Name: Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzoni przy użyciu spersonalizowanych igieł kwarcowych, które minimalizują uszkodzenia tkanek i zapewniają precyzyjne dostarczanie substancji do głębokich regionów mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem ze Wspólnoty Europejskiej [FP7-PEOPLE-2011-IAPP project 285827 (EPIXCHANGE)].

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu w Ferrarze ds. Eksperymentów na Zwierzętach oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia. Wytyczne ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments11) są przestrzegane.
1. Przygotowanie igieł kwarcowych
<ol>
	<li>Oczyść i wysterylizuj kapilary kwarcowe (patrz Tabela materiałów), umieszczając je na 5 minut w wodzie destylowanej, 5 minut w etanolu 99% i 5 minut w eterze dietylowym.</li>
	<li>Pozostaw naczynka pod maską na co najmniej 1 godzinę, aby całkowicie wyschły.</li>
	<li>Igły należy przygotować za pomocą ściągacza laserowego zgodnie z parametrami pozwalającymi na wyprodukowanie odpowiednio długiej, odpowiednio cienkiej igły, w zależności od indywidualnych potrzeb. 
	UWAGA: Używamy ściągacza laserowego (patrz Tabela materiałów). Użyj programu z dwiema liniami do ciągnięcia. Pierwsza linia wykorzystuje dużą moc, największą długość skanowania (odpowiadającą WARTOŚCI FILAMENTÓW) i brak siły ciągnącej. Ta kombinacja parametrów prowadzi do stopienia największej części kapilary przy najmniejszej prędkości rozciągania, co pozwala na ukształtowanie długiej igły o dużym rozmiarze wewnętrznym/zewnętrznym i zmniejszonym trzpieniu. W ten sposób igła zachowuje wysoką odporność mechaniczną i szeroką średnicę wewnętrzną, która umożliwia przejście komórek macierzystych lub cząstek wirusa bez zapychania. Prędkość i opóźnienie tej linii programu powinny zatrzymać wydłużenie kapilary, zanim końcówka stanie się zbyt mała i długa, tracąc wymagane właściwości mechaniczne i kształtowe. Druga linia programu ciągnącego jest wykonywana automatycznie, gdy kwarc ostygnie (5 s). Parametry mocy, filamentu i siły ciągnącej są funkcjonalne, aby przeciąć końcówkę o jak najkrótszej długości końcówki i stromym trzpieniu, unikając rozdzielenia dwóch igieł przy zerwaniu końcówki. Rutynowo z naszym sprzętem używamy: (a) Linia 1 = moc 990, żarnik 5, prędkość 130, opóźnienie 110, ciągnięcie 0; (b) Linia 2 = moc 970, żarnik 3, prędkość 0, opóźnienie 70, pociągnięcie 0.</li>
	<li>Umieść igły na szalce Petriego uprzednio oczyszczonej etanolem 70%.
	<ol>
		<li>Przykryj naczynie plastikową folią parafinową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciąć naczynia włosowate w mikrodyssektorium.
	<ol>
		<li>Podczas rozruchu pozwól laserowi uruchomić proces autokalibracji w celu sprawdzenia mocy i dostarczonej energii. Następnie ustaw parametry cięcia. 
		UWAGA: Stosujemy mikrodyssektor (patrz Tabela Materiałów) i następujące parametry: moc lasera energia impulsu (63 μJ), średnica wiązki laserowej 20% maksymalnej apertury (maksymalna apertura: 1,0 μm), oraz prędkość cięcia 10% maksymalnej prędkości (maksymalna prędkość: 30 μm/s).</li>
		<li>Mocno przymocuj igłę do stołu mikroskopu i umieść jej końcówkę na środku ekranu komputera.</li>
		<li>Na pasku menu kliknij ikonę ołówka i użyj jej, aby narysować znak do laserowego cięcia igły. 
		UWAGA: Cięcie powinno odbywać się pod kątem około 45° w stosunku do powierzchni igły.</li>
		<li>Na pasku bocznym należy wybrać flagę zawierającą przycisk "START CUT", aby umożliwić laserowi przecięcie wcześniej zaznaczonego miejsca.</li>
		<li>W razie potrzeby wytnij boczny otwór(y), powtarzając procedury opisane w 1.5.2-3; nie ma potrzeby zmiany położenia igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie po cięciu.
	<ol>
		<li>Podłącz igłę do pompy próżniowej przez plastikową rurkę.</li>
		<li>Włącz pompę i ręcznie ustaw natężenie przepływu do przodu na umiarkowaną prędkość (3 μl/min).</li>
		<li>Najpierw odessaj 99% etanol, a następnie wodę destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia spowodowane cięciem.</li>
		<li>Ponownie odessać 99% etanolu, aby ułatwić suszenie. 
		UWAGA: Każdy krok powinien trwać co najmniej 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Igły należy przechowywać na odpowiednio przykrytej szalce Petriego do dnia zabiegu.</li>
