Name: Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę oceny gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów po zastrzyku osocza bogatopłytkowego (PRP) lub soli fizjologicznej. Protokół obejmuje standaryzowane procedury chirurgiczne i biomechaniczne analizy wytrzymałościowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty Standard de Liège i Lejeune- Lechien z Leon Frédéricq Funds.

Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi były wykonywane zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych przygotowanym przez Narodową Akademię Nauk i opublikowanym przez National Institutes of Health (USA). Prawodawstwo europejskie i krajowe było ściśle przestrzegane.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Użyj 132 2-miesięcznych samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 320-450 g (120 szczurów do eksperymentów i 12 szczurów do pobierania krwi, <silna klasa="xfig">Ryc. 1). Na podstawie Dell13, 15 szczurów dla każdej grupy wystarczyło do uzyskania potęgi 0,8 (80% szansy na znalezienie istotności statystycznej, jeśli określony efekt istnieje).</li>
	<li>Trzymaj wszystkie szczury w klasycznych klatkach w warunkach izolacji w konwencjonalnym obiekcie wyposażonym w przebieralnię. Zainicjuj hodowlę w stojaku IVC (indywidualnie wentylowana klatka), przy czym szczury z filtrem SPF (wolne od specyficznych patogenów) są specjalnie kupowane.</li>
	<li>Stosować w następujących warunkach mieszkaniowych: zakres temperatur od 19-24 °C; wilgotność względna: 40-60%; wentylacja: częstotliwość wymiany powietrza: 10-15 na godzinę; cykl jasny/ciemny: 12 h-12 h.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie urządzenia do trzymania w klatkach i użyj napromieniowanej ściółki. Systematycznie wdrażaj wzbogacanie klatek, umieszczając w nich sterylne tacki kartonowe i ręczniki.</li>
	<li>Zezwól na wejście do strefy w ograniczonych warunkach: nowy fartuch laboratoryjny, maska, rękawice, obuwie i czepek do włosów przy wejściu.</li>
	<li>Przeprowadzaj coroczny monitoring stanu zdrowia kolonii zwierząt wskaźnikowych trzymanych na brudnej ściółce, zgodnie z zaleceniami Felasa14 dla konwencjonalnych obiektów. Trzymać od czterech do pięciu zwierząt w klatce, stosując odpowiednią napromieniowaną dietę i dostarczając zakwaszoną wodę ad libitum. Monitoruj codziennie.</li>
	<li>Szczury transferowe wybrane do interwencji chirurgicznej w filtrowaniu górnych klatek do sal operacyjnych na 2 godziny przed zabiegiem.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Przygotuj narzędzia chirurgiczne: cienkie nożyczki, zacisk, dwa zaciski hemostatyczne i uchwyt na igłę. Podczas wszystkich zabiegów należy nosić rękawiczki, maskę, kaptur i fartuch laboratoryjny.</li>
	<li>Losowo podziel szczury na dwie grupy (PRP i roztwór soli fizjologicznej).</li>
	<li>Wyjmij szczura z klatki i zważ go. Użyj ponumerowanych kolczyków, aby zidentyfikować szczury. Aby uniknąć wysuszenia oczu, umieść krople wody na rogówce.</li>
	<li>Znieczulić szczura dootrzewnowo ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała). Aby potwierdzić znieczulenie, umieść zwierzęta pod monitorowaniem krążeniowo-oddechowym i sprawdź, czy nie ma odruchów wzrokowych.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl buprenorfiny podskórnie (0,01-0,05 mg/kg co 8-12 h) w okolicę szyi jako środek przeciwbólowy.</li>
	<li>Ogolić lewą tylną kończynę golarką elektryczną, zdezynfekować ją 3 naprzemiennymi peelingami roztworu izobetadyny/alkoholu (rozcieńczonego w stosunku 1:10) i umieścić szczura na ciepłej podkładce (20 °C) pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść szczura na bocznym odleżynie z nogą, która ma być operowana, w pozycji nadrzędnej. Przytrzymaj łapę kleszczami chirurgicznymi.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj małe boczne nacięcie (20-25 mm) w skórze otaczającej lewe ścięgno Achillesa i wypreparuj powięź za pomocą cienkich nożyczek, aby odsłonić kompleks ścięgna Achillesa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2a).</li>
