Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni
24 stycznia 2018
Opisujemy tutaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzonia, który wykorzystuje igły kwarcowe. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Co więcej, mogą być dostosowywane do potrzeb badawczych poprzez spersonalizowane projekty i mogą być ponownie wykorzystywane.
Ogólnym celem tej metodologii jest dopracowanie protokołu mikroiniekcji do mózgu z wykorzystaniem spersonalizowanych, wielorazowych igieł kwarcowych, które nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanki i zapewniają niezawodne dostarczanie substancji nawet do głębokich obszarów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak patofizjologia chorób neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych oraz efekty terapii genowej i komórkowej za pomocą wektorów wirusowych i przeszczepów komórkowych. Główną zaletą jest to, że igły te nie powodują żadnych wykrywalnych uszkodzeń tkanki, co zapewnia niezawodne dostarczanie substancji do głębokich obszarów mózgu.
Są one efektywne kosztowo, ponieważ można je czyścić i ponownie wykorzystywać. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić i wysterylizować kapilary kwarcowe, umieszczając je na pięć minut w wodzie destylowanej. Następnie należy je umieścić na pięć minut w 99% etanolu, a potem przez pięć minut w eterze dietylowym.
Następnie pozostaw kapilary pod wyciągiem na co najmniej jedną godzinę do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie przygotuj długie i cienkie igły za pomocą laserowego wyciągacza. Następnie umieść igły w szalce Petriego uprzednio oczyszczonej 70% ethanol.
Przykryj szalkę plastikową folią parafinową. Następnie utnij kapilary za pomocą mikrodissektora. Mocno przymocuj igłę do stolika mikroskopu i ustaw jej końcówkę w centrum ekranu komputera.
Na pasku menu kliknij ikonę ołówka i użyj jej do zaznaczenia miejsca, w którym igła ma zostać przecięta. W funkcji paska bocznego wybierz flagę zawierającą przycisk Start Cut, aby umożliwić laserowi przecięcie wcześniej zaznaczonego punktu. W razie potrzeby wykonaj nacięcia otworów bocznych, rysując znak i powtarzając procedurę cięcia bez zmiany położenia igły.
Po odcięciu igły należy podłączyć ją do pompy próżniowej za pomocą plastikowej rurki. Następnie należy włączyć pompę i ręcznie ustawić prędkość przepływu w przód na 3 µL/min. Po tym czasie należy zasysać 99% etanol, a następnie wodę destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia powstałe podczas cięcia.
Następnie ponownie odessaj 99%ethanol, aby ułatwić suszenie. Po tym czasie przechowuj igły w szczelnie zamkniętej szalce Petriego do dnia operacji. Aby ponownie wykorzystać igły, po zakończeniu eksperymentu należy oczyścić je odpowiednimi detergentami oraz 70%ethanol, aby usunąć wstrzyknięty roztwór i ewentualne pozostałości tkanek.
W razie potrzeby igły te można nawet zagotować w specjalnych słoikach szklanych wypełnionych wodą destylowaną. Na tym etapie należy wybrać menu ustawień, aby skalibrować pompę zgodnie z wymiarami objętościowymi strzykawki do mikroiniekcji. Następnie należy ustawić szybkość przepływu na 0.3 µL/min.
Następnie napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml wodą sterylną. Użyć jej do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji oraz zestawu części montażowych do ręcznej pompy do mikroiniekcji. Po tym czasie połączyć igłę z zestawem ręcznej pompy do mikroiniekcji.
Odłącz strzykawkę 10 ml od strzykawki do mikroiniekcji, powoli pchając tłok, aby pozostawić kroplę wody w górnej części strzykawki do mikroiniekcji. Następnie włóż tłok do strzykawki do mikroiniekcji. Teraz podłącz strzykawkę do mikroiniekcji do pompy i ustaw prędkość przepływu na 0,3 µL/min.
Następnie zmień szybkość przepływu na 0,1 µL/min i rozpocznij procedurę chirurgiczną. Aby przeprowadzić operację, ogol głowę zwierzęcia i oczyść ją chusteczką nasączoną alkoholem. Następnie umieść szczura w aparacie stereotaktycznym.
Za pomocą wysterylizowanego skalpela wykonaj cięcie wzdłużne na czaszce. Postępuj ostrożnie, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Następnie rozchyl skórę głowy za pomocą płaskiej szpatułki i załóż klipsy chirurgiczne na płaty skóry, aby utrzymać ją w pozycji otwartej.