	<li>Igły mogą być ponownie użyte; na koniec eksperymentu oczyścić je wybielaczem i etanolem, aby usunąć roztwór i ewentualne pozostałości tkanek. Aby uzyskać pełniejsze czyszczenie, umieść igły w słoiku do przechowywania mikropipet końcówką skierowaną w dół, napełnij słoik wodą destylowaną, aż końcówki zostaną przykryte, gotuj przez 1,5 minuty, aby usunąć resztki tkanki, a następnie umyj etanolem.</li>
</ol>
2. Procedura
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi pompy, wybierz menu ustawień, aby skalibrować pompę zgodnie ze średnicą/objętością strzykawki do mikroiniekcji i ustaw natężenie przepływu na 0,3 μl/min.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml (wyposażoną w igłę (np. igłę Hamiltona, 30 G) i krótką probówkę z politetrafluoroetylenu) sterylną wodą i użyj jej do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji (po bardzo ostrożnym wyjęciu tłoka) oraz zestawu części zespołu wtryskowego do ręcznej pompy do mikroiniekcji (MMP). 
	UWAGA: Zestaw MMP służy do bezpiecznego zamocowania igły w ramie stereotaktycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). W skład zestawu wchodzą: rurka z politetrafluoroetylenu, mufa typu luer-to-tubing, uchwyt na pipety oraz uszczelki do pipet o różnych średnicach zewnętrznych.</li>
	<li>Podłączyć igłę do zestawu MMP.
	<ol>
		<li>Przepłukać więcej wody przez strzykawkę o pojemności 10 ml i sprawdzić, czy woda wypływa z igły. 
		UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki powietrza z wnętrza systemu, powtarzając kroki napełniania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml od strzykawki do mikroiniekcji, powoli popychając tłok, aby pozostawić kroplę wody w górnej części strzykawki do mikroiniekcji. Włożyć tłok do strzykawki do mikroiniekcji.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę do mikroiniekcji do pompy i ustawić natężenie przepływu na 0,3 μl/min. 
	UWAGA: Poczekaj, aż kropla zacznie wyciekać z końcówki igły, a następnie pozwól jej odejść na kolejne 3 minuty.</li>
	<li>Ustaw przepływ na 0,1 μl/min i rozpocznij zabieg chirurgiczny. Pompa powinna pracować podczas wykonywania zabiegu. 
	UWAGA: Do eksperymentów opisanych w tym artykule używamy samców szczurów Sprague Dawley o wadze 300 g (w wieku 3 miesięcy). Procedura ta ma jednak zastosowanie do innych gatunków, w szczególności myszy.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie ogólne metodą zatwierdzoną przez lokalne przepisy. 
	UWAGA: Używamy mieszanki iniekcji dootrzewnowej (i.p.) 85 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny przez 20-50 minut znieczulenia. Ważne jest, aby użyć szczypania ogona i/lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone. Poziom znieczulenia i podstawowe parametry życiowe są oceniane przed rozpoczęciem operacji i monitorowane co 10 minut podczas wykonywania operacji. Temperatura ciała zwierzęcia jest utrzymywana na stałym poziomie przed, w trakcie i po zabiegach chirurgicznych za pomocą poduszki grzewczej z recyrkulacją wody. Zwierzęta są monitorowane do czasu całkowitego wyzdrowienia (np. są wyprostowane i poruszają się). Ponadto zwierzęta otrzymują leki przeciwbólowe (tramadol, 5–7 mg/kg i.p.) po operacji co 24 godziny przez trzy dni.
	<ol>
		<li>Ogolić głowę zwierzęcia i odpowiednio przygotować miejsce operowane do operacji aseptycznej. Wykonaj dwuetapowy peeling roztworem na bazie jodu (Betadine), a następnie 70% etanolem. Ponadto, aby utrzymać aseptykę, owiń miejsce operacji serwetą chirurgiczną (w filmie zostało pominięte w celach demonstracyjnych). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szczura w ramce stereotaktycznej nad kocem grzewczym z recyrkulacją wody. Aby zapewnić dodatkową ulgę w bólu, w miejscu zabiegu należy zastosować 0,5% roztwór lidokainy (nie przekraczać 7 mg/kg). Wstępnie wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora perełkowego lub płynnej dezynfekcji na zimno, zanurzając sprzęt w 2% aldehydzie glutarowym i 7,05% fenolu (sporodycynie lub Cidex), a następnie spłucz sterylną wodą lub solą fizjologiczną. Dezynfekcja musi być wykonywana nawet między zabiegami. Wykonaj podłużne nacięcie nad czaszką za pomocą wysterylizowanego skalpela. Bądź delikatny, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Otwórz skórę głowy za pomocą płaskiej szpatułki i przyłóż klipsy chirurgiczne do płatów skóry, aby pozostała otwarta. Bardzo delikatnie odłącz okostną, aby odsłonić bregmę i obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona igła.</li>