	<li>Usuń ścięgno podeszwowe nożyczkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2b).</li>
	<li>Przetnij ścięgno Achillesa poprzecznie 5 mm proksymalnie do przyczepu piętowego i usuń część o długości 5 mm za pomocą nożyczek. Nie zszywaj ścięgna (<silna klasa="xfig">Rysunek 2c, 2d).</li>
	<li>Zszyj powięź, a następnie skórę przędzą wchłanialną, wykonując szew overjet (szew ciągły). Można również stosować szwy monofilamentowe, aby zapobiec przedostawaniu się wilgoci ze skóry do nacięcia chirurgicznego.</li>
	<li>Umieść szczura pod lampą grzewczą do momentu przebudzenia, a następnie umieść go z powrotem w klatce (58 x 38 cm) (Nota bene: nie nakłada się unieruchomienia).</li>
</ol>
3. PRP Preparation15
<ol>
	<li>Znieczulić szczury dawcy ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Iniekcja PRP przeprowadza się 2 godziny po operacji bez konieczności znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 50 μl buprenorfiny jako środek przeciwbólowy.</li>
	<li>Zebrać krew pełną (20 ml na szczura, końcowe krwawienie) przez nakłucie serca do sterylnych probówek zawierających 3,2% buforowany cytrynian sodu (0,109 M, antykoagulant). Następnie poddaj szczura eutanazji przez wstrzyknięcie dosercowe.</li>
	<li>Aby uzyskać PRP, należy odwirować krew przez 10 minut w temperaturze 150 x g i temperaturze pokojowej. Ten początkowy etap wirowania z niską prędkością daje dwie odrębne fazy: dolną fazę składającą się z czerwonych krwinek (RBC), która stanowi około 80-90% całkowitej objętości, oraz górną fazę składającą się z osocza bogatopłytkowego (PRP) (zwykle 10-20% próbki krwi).</li>
	<li>Delikatnie zbierz PRP (górna faza) do wtórnej plastikowej rurki za pomocą plastikowej pipety transferowej. Ponieważ interfejs między PRP a czerwonymi krwinkami jest bardzo luźny, nie należy pipetować zbyt blisko interfejsu. Przy prawidłowym obchodzeniu się z zanieczyszczonymi erytrocytami w PRP powinno być poniżej 0,05 x 103 komórek/μL. Wyrzuć pozostałą dolną fazę i pierwotną probówkę do pobierania krwi.</li>
	<li>Określ objętość pobranego PRP i zmierz liczbę płytek krwi na analizatorze hematologicznym. Wartości te są wymagane do obliczeń w celu dostosowania stężenia płytek krwi w następnym kroku. Liczba krwinek jest również przydatna do oceny potencjalnego zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi i białymi krwinkami. Stężenie płytek krwi w PRP na tym etapie wynosi zwykle 1 – 1,5 x106/μL.</li>
	<li>Przeprowadzić drugie odwirowanie PRP przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze pokojowej. Ten etap wirowania z dużą prędkością daje luźny osad płytek krwi i supernatant składający się z autologicznego osocza ubogiego w płytki krwi (PPP). Korzystając z wartości określonych w kroku 3.6, obliczyć objętość supernatantu, którą należy odrzucić w celu zagęszczenia PRP i osiągnięcia końcowego stężenia 2,5 x106/μL.</li>
	<li>Delikatnie zebrać supernatant (PPP) do wtórnej plastikowej probówki za pomocą plastikowej pipety transferowej, pozostawiając około dwóch trzecich końcowej objętości obliczonej w kroku 3.7. Ponieważ osad jest luźny, znaczna ilość płytek krwi jest tracona w wyniku wyrzucenia PPP, co potencjalnie zmniejsza końcowe pożądane stężenie.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić osad płytek krwi z pozostałym supernatantem, delikatnie powtarzając pipetowanie. Zmierz liczbę płytek krwi na tym skoncentrowanym PRP. W razie potrzeby dodać odpowiednią objętość autologicznego PPP, aby osiągnąć końcowe stężenie docelowe. 
	UWAGA: Osocze bogatopłytkowe należy zużyć w ciągu 3 godzin od przygotowania.</li>
	<li>Dodać 50 μl CaCl2 (11 mEq 10 ml) na ml PRP, aby aktywować płytki krwi</li>.
