Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu pojedynczego wstrzyknięcia osocza bogatopłytkowego (PRP) na oporność i proces gojenia cięgien Achillesa szczura po chirurgicznym cięciu w różnych punktach czasowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na szybkie pytania dotyczące zmian w mięśniach i ścięgien. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedury chirurgiczne, biomechaniczne i progresji PRP są dobrze ustandaryzowane.

Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku stosowania PRP u ludzi, ponieważ tego typu zmiany i proces gojenia ścięgien są podobne u szczurów i ludzi. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przygotowanie PRP do urazów układu mięśniowo-szkieletowego, ta technika iniekcji może być również stosowana do innych układów, takich jak choroby serca lub skóry. Wizualna demonstracja metody jest bardzo ważna, ponieważ etapy chirurgiczne i biomechaniczne wymagają stałej powtarzalności w celu uzyskania optymalnych wyników.

Zacznij od zważenia i kolczykowania uszu szczura. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uszczypnięcie palca u nogi, nałóż krople wody na rogówkę zwierzęcia i usuń włosy z lewej kończyny tylnej. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę roztworem izobetadyny w rozcieńczeniu 1 do 10 i umieść zwierzę na poduszce grzewczej o temperaturze 20 stopni Celsjusza pod mikroskopem preparacyjnym w bocznej pozycji odleżynowa, z lewą tylną kończyną w pozycji górnej.

Chwyć lewą łapę tylnej kończyny kleszczami i wykonaj boczne nacięcie skóry o średnicy od 20 do 25 milimetrów wokół ścięgna Achillesa. Za pomocą cienkich nożyczek rozetnij powięź, aby odsłonić kompleks ścięgna Achillesa i usunąć ścięgno podeszwowe. Przetnij ścięgno Achillesa poprzecznie, pięć milimetrów proksymalnie do przyczepu kości piętowej, i usuń pięciomilimetrową część.

Następnie użyj wchłanialnej przędzy i kontynuuj zakładanie szwów, aby zamknąć powięź i skórę, a następnie umieść szczura pod źródłem ciepła z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Podczas gdy zwierzęta biorcy dochodzą do siebie, należy pobrać 20 mililitrów krwi pełnej z serca jednego dawcy szczura na zwierzę doświadczalne do pojedynczych probówek zawierających 3,2% buforowanego cytrynianu sodu. Aby uzyskać osocze bogatopłytkowe, odwiruj krew i użyj plastikowej pipety transferowej, aby ostrożnie pobrać górną fazę zawierającą PRP do drugiej plastikowej probówki.

Określ objętość pobranego PRP i zmierz liczbę płytek krwi na analizatorze hematologicznym. Ponownie odwirować PRP i ostrożnie przenieść supernatant do nowej plastikowej probówki. Pozostała objętość w probówce PRP powinna wynosić około 2/3 objętości wymaganej do osiągnięcia 2,5 razy 10 do szóstej płytki krwi na mikrolitr.

Następnie delikatnie ponownie zawiesić osad płytkowy za pomocą pipetowania. Zmierzyć liczbę płytek krwi w tym skoncentrowanym osoczu bogatopłytkowym, dodając z powrotem odpowiednią objętość autologicznego osocza ubogiego w płytki krwi, aby w razie potrzeby osiągnąć stężenie docelowe. Aktywuj płytki krwi za pomocą 50 mikrolitrów chlorku wapnia na mililitr PRP przez około godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie załaduj płytki krwi do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21 i wstrzyknij 50 mikrolitrów płytek krwi bezpośrednio w miejsce szwu każdego zwierzęcia. W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia należy ogolić lewą tylną kończynę znieczulonego zwierzęcia doświadczalnego i umieścić szczura pod mikroskopem preparacyjnym, jak właśnie pokazano. Trzymając łapę palcami, wykonaj 10-milimetrowe nacięcie w miejscu operacji, aby odsłonić triceps suralis.

Aby usunąć ścięgno Achillesa, przetnij kość piętową poprzecznie, od pięciu do 10 milimetrów dystalnie do jej przyczepu i wypreparuj kawałek triceps suralis wystarczająco duży, aby zmieścił się w krioszczęce. Za pomocą kleszczy umieść próbkę natychmiast w górnej szczęce krioszczęki i zamknij instrument. Umieść krioszczękę pionowo w uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej i zamocuj kość piętową między dolnymi zaciskami.

Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego, umieść kamery prostopadle do siebie. Dodaj ciekły azot do obu basenów górnej szczęki, aby zamrozić mięsień o rząd wielkości sztywniejszy niż ścięgno, tak aby nie odkształcał się podczas próby rozciągania. Gdy strefa zamarzania dotrze do metalowej granicy zacisku, ustaw szybkość przemieszczenia maszyny na stałą prędkość jednego milimetra na sekundę aż do pęknięcia i rozpocznij próbę rozciągania, używając komputera do zapisania ostatecznej wytrzymałości na rozciąganie w niutonach.

Aby uwzględnić różnice w obszarach przekroju poprzecznego gojących się ścięgien, znormalizuj ostateczną wytrzymałość na rozciąganie do powierzchni jednostkowej, która reprezentuje naprężenia mechaniczne doświadczane przez tkankę. Następnie, gdy ścięgno pęknie, zamroź próbki zerwanego ścięgna w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu ekstrakcji RNA i analizy RTPCR. W tym reprezentatywnym eksperymencie potrzebna była większa siła do wywołania zerwania ścięgna w grupie, której wstrzyknięto PRP, niż w grupie kontrolnej leczonej solą fizjologiczną w każdym testowanym punkcie czasowym, co sugeruje bardziej solidny proces gojenia lub lepsze właściwości mechaniczne u zwierząt leczonych PRP.

Chociaż grupa PRP wykazała większe rozproszenie wewnątrzgrupowe niż grupa soli fizjologicznej, pole przekroju poprzecznego ścięgien stwierdzono jako większe w grupie wstrzykniętej PRP w dniach 15 i 30 po indukcji zmiany. Co więcej, barwienie trichromowe Massona ujawniło wyższą obecność kolagenu fibrylarnego, kluczowego składnika morfologii i wytrzymałości ścięgien, u zwierząt leczonych PRP w piątym i 15 dniu, z podobną intensywnością barwienia obserwowaną w obu grupach do 30 dnia po wstrzyknięciu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać standardowe zmiany u szczura i pobrać próbkę ścięgna, aby ocenić proces gojenia się po wstrzyknięciu PRP.