	<li>Zamontuj ramię na ramie stereotaktycznej (podczas gdy przepływ jest w toku) i przesuń końcówkę igły dokładnie na wierzch bregmy, zwracając uwagę, aby nie złamać jej końcówki. Opisz współrzędne przednio-tylne i środkowo-boczne bregmy i przetłumacz na żądane współrzędne. Prowadzony przez stereomikroskop opuść igłę, aż jej końcówka prawie dotknie czaszki, zaznacz miejsce wiercenia po lekkim podniesieniu ramienia stereotaktycznego.</li>
	<li>Wywiercić (końcówka wiertła Ø: 0,8 mm; prędkość wiercenia: 1 000 obr./min) czaszkę w zaznaczonym miejscu. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić opony twardej podczas wiercenia. Podczas wiercenia należy wlać sterylną sól fizjologiczną, aby uniknąć uszkodzenia kości i martwicy.</li>
	<li>Wytnij mały kawałek plastikowej folii parafinowej i umieść go na czaszce. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl przygotować kroplę roztworu do wstrzyknięcia na plastikową folię parafinową. Zatrzymać pompę, lekko odsunąć popychacz pompy i wytworzyć mały pęcherzyk powietrza w kapilarze, delikatnie pociągając za tłok strzykawki do mikroiniekcji.</li>
	<li>Opuść ramię stereotaktyczne, aż końcówka igły dotrze do kropli. Pobrać próbkę, pociągając (bardzo powoli) za tłok strzykawki do mikroiniekcji, unikając tworzenia się pęcherzyków. Wymienić popychacz pompy w kontakcie z tłokiem i włączyć pompę przy natężeniu przepływu 0,3 μl/min. Poczekaj, aż utworzy się kropla (kilka minut), zanim przejdziesz do następnego kroku. 
	UWAGA: W niniejszym przykładowym eksperymencie sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) został wlany do prążkowia (AP: +1,5, ML: ±2,7; DV: -5,0) i w grzbietowym hipokampie (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3,5; w mm od opony twardej), 2 μl/miejsce. Aby ułatwić porównanie między dwiema metodami wstrzykiwania, każdy obszar mózgu podawano za pomocą igły kwarcowej w jednej półkuli i końcówki 26 G lub igły ze stali nierdzewnej ze skośną końcówką 30 G w drugiej.</li>
	<li>Zmniejsz przepływ do 0,1 μl/min, nacinaj oponę twardą igłą ze skośną końcówką ze stali nierdzewnej i powoli opuść ramię stereotaktyczne na osi grzbietowo-brzusznej, wchodząc do tkanki mózgowej. Po osiągnięciu żądanej pozycji należy zejść o dodatkowe 0,1 mm, zatrzymać pompę, podnieść ramię stereotaktyczne o 0,1 mm i ponownie uruchomić pompę przy przepływie do 0,3 μL/min. 
	UWAGA: Powodem utrzymywania powolnego przepływu podczas opuszczania igły jest zapewnienie nadciśnienia, które pozwala uniknąć penetracji małych fragmentów tkanki w samej igle. Takie zdarzenie zablokowałoby końcówkę, pogarszając dostarczanie roztworu. Ponieważ natężenie przepływu jest bardzo małe podczas opuszczania igły, a prędkość obniżania wynosi około 10 s/mm, oznacza to, że ilości roztworu, które pozostają wzdłuż ścieżki igły, są znikome w porównaniu z tymi, które są wstrzykiwane w miejscu docelowym. Tego środka ostrożności można uniknąć w przypadku używania igieł z bocznymi otworami.</li>
	<li>Uruchom timer i odczekaj wymagany czas w zależności od żądanej objętości do wstrzyknięcia (na przykład 6 min 40 s w przypadku wstrzykiwania 2 μl). Należy monitorować ruch pęcherzyków podczas wstrzykiwania. Na koniec zatrzymaj pompę i odczekaj 5 minut przed powolnym wyjęciem igły. Gdy igła kwarcowa zostanie całkowicie usunięta, ponownie uruchom pompę i sprawdź, czy na końcu igły nie tworzy się kropla.</li>
	<li>Uszczelnij otwór w powierzchni czaszki woskiem kostnym, usuń klipsy hemostatyczne i zszyj skórę głowy, pokryj obszar wokół rany kremem z antybiotykiem (np. neosporin) i umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej. 
	UWAGA: Zgodnie z protokołem eutanazji zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję etyczną, w eksperymentach opisanych w tym artykule, zwierzęta zostały głęboko znieczulone zastrzykiem dożylnym 43 mg/kg ketaminy i 7 mg/kg ksylazyny, a następnie pozbawiono im głowy. Mózgi usunięto, zamocowano w formalinie na 48 godzin i zatopiono w parafinie. Wycinki koronalne (8 μm) mózgu przecięto za pomocą mikrotomu.</li>
</ol>