	<li>Wstrzyknąć 50 μl świeżego roztworu PRP lub soli fizjologicznej za pomocą igły 21G bezpośrednio w zszyte miejsce operacji po około 1 godzinie od przygotowania. W tym czasie PRP należy przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uważnie monitoruj powrót do sprawności szczurów w ciągu kilku dni po operacji i przed usunięciem ścięgna Achillesa.</li>
</ol>
4. Usunięcie ścięgna Achillesa i testy biomechaniczne16
<ol>
	<li>5, 15 lub 30 dni później5, zważ szczura. Następnie znieczulić ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 50 μl buprenorfiny jako środek przeciwbólowy. Usuń ścięgno przed poświęceniem zwierzęcia, aby utrzymać warunki fizjologiczne tak długo, jak to możliwe.</li>
	<li>Ogol lewą tylną kończynę i umieść szczura pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść szczura na bocznym odleżynie z nogą, która ma być operowana, w pozycji nadrzędnej. Przytrzymaj łapę palcami.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (10 mm) w poprzednim miejscu operacji i rozciągaj do momentu odsłonięcia triceps suralis.</li>
	<li>Aby usunąć gojące się ścięgno Achillesa, przetnij kość piętową poprzecznie 5-10 mm dystalnie do przyczepu ścięgna Achillesa. Następnie wypreparuj część tricepsa suralis, który jest przyczepiony do ścięgna Achillesa (<silna klasa="xfig">Ryc. 3b). Część mięśniowa musi być wystarczająco duża, aby zmieścić się w kriożuchwie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3c-d). Umieść próbkę natychmiast w kriożuchwie za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3e).</li>
	<li>Po usunięciu kompleksu mięśnia-ścięgna-kości, należy poddać szczura eutanazji przez dosercowe wstrzyknięcie Nembutalu (200 mg/kg). Potwierdź zgon, oceniając brak rytmu serca i oddychania przez 15 minut.</li>
	<li>Umieść jednostkę mięśniową w górnej szczęce (<silna klasa="xfig">Rysunek 3e), zamknij ją i umieść pionowo w uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej (106,2 kN, <silna klasa="xfig">Rysunek 3a). Następnie zamocuj kość między dolnymi zaciskami maszyny (<silna klasa="xfig">Rysunek 3f).</li>
	<li>Dodaj ciekły azot do obu basenów górnej szczęki, aby zamrozić mięsień, tak aby był o rząd wielkości sztywniejszy niż ścięgno i nie odkształcał się podczas próby rozciągania.</li>
	<li>Gdy strefa zamarzania dotrze do metalowej granicy zacisku, rozpocznij próbę rozciągania, aby ścięgno zachowało swoją strukturę. Ustaw szybkość przemieszczenia maszyny na stałą prędkość 1 mm/s aż do pęknięcia. Zapisz na komputerze ostateczną wytrzymałość na rozciąganie (UTS) podaną w niutonach (N).</li>
	<li>Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego, umieść dwie kamery prostopadle do siebie, tworząc eliptyczny kształt, i zrób zdjęcia.</li>
	<li>Aby uwzględnić różnicę w polu przekroju poprzecznego gojących się ścięgien, znormalizuj UTS do jednostki powierzchni (N na milimetr kwadratowy), która reprezentuje naprężenia mechaniczne doświadczane przez tkankę.</li>
</ol>
5. Analiza histologiczna
UWAGA: 15 ścięgien z każdej grupy zostało poddanych analizie histologicznej.
<ol>
	<li>Po jego usunięciu należy natychmiast zanurzyć ścięgno Achillesa w 4% paraformaldehydzie, aby zachować jego strukturę (utrwala się 1 mm tkanki na godzinę, więc czas utrwalenia różni się w zależności od wielkości ścięgna).</li>
	<li>Zastąp paraformaldehyd 70% etanolem i pozostaw próbkę na co najmniej jedną noc w tym roztworze.</li>
	<li>Umieść ścięgno w małym plastikowym pojemniku z otworami i umieść ten pojemnik w świeżym roztworze 70% etanolu na 1 godzinę.</li>
	<li>Umieść pojemnik w 95% etanolu na 1 godzinę. Powtórz.</li>
	<li>Umieść pojemnik w 100% etanolu na 1 godzinę. Powtórz.</li>
	<li>Umieść pojemnik w 100% ksylenie na 1 godzinę. Powtórz.</li>
	<li>Teraz umieść plastikowy pojemnik, w którym znajduje się ścięgno, w płynnej parafinie (56 °C) i pozostaw na noc.</li>
	<li>Korzystając ze stacji zatapiania (wyposażonej w stopiony wosk, gorącą płytę i zimną płytę), wybierz metalową formę, która najlepiej pasuje do próbki tkanki i napełnij ją niewielką ilością płynnej parafiny, aby podstawa była pokryta. 