Bardzo delikatnie odczep okostną, aby odsłonić bregma oraz obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona igła. Następnie zamocuj ramię w ramie stereotaksycznej i przesuń końcówkę igły bezpośrednio nad bregma, uważając, aby nie złamać jej grotu. Odnotuj współrzędne przednio-tylne oraz przyśrodkowo-boczne bregma i przesuń igłę do pożądanych współrzędnych.
Następnie opuść igłę tak, aby jej końcówka niemal dotykała czaszki, i zaznacz miejsce wiercenia, lekko unosząc ramię stereotaktyczne. Wywierć otwór w zaznaczonym miejscu na czaszce, uważając, aby nie uszkodzić opon mózgowych i mózgu. Następnie wytnij mały kawałek parafinowej folii plastikowej i umieść go na czaszce.
Używając pipety 10 µL, nanieś kroplę roztworu na plastikową folię parafinową. Wyłącz pompę, lekko cofnij tłok pompy i wytwórz niewielki pęcherzyk powietrza w kapilarze, delikatnie wyciągając tłok strzykawki do mikroiniekcji. Obniż końcówkę igły, aż dotrze ona do kropli.
Pobrać próbkę, bardzo powolnym ruchem wyciągając tłok strzykawki do mikroiniekcji, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Umieścić wypychacz pompy w kontakcie z tłokiem i włączyć pompę przy szybkości przepływu 0,3 µL/min. Następnie odczekać do momentu uformowania się kropli przed przejściem do następnego kroku.
Następnie zmniejszyć przepływ do 0,1 µL/min. Naciąć oponę twardą za pomocą igły ze stali nierdzewnej o ściętym czubku i powoli wprowadzić igłę w tkankę mózgu. Po osiągnięciu pożądanej pozycji przesunąć igłę o dodatkowe 0,1 mm, a następnie zatrzymać pompę.
Podnieś ramię stereotaktyczne o 0,1 millimeters i ponownie uruchom pompę z prędkością 0,3 microliters per minute. Następnie uruchom stoper oraz rozpoczęcie wtryskiwania. Monitoruj ruch pęcherzyka podczas wstrzykiwania.
Na koniec zatrzymaj pompę i odczekaj pięć minut przed powolnym wycofaniem igły. Po całkowitym wyjęciu kwarcowej igły ponownie uruchom pompę i sprawdź, czy na jej końcówce utworzyła się kropla. Następnie uszczelnij otwór w powierzchni czaszki woskiem kostnym.
Usuń żabki hemostatyczne i zaszyj skórę głowy. Smaruj obszar wokół rany kremem antybiotykiem i przenieś zwierzę z powrotem do klatki domowej. Są to ośmiomikronowe przekroje czołowe mózgów szczurów na poziomie prążkowia.
Na tym obrazie widoczne są uszkodzenia powstałe w wyniku wstrzyknięcia 2 µL ACSF za pomocą tępej igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26G. Z kolei w prążkowiu, w którym zastosowano igłę kwarcową, nie stwierdzono żadnych wykrywalnych uszkodzeń. Pozostałe obrazy przedstawiają uszkodzenia wywołane przez obie igły na poziomie grzbietowej części hipokampa.
Jednak igła kwarcowa nie spowodowała żadnych wykrywalnych uszkodzeń. Prawidłowe wstrzyknięcia przy użyciu obu igieł potwierdzono poprzez rozprzestrzenianie się błękitu Trypanu. Po opanowaniu tej techniki, przy zachowaniu właściwej procedury, można ją przeprowadzić w ciągu dwóch godzin.
Po przeprowadzeniu tych procedur można wykonać wszystkie niezbędne dodatkowe działania, takie jak kolejne operacje, w celu odpowiedzi na inne pytania badawcze, na przykład dotyczące efektów indukowanych przez leki. Po opracowaniu tej techniki badacze z dziedziny neuronauki zyskali możliwość badania wpływu toksyn i leków, a w ostatnim czasie również produktów terapii genowej i komórkowej w modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykonywać mikroiniekcje w głębszych obszarach mózgu bez powodowania wykrywalnych uszkodzeń, wykorzystując spersonalizowane igły kwarcowe.
Należy pamiętać, że korzystanie z odczynników i/lub patogenów poddanych mikrodysekcji laserowej może być niezwykle niebezpieczne. Podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak procedury bezpieczeństwa laserowego oraz stosowanie środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia udoskonalony protokół mikroiniekcji do mózgu z wykorzystaniem spersonalizowanych, wielorazowych igieł kwarcowych. Igły te minimalizują uszkodzenia tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie substancji do głębokich obszarów mózgu, co czyni je odpowiednimi do różnorodnych zastosowań w neuronauce.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki mikroiniekcji
- Choroby neurodegeneracyjne
Wprowadzenie
- Mikroiniekcja ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji mózgu.