<ol><li>Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li>
<li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li>
<li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+pay+attention%3A+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation%2C+diurnality%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li>
<li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+delivery+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li>
<li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+RevNeurol%22%5BJournal%5D)">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li>
<li>Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin%2C+Quinolinic+Acid%2C+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li>
<li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li>
<li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li>
<li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li>
<li>Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html">http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html</a> (2017).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+research%3A+reporting+in+vivo+experiments%3A+the+ARRIVE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li>
<li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic%3A+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika opisana w tym artykule spełnia nakreślone we Wstępie potrzeby optymalizacji mikroiniekcji wykonywanych w różnych celach12. Opisane tutaj igły redukują uszkodzenia do minimalnego, zasadniczo niewykrywalnego poziomu; W przeciwieństwie do igieł szklanych (które mają skłonność do zginania), igły kwarcowe są sztywne i zapewniają niezawodne uderzenie w pożądany obszar mózgu nawet w głębokich współrzędnych. Co więcej, boczny otwór zapewnia dostarczanie roztworu nawet wtedy, gdy ...

Mikrozastrzyki są używane od dawna do dostarczania farmakologicznie aktywnych związków do modulowania aktywności neuronalnej w określonych obszarach mózgu. Ponadto były one używane do wstrzykiwania toksyn w pobliżu określonych populacji neuronów, do naśladowania zdarzeń neurodegeneracyjnych charakterystycznych dla niektórych chorób, na przykład 6-hydroksy-dopaminy w układzie dopaminy nigrostriatal w celu naśladowania choroby Parkinsona1,2 lub immunotoksyny 192 IgG saporyny w celu uszkodzenia układu cholinergicznego3. Ostatnio procedury mikroiniekcji są stosowane do dostarczania wektorów wirusowych lub przeszczepów komórek do terapii genowej lub komórkowej eksperymentalnych zaburzeń mózgu4,5.
Klasyczny rodzaj igieł używanych w tych badaniach jest wykonany ze stali nierdzewnej. Chociaż są łatwe i praktyczne w użyciu, stalowe igły mają wiele problemów6: są stosunkowo duże i mogą powodować uszkodzenie tkanek, z wyciekiem bariery krew-mózg i aktywacją astrocytów; Co więcej, mogą wytwarzać rdzenie tkanki mózgowej, która dostaje się do igły, tworząc przeszkodę lub nawet całkowicie uniemożliwiając przepływ pożądanego roztworu. Ostatnio wprowadzono do użytku igły szklane przygotowywane ad hoc z naczyń włosowatych7,8. Nie powodują one znacznych uszkodzeń tkanek ani aktywacji astrocytów, ale są stosunkowo elastyczne i mogą się wyginać po wprowadzeniu do głębokich struktur, zmniejszając dokładność lokalizacji (obserwacje osobiste).
Istnieje zatem potrzeba jak największego zmniejszenia uszkodzeń (zwłaszcza podczas przeprowadzania eksperymentów w celu leczenia uszkodzeń) przy jednoczesnym zwiększeniu dokładności i powtarzalności (tj. upewnienia się, że wszystkie rozwiązania zostały dostarczone i zapewnienia poprawnej lokalizacji). Ponadto pożądane byłoby stosowanie różnych konstrukcji igieł w celu zapewnienia optymalnego rozprowadzenia wstrzykiwanego roztworu w obszarach mózgu o różnej geometrii. W tym artykule opisujemy protokół przygotowania i użycia igieł kwarcowych do mikroiniekcji w mózg gryzonia. Ze względu na wysoką temperaturę topnienia kapilar kwarcowych nie można naciągnąć na konwencjonalny ściągacz i dlatego nie były używane w przeszłości do generowania igieł. Kwarc ma jednak kilka ważnych zalet w porównaniu ze szkłem, w szczególności wysoką sztywność i odporność na pękanie9. Ze względu na swoją sztywność igły kwarcowe idealnie nadają się do wstrzykiwań w brzuszne obszary mózgu. Ze względu na ich wysoką odporność na pękanie, mogą być modelowane tak, aby zawierały wiele otworów, uzyskując projekty, które mogą okazać się najbardziej skuteczne nawet w przypadku celowania w obszary mózgu o złożonej geometrii10.

