłącz ją do pompy próżniowej przez plastikową rurkę. Następnie włącz pompę i ręcznie ustaw natężenie przepływu do przodu na trzy mikrolitry na minutę. Następnie odessaj 99% etanol, a następnie wodę destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia spowodowane cięciem.
Następnie ponownie odessaj 99% etanol, aby ułatwić suszenie. Następnie należy przechowywać igły na odpowiednio przykrytej szalce Petriego do dnia zabiegu. Aby ponownie użyć igieł, pod koniec eksperymentu wyczyść je odpowiednimi detergentami i 70% etanolem, aby usunąć wstrzyknięty roztwór i ewentualne pozostałości tkanek.
W razie potrzeby igły te można nawet ugotować w dedykowanych szklanych słoikach wypełnionych wodą destylowaną. W tym kroku wybierz menu ustawień, aby skalibrować pompę zgodnie ze średnicą na objętość strzykawki do mikroiniekcji. I ustaw natężenie przepływu na 0,3 mikrolitra na minutę.
Następnie napełnij 10-mililitrową strzykawkę sterylną wodą. I użyj go do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji i zestawu części zespołu wtryskowego do ręcznej pompy do mikroiniekcji. Następnie podłącz igłę do zestawu ręcznej pompy do mikroiniekcji.
Odłączyć 10-mililitrową strzykawkę od strzykawki do mikroiniekcji, powoli popychając tłok, aby pozostawić kroplę wody w górnej części strzykawki do mikroiniekcji. Następnie włożyć tłok do strzykawki do mikroiniekcji. Teraz podłącz strzykawkę do mikroiniekcji do pompy i ustaw natężenie przepływu na 0,3 mikrolitra na minutę.
Następnie zmień natężenie przepływu na 0,1 mikrolitra na minutę i rozpocznij zabieg chirurgiczny. Aby wykonać operację, ogol głowę zwierzęcia i wyczyść ją wacikiem nasączonym alkoholem. Następnie umieść szczura w ramce stereotaktycznej.
Wykonaj podłużne nacięcie nad czaszką za pomocą wysterylizowanego skalpela. Bądź delikatny, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Następnie otwórz skórę głowy za pomocą płaskiej szpatułki i przyłóż klipsy chirurgiczne do płatków skóry, aby pozostała otwarta.
Bardzo delikatnie odłącz okostną, aby odsłonić bregmę i obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona igła. Następnie zamontuj ramię na ramie stereotaktycznej i przesuń końcówkę igły tuż nad bregmę, zwracając uwagę, aby nie złamać jej końcówki. Opisz przednio-tylne i przyśrodkowe współrzędne boczne bregmy i przesuń igłę do żądanych współrzędnych.
Następnie opuść igłę, aż jej czubek prawie dotknie czaszki, zaznaczając miejsce wiercenia po lekkim podniesieniu ramienia stereotaktycznego. Wywierć czaszkę w zaznaczonym miejscu, uważając, aby nie uszkodzić opon mózgowych i mózgu. Następnie wytnij mały kawałek plastikowej folii parafinowej i umieść go na czaszce.
Za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów przygotuj kroplę roztworu i nałóż go na plastikową folię parafinową. Zatrzymać pompę, lekko odsunąć popychacz pompy i wytworzyć mały pęcherzyk powietrza w kapilarze, delikatnie pociągając za tłok strzykawki do mikroiniekcji. Opuścić końcówkę igły, aż dotrze do kropli.
Pobrać próbkę, bardzo powoli pociągając za tłok strzykawki do mikroiniekcji, unikając tworzenia się pęcherzyków. Wymień popychacz pompy w kontakcie z tłokiem i włącz pompę przy natężeniu przepływu 0,3 mikrolitra na minutę. Następnie poczekaj, aż utworzy się kropla, zanim przejdziesz do następnego kroku.
Następnie zmniejsz przepływ do 0,1 mikrolitra na minutę. Naciąć oponę twardą igłą ze skośną końcówką ze stali nierdzewnej i powoli opuść igłę, aby weszła do tkanki mózgowej. Po osiągnięciu żądanej pozycji zejdź o dodatkowe 0,1 milimetra, a następnie zatrzymaj pompę.
Podnieś ramię stereostatyczne o 0,1 milimetra i ponownie uruchom pompę z prędkością 0,3 mikrolitra na minutę. Następnie uruchom minutnik i wstrzyknięcie. Należy monitorować ruch pęcherzyków podczas wstrzykiwania.
Na koniec zatrzymaj pompę i odczekaj pięć minut, zanim powoli wyjmiesz igłę. Gdy igła kwarcowa zostanie całkowicie usunięta, ponownie uruchom pompę i sprawdź, czy na końcu igły nie tworzy się kropla. Następnie uszczelnij otwór w powierzchni czaszki woskiem kostnym.
Usuń klipsy homeostatyczne i zszyj skórę głowy. Pokryj obszar wokół rany kremem z antybiotykiem i włóż zwierzę z powrotem do klatki domowej. Są to ośmiomikrometrowe przekroje koronalne mózgu szczura na poziomie prążkowia.
Ten obraz przedstawia uszkodzenia powstałe w wyniku wstrzyknięcia dwóch mikrolitrów ACSF przy użyciu igły ze stali nierdzewnej o średnicy 26 mm. I odwrotnie, prążkowie wstrzyknięte igłą kwarcową nie wykazało żadnych wykrywalnych uszkodzeń. Te inne obrazy pokazują uszkodzenia wywołane przez dwie igły na poziomie grzbietowego hipokampa.