- Tradycyjne metody mogą powodować uszkodzenia tkanek.
- Igły kwarcowe stanowią rozwiązanie o minimalnym wpływie na tkankę.
- Konstrukcje wielorazowego użytku zwiększają efektywność kosztową.
Cel badania
- Opracowanie bezpiecznego i skutecznego protokołu mikroiniekcji.
- Ułatwienie badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi i psychiatrycznymi.
- Udoskonalenie metod dostarczania w ramach terapii genowej i komórkowej.
Zastosowane metody
- Czyszczenie i sterylizacja kapilar kwarcowych.
- Stosowanie wody destylowanej, etanolu i eteru dietylowego do sterylizacji.
- Mikroiniekcje do obszarów mózgu gryzoni.
- Ocena uszkodzeń tkanki po iniekcji.
Główne wyniki
- Igły kwarcowe nie spowodowały wykrywalnych uszkodzeń tkanki.
- Osiągnięto niezawodne dostarczanie substancji do głębokich obszarów mózgu.
- Rozwiązanie kosztowo efektywne dzięki możliwości ponownego użycia.
- Potencjał do poszerzenia wiedzy na temat różnych schorzeń neurologicznych.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa bezpieczeństwo i skuteczność mikroiniekcji do mózgu.
- Spersonalizowane projekty mogą być dostosowane do konkretnych potrzeb badawczych.
- Metoda ta może mieć znaczący wpływ na badania z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spersonalizowane igły kwarcowe do mikroiniekcji w mózg gryzoni rozwiązują krytyczny problem w przedklinicznej neuronauce, umożliwiając precyzyjne, małoinwazyjne dostarczanie związków, komórek lub terapii genowych do głębokich obszarów mózgu. Innowacja ta ogranicza uszkodzenia tkanek i zwiększa powtarzalność badań, wspierając badania translacyjne oraz walidację celów w modelach chorób neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych. Podejście to oferuje skalowalne i kosztowo efektywne rozwiązania dla korporacyjnych rurociągów badawczo-rozwojowych skoncentrowanych na terapiach OUN.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę szlaków neurobiologicznych w obszarach mózgu istotnych dla przebiegu choroby.
- Ogranicza zakłócające uszkodzenia tkanek, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego i funkcjonalną walidację celu.
- Ułatwia niezawodne dostarczanie terapii genowych, komórkowych lub małocząsteczkowych w celu weryfikacji hipotez.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celów w OUN na wczesnym etapie badań.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne systemy mikroiniekcji do dostarczania związków lub komórek in vivo.
- Wspiera standaryzację parametrów wstrzykiwania oraz ilościową ocenę dokładności dostarczania.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie igieł o dostosowywalnych właściwościach dla zróżnicowanych potrzeb badawczych.
- Poprawia gotowość do przesiewania kandydatów na terapeutyki celowane w ośrodkowy układ nerwowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla danej choroby modelami zwierzęcymi w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez minimalizację artefaktów proceduralnych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów badawczych nad OUN poprzez ograniczanie niepewności biologicznej na późnych etapach.
- Umożliwia rzetelną ocenę dostarczania terapii genowych i komórkowych in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z ciągiem działań od odkrywania do badań przedklinicznych w opracowywaniu leków na OUN, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i walidację translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników neuroaktywnych i modulacji szlaków in vivo.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki mikrowstrzykiwań do badań porównawczych.
- Analityka: Umożliwia ocenę precyzji wstrzyknięcia oraz integralności tkanki po podaniu substancji.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez umożliwienie niezawodnego podawania substancji w modelach chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, konfigurowalną platformę do ciągłych badań i rozwoju w obszarze OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury mikroiniekcji i wspiera skalowalne, kosztowo efektywne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go i redukuje ryzyko niepowodzeń w późnych fazach rozwoju w portfolio OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów OUN z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej i technikach mikroiniekcji.
- Wymagany jest dostęp do wyciągaczy laserowych, mikrodisektorów oraz skalibrowanych pomp do mikroiniekcji.
- Konieczne jest stosowanie rygorystycznych protokołów czyszczenia i sterylizacji w przypadku ponownego użycia igieł.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli gryzoni i współrzędnych iniekcji pod warunkiem odpowiedniej kalibracji.
- Niezbędne jest przestrzeganie środków ostrożności podczas pracy z odczynnikami, patogenami lub urządzeniami laserowymi.