<table><tbody><tr><td>Kapilary kwarcowe</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>USA Q100-50-10</td><td>Bez ściągacza filamentu</td></tr> Słoik do przechowywania mikropipet <tr><td></td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodysektor laserowy</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&Yuml; tzerbach, Niemcy</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do mikroinfuzji</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny zestaw pompy do mikroiniekcji</td><td>WPI</td><td>Pozycja#: MMP-KIT</td><td>Zestaw umożliwiający bezpieczne zamontowanie mikropipet do ramy stereotaktycznej</td></tr><tr><td>Wiertarka precyzyjna</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Wał napędowy z łożyskiem kulkowym o zmiennej prędkości</td></tr><tr><td>Sztuczny mózgowy Igły do płynu mózgowo-rdzeniowego</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>26 g i 30 g skośne</td><td>Hamilton</td><td>26 g: 19138-U 30 g skos: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Niemcy</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Mikrozastrzyki były używane od dawna do dostarczania leków lub toksyn do określonych obszarów mózgu, a ostatnio były używane do dostarczania produktów terapii genowej lub komórkowej. Niestety, obecne techniki mikroiniekcji wykorzystują stalowe lub szklane igły, które są nieoptymalne z wielu powodów: w szczególności stalowe igły mogą powodować uszkodzenie tkanek, a szklane igły mogą się wyginać, gdy są opuszczane głęboko w mózg, omijając obszar docelowy. W tym artykule opisujemy protokół przygotowania i używania igieł kwarcowych, które łączą w sobie szereg przydatnych funkcji. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i, będąc bardzo sztywne, zapewniają niezawodne dostarczanie w pożądanym obszarze mózgu, nawet przy użyciu głębokich współrzędnych. Ponadto istnieje możliwość personalizacji projektu igły poprzez wykonanie wielu otworów o pożądanej średnicy. Wiele otworów ułatwia wstrzykiwanie dużych ilości roztworu na większą powierzchnię, podczas gdy duże otwory ułatwiają wstrzykiwanie komórek. Ponadto te igły kwarcowe można czyścić i ponownie używać, dzięki czemu procedura staje się opłacalna.