Ale igła kwarcowa nie spowodowała żadnych wykrywalnych uszkodzeń. Udane wstrzyknięcia za pomocą obu igieł wykazały dystrybucja błękitu trypanowego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po tych procedurach wszystko, co ma znaczenie, takie jak dodatkowe operacje, może zostać wykonane, aby odpowiedzieć na różne pytania, takie jak efekt wywołany przez lek. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania wpływu toksyn i leków, a ostatnio produktów terapii genowej i komórkowej na modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać mikroiniekcje w głębsze obszary mózgu bez żadnych wykrywalnych zmian za pomocą spersonalizowanych igieł kwarcowych.
Nie zapominaj, że używanie odczynników i/lub patogenów wypreparowanych laserowo może być bardzo niebezpieczne. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak procedury bezpieczeństwa lasera i środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia udoskonalony protokół mikroiniekcji do mózgu z wykorzystaniem spersonalizowanych, wielorazowych igieł kwarcowych. Igły te minimalizują uszkodzenia tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie substancji do głębokich obszarów mózgu, co czyni je odpowiednimi do różnorodnych zastosowań w neuronauce.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki mikroiniekcji
- Choroby neurodegeneracyjne
Wprowadzenie
- Mikroiniekcja ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji mózgu.
- Tradycyjne metody mogą powodować uszkodzenia tkanek.
- Igły kwarcowe stanowią rozwiązanie o minimalnym wpływie na tkankę.
- Konstrukcje wielorazowego użytku zwiększają efektywność kosztową.
Cel badania
- Opracowanie bezpiecznego i skutecznego protokołu mikroiniekcji.
- Ułatwienie badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi i psychiatrycznymi.
- Udoskonalenie metod dostarczania w ramach terapii genowej i komórkowej.
Zastosowane metody
- Czyszczenie i sterylizacja kapilar kwarcowych.
- Stosowanie wody destylowanej, etanolu i eteru dietylowego do sterylizacji.
- Mikroiniekcje do obszarów mózgu gryzoni.
- Ocena uszkodzeń tkanki po iniekcji.
Główne wyniki
- Igły kwarcowe nie spowodowały wykrywalnych uszkodzeń tkanki.
- Osiągnięto niezawodne dostarczanie substancji do głębokich obszarów mózgu.
- Rozwiązanie kosztowo efektywne dzięki możliwości ponownego użycia.
- Potencjał do poszerzenia wiedzy na temat różnych schorzeń neurologicznych.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa bezpieczeństwo i skuteczność mikroiniekcji do mózgu.
- Spersonalizowane projekty mogą być dostosowane do konkretnych potrzeb badawczych.
- Metoda ta może mieć znaczący wpływ na badania z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spersonalizowane igły kwarcowe do mikroiniekcji w mózg gryzoni rozwiązują krytyczny problem w przedklinicznej neuronauce, umożliwiając precyzyjne, małoinwazyjne dostarczanie związków, komórek lub terapii genowych do głębokich obszarów mózgu. Innowacja ta ogranicza uszkodzenia tkanek i zwiększa powtarzalność badań, wspierając badania translacyjne oraz walidację celów w modelach chorób neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych. Podejście to oferuje skalowalne i kosztowo efektywne rozwiązania dla korporacyjnych rurociągów badawczo-rozwojowych skoncentrowanych na terapiach OUN.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę szlaków neurobiologicznych w obszarach mózgu istotnych dla przebiegu choroby.
- Ogranicza zakłócające uszkodzenia tkanek, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego i funkcjonalną walidację celu.
- Ułatwia niezawodne dostarczanie terapii genowych, komórkowych lub małocząsteczkowych w celu weryfikacji hipotez.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celów w OUN na wczesnym etapie badań.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne systemy mikroiniekcji do dostarczania związków lub komórek in vivo.
- Wspiera standaryzację parametrów wstrzykiwania oraz ilościową ocenę dokładności dostarczania.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie igieł o dostosowywalnych właściwościach dla zróżnicowanych potrzeb badawczych.
- Poprawia gotowość do przesiewania kandydatów na terapeutyki celowane w ośrodkowy układ nerwowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla danej choroby modelami zwierzęcymi w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez minimalizację artefaktów proceduralnych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów badawczych nad OUN poprzez ograniczanie niepewności biologicznej na późnych etapach.
- Umożliwia rzetelną ocenę dostarczania terapii genowych i komórkowych in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z ciągiem działań od odkrywania do badań przedklinicznych w opracowywaniu leków na OUN, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i walidację translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników neuroaktywnych i modulacji szlaków in vivo.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki mikrowstrzykiwań do badań porównawczych.
- Analityka: Umożliwia ocenę precyzji wstrzyknięcia oraz integralności tkanki po podaniu substancji.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez umożliwienie niezawodnego podawania substancji w modelach chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, konfigurowalną platformę do ciągłych badań i rozwoju w obszarze OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury mikroiniekcji i wspiera skalowalne, kosztowo efektywne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go i redukuje ryzyko niepowodzeń w późnych fazach rozwoju w portfolio OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów OUN z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej i technikach mikroiniekcji.
- Wymagany jest dostęp do wyciągaczy laserowych, mikrodisektorów oraz skalibrowanych pomp do mikroiniekcji.
- Konieczne jest stosowanie rygorystycznych protokołów czyszczenia i sterylizacji w przypadku ponownego użycia igieł.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli gryzoni i współrzędnych iniekcji pod warunkiem odpowiedniej kalibracji.
- Niezbędne jest przestrzeganie środków ostrożności podczas pracy z odczynnikami, patogenami lub urządzeniami laserowymi.