Porównaliśmy uszkodzenia wywołane bezpośrednią mikroiniekcją w grzbietowym hipokampie i prążkowiu szczura z użyciem igły kwarcowej (średnica zewnętrzna końcówki 60 µM; jeden otwór boczny o średnicy 20 µM; typ C, Rycina 1) w porównaniu z dwiema klasycznymi igłami ze stali nierdzewnej: 26 G o tępym zakończeniu oraz 30 G o ściętym zakończeniu. W tym celu w prawym i lewym grzbietowym hipokampie oraz prążkowiu wstrzykniemy 2 µL aCSF, stosując odpowiednio igłę kwar...

Opisujemy tutaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzonia, który wykorzystuje igły kwarcowe. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Co więcej, mogą być dostosowywane do potrzeb badawczych poprzez spersonalizowane projekty i mogą być ponownie wykorzystywane.

Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Ogólnym celem tej metodologii jest dopracowanie protokołu mikroiniekcji do mózgu z wykorzystaniem spersonalizowanych, wielorazowych igieł kwarcowych, które nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanki i zapewniają niezawodne dostarczanie substancji nawet do głębokich obszarów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak patofizjologia chorób neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych oraz efekty terapii genowej i komórkowej za pomocą wektorów wirusowych i przeszczepów komórkowych. Główną zaletą jest to, że igły te nie powodują żadnych wykrywalnych uszkodzeń tkanki, co zapewnia niezawodne dostarczanie substancji do głębokich obszarów mózgu.Są one efektywne kosztowo, ponieważ można je czyścić i ponownie wykorzystywać. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić i wysterylizować kapilary kwarcowe, umieszczając je na pięć minut w wodzie destylowanej. Następnie należy je umieścić na pięć minut w 99% etanolu, a potem przez pięć minut w eterze dietylowym.Następnie pozostaw kapilary pod wyciągiem na co najmniej jedną godzinę do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie przygotuj długie i cienkie igły za pomocą laserowego wyciągacza. Następnie umieść igły w szalce Petriego uprzednio oczyszczonej 70% ethanol.Przykryj szalkę plastikową folią parafinową. Następnie utnij kapilary za pomocą mikrodissektora. Mocno przymocuj igłę do stolika mikroskopu i ustaw jej końcówkę w centrum ekranu komputera.Na pasku menu kliknij ikonę ołówka i użyj jej do zaznaczenia miejsca, w którym igła ma zostać przecięta. W funkcji paska bocznego wybierz flagę zawierającą przycisk Start Cut, aby umożliwić laserowi przecięcie wcześniej zaznaczonego punktu. W razie potrzeby wykonaj nacięcia otworów bocznych, rysując znak i powtarzając procedurę cięcia bez zmiany położenia igły.Po odcięciu igły należy podłączyć ją do pompy próżniowej za pomocą plastikowej rurki. Następnie należy włączyć pompę i ręcznie ustawić prędkość przepływu w przód na 3 µL/min. Po tym czasie należy zasysać 99% etanol, a następnie wodę destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia powstałe podczas cięcia.Następnie ponownie odessaj 99%ethanol, aby ułatwić suszenie. Po tym czasie przechowuj igły w szczelnie zamkniętej szalce Petriego do dnia operacji. Aby ponownie wykorzystać igły, po zakończeniu eksperymentu należy oczyścić je odpowiednimi detergentami oraz 70%ethanol, aby usunąć wstrzyknięty roztwór i ewentualne pozostałości tkanek.W razie potrzeby igły te można nawet zagotować w specjalnych słoikach szklanych wypełnionych wodą destylowaną. Na tym etapie należy wybrać menu ustawień, aby skalibrować pompę zgodnie z wymiarami objętościowymi strzykawki do mikroiniekcji. Następnie należy ustawić szybkość przepływu na 0.3 µL/min.Następnie napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml wodą sterylną. Użyć jej do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji oraz zestawu części montażowych do ręcznej pompy do mikroiniekcji. Po tym czasie połączyć igłę z zestawem ręcznej pompy do mikroiniekcji.Odłącz strzykawkę 10 ml od strzykawki do mikroiniekcji, powoli pchając tłok, aby pozostawić kroplę wody w górnej części strzykawki do mikroiniekcji. Następnie włóż tłok do strzykawki do mikroiniekcji. Teraz podłącz strzykawkę do mikroiniekcji do pompy i ustaw prędkość przepływu na 0,3 µL/min.Następnie zmień szybkość przepływu na 0,1 µL/min i rozpocznij procedurę chirurgiczną. Aby przeprowadzić operację, ogol głowę zwierzęcia i oczyść ją chusteczką nasączoną alkoholem. Następnie umieść szczura w aparacie stereotaktycznym.Za pomocą wysterylizowanego skalpela wykonaj cięcie wzdłużne na czaszce. Postępuj ostrożnie, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Następnie rozchyl skórę głowy za pomocą płaskiej szpatułki i załóż klipsy chirurgiczne na płaty skóry, aby utrzymać ją w pozycji otwartej.Bardzo delikatnie odczep okostną, aby odsłonić bregma oraz obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona igła. Następnie zamocuj ramię w ramie stereotaksycznej i przesuń końcówkę igły bezpośrednio nad bregma, uważając, aby nie złamać jej grotu. Odnotuj współrzędne przednio-tylne oraz przyśrodkowo-boczne bregma i przesuń igłę do pożądanych współrzędnych.Następnie opuść igłę tak, aby jej końcówka niemal dotykała czaszki, i zaznacz miejsce wiercenia, lekko unosząc ramię stereotaktyczne. Wywierć otwór w zaznaczonym miejscu na czaszce, uważając, aby nie uszkodzić opon mózgowych i mózgu. Następnie wytnij mały kawałek parafinowej folii plastikowej i umieść go na czaszce.Używając pipety 10 µL, nanieś kroplę roztworu na plastikową folię parafinową. Wyłącz pompę, lekko cofnij tłok pompy i wytwórz niewielki pęcherzyk powietrza w kapilarze, delikatnie wyciągając tłok strzykawki do mikroiniekcji. Obniż końcówkę igły, aż dotrze ona do kropli.Pobrać próbkę, bardzo powolnym ruchem wyciągając tłok strzykawki do mikroiniekcji, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Umieścić wypychacz pompy w kontakcie z tłokiem i włączyć pompę przy szybkości przepływu 0,3 µL/min. Następnie odczekać do momentu uformowania się kropli przed przejściem do następnego kroku.Następnie zmniejszyć przepływ do 0,1 µL/min. Naciąć oponę twardą za pomocą igły ze stali nierdzewnej o ściętym czubku i powoli wprowadzić igłę w tkankę mózgu. Po osiągnięciu pożądanej pozycji przesunąć igłę o dodatkowe 0,1 mm, a następnie zatrzymać pompę.Podnieś ramię stereotaktyczne o 0,1 millimeters i ponownie uruchom pompę z prędkością 0,3 microliters per minute. Następnie uruchom stoper oraz rozpoczęcie wtryskiwania. Monitoruj ruch pęcherzyka podczas wstrzykiwania.Na koniec zatrzymaj pompę i odczekaj pięć minut przed powolnym wycofaniem igły. Po całkowitym wyjęciu kwarcowej igły ponownie uruchom pompę i sprawdź, czy na jej końcówce utworzyła się kropla. Następnie uszczelnij otwór w powierzchni czaszki woskiem kostnym.Usuń żabki hemostatyczne i zaszyj skórę głowy. Smaruj obszar wokół rany kremem antybiotykiem i przenieś zwierzę z powrotem do klatki domowej. Są to ośmiomikronowe przekroje czołowe mózgów szczurów na poziomie prążkowia.Na tym obrazie widoczne są uszkodzenia powstałe w wyniku wstrzyknięcia 2 µL ACSF za pomocą tępej igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26G. Z kolei w prążkowiu, w którym zastosowano igłę kwarcową, nie stwierdzono żadnych wykrywalnych uszkodzeń. Pozostałe obrazy przedstawiają uszkodzenia wywołane przez obie igły na poziomie grzbietowej części hipokampa.Jednak igła kwarcowa nie spowodowała żadnych wykrywalnych uszkodzeń. Prawidłowe wstrzyknięcia przy użyciu obu igieł potwierdzono poprzez rozprzestrzenianie się błękitu Trypanu. Po opanowaniu tej techniki, przy zachowaniu właściwej procedury, można ją przeprowadzić w ciągu dwóch godzin.Po przeprowadzeniu tych procedur można wykonać wszystkie niezbędne dodatkowe działania, takie jak kolejne operacje, w celu odpowiedzi na inne pytania badawcze, na przykład dotyczące efektów indukowanych przez leki. Po opracowaniu tej techniki badacze z dziedziny neuronauki zyskali możliwość badania wpływu toksyn i leków, a w ostatnim czasie również produktów terapii genowej i komórkowej w modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykonywać mikroiniekcje w głębszych obszarach mózgu bez powodowania wykrywalnych uszkodzeń, wykorzystując spersonalizowane igły kwarcowe.Należy pamiętać, że korzystanie z odczynników i/lub patogenów poddanych mikrodysekcji laserowej może być niezwykle niebezpieczne. Podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak procedury bezpieczeństwa laserowego oraz stosowanie środków ochrony osobistej.

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kontrola i analiza obwodów neuronalnych in vivo zostałyby ułatwione dzięki technologii dostarczania wirusów i innych odczynników do wybranych trójwymiarowych zestawów obszarów mózgu. Prezentujemy wykonanie zindywidualizowanej macierzy wtryskiwaczy płynowych oraz dostarczanie kodowanych wirusowo sensybilizatorów optycznych, co umożliwia optyczną manipulację złożonymi obwodami mózgowymi.

Skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-μm. Technika ta znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.

Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych

Źródło: Poland, R. i wsp. Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zestaw do mikroiniekcji wypełniony wodą, składający się ze strzykawki i rurki do mikrowstrzykiwaczy, służy do precyzyjnego dostarczania leku. Szczur z wszczepioną kaniulą prowadzącą jest poddawany celowanej mikroiniekcji mózgu, umożliwiającej dokładne podawanie środków terapeutycznych obudzonym zwierzętom przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Oparte na mikroiniekcjach dostarczanie środka terapeutycznego do obudzonego mózgu gryzonia

Ten protokół opisuje montaż i użycie iniekcji do precyzyjnego dostarczania leku do wybranych obszarów mózgu znieczulonego szczura, a następnie monitorowanie aktywności neuronalnej za pomocą zarejestrowanych sygnałów elektrycznych.

Mikroiniekcja leku z zapisem elektrofizjologicznym w mózgu szczura

Źródło: Paolone, G., et al. Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).Ten film przedstawia wstrzyknięcie mikroigłowe do mózgu gryzonia za pomocą mikroigły kwarcowej z otworami. Mikroigła jest podłączona do strzykawki i mikropompy w celu kontrolowania szybkości podawania. Igła z roztworem do wstrzykiwań jest wprowadzana do mózgu z prędkością podawania ustawioną na niską. Po ustawieniu zwiększa się szybkość dostawy. Igła jest wycofywana po krótkiej przerwie.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni za pomocą mikroigły kwarcowej

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Sondy elektroniczne Mesh bezproblemowo integrują się i zapewniają stabilny, długoterminowy zapis na poziomie pojedynczego neuronu w mózgu. Protokół ten wykorzystuje elektronikę siatkową do eksperymentów in vivo, obejmujących wytwarzanie elektroniki siatkowej, ładowanie do igieł, wstrzykiwanie stereotaktyczne, łączenie wejść / wyjść, eksperymenty rejestracyjne i histologię tkanki zawierającej sondy siatkowe.

Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Poznaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzoni przy użyciu spersonalizowanych igieł kwarcowych, które minimalizują uszkodzenia tkanek i zapewniają precyzyjne dostarczanie substancji do głębokich regionów mózgu.

Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni

Przeglądaj więcej filmów