	UWAGA: Ustawić próbkę tak, aby uzyskać pionowe sekcje na mikrotomie.</li>
	<li>Po prawidłowym umieszczeniu próbki napełnij formę ciekłą parafiną i umieść ją na maszynie chłodniczej. Pozostaw do ostygnięcia przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Wyjmij z bloku parafiny i umieść go na lodzie na co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Przygotuj kilka czystych szkiełek i umieść na nich kropelki wody dejonizowanej.</li>
	<li>W mikrotomie pokrój bloki na odcinki po 5 μm (używaj tylko odcinków ze środkowej części ścięgna) i umieść odcinek na szkiełku.</li>
	<li>Umieść szkiełka w piecu grzewczym w temperaturze 65 °C na kilka minut, tak aby parafina zaczęła się topić, aby związać tkankę ze szkłem.</li>
	<li>Umieść szkiełka zawierające skrawki parafiny w uchwycie na plastry.</li>
	<li>Teraz należy odparafinować i ponownie nawodnić tkankę, umieszczając ją w następujących następujących kolejnych kąpielach: 
	8 min w ksylenie (kąpiel 1) 
	4 min w ksylenie (kąpiel 2) 
	2 min w 100% etanolu 
	2 min w 95% etanolu 
	2 min w 70% etanolu 
	2 min w wodzie dejonizowanej</li>
	<li>W celu barwienia Hematoksyliny-Eozyny należy umieścić tkankę w następujących roztworach.
	<ol>
		<li>Zanurzyć tkankę na 8 minut w roztworze hematoksyliny (1 g monohydratu hematoksyliny, 0,2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2,12H2O; 200 ml gliceryny; dodać do 1 l wodą destylowaną).</li>
		<li>Zanurz chusteczkę na 8 minut pod bieżącą wodą z kranu.</li>
		<li>Zanurz tkankę na 30 s w roztworze eozyny (0,25% eozyny w 100 ml wody destylowanej zawierającej 200 μl nierozcieńczonego kwasu octowego).</li>
		<li>Zanurz chusteczkę na 2 minuty pod bieżącą wodą z kranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku barwienia trichromowego Massona wykonaj następujące kroki.
	<ol>
		<li>Po ponownym uwodnieniu umieścić sekcje w pojemniku z ałunem żelaza (0,5 g (NH4)Fe(SO4)2,12H2O w 10 ml H2O) i zamknąć pojemnik. Podgrzej przez 3 minuty z mocą 280 W w kuchence mikrofalowej.</li>
		<li>Pozwól mu ostygnąć przez minutę, a następnie spłucz wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Umieścić skrawki w zamkniętym pojemniku z roztworem hematoksyliny Regauda (0,5 g hematoksyliny rozpuszczonej w 50 mlH2Ow temperaturze 50 °C, następnie dodać 5 ml 95% etanolu i 5 ml gliceryny), podgrzewać przez 90 s w temperaturze 280 W.</li>
		<li>Opłucz go wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Umieść skrawki w roztworze kwasu pikrynowego (po nasyceniu metanolem) na 3 minuty, płucz przez 5 minut pod bieżącą wodą z kranu, a następnie umieść je w wodzie dejonizowanej na kilka sekund.</li>
		<li>Teraz umieść skrawki w kwaśnej fuksyny (0,5 g w 50 ml H2O zawierającej 0,25 ml nierozcieńczonego kwasu octowego) na 5 s i spłucz pod bieżącą wodą z kranu, aż barwnik zniknie.</li>
		<li>Inkubować skrawki w roztworze kwasu fosfomolibdenowego (0,5 g w 50 mlH2O) przez 5 minut, umieścić na kilka sekund w wodzie dejonizowanej.</li>
		<li>Umieść skrawki w jasnozielonym (0,5 g w 50 ml H2O zawierającym 0,25 ml nierozcieńczonego kwasu octowego) roztworze na kolejne 5 minut i umieść pod bieżącą wodą z kranu, aż barwnik zniknie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Teraz ponownie odwodnić tkankę.
	<ol>
		<li>Zanurz sekcję na 1 minutę w 70% etanolu.</li>
		<li>Zanurz sekcję na 1 minutę w 95% etanolu.</li>
		<li>Zanurz sekcję na 1 minutę w 100% etanolu.</li>
		<li>Zanurz sekcję na 1 minutę w ksylenie (kąpiel 1).</li>
		<li>Zanurz sekcję na 1 minutę w ksylenie (kąpiel 2).</li>
		<li>Usuń sekcje bez usuwania zbyt dużej ilości ksylenu i nałóż kroplę podłoża montażowego na próbkę.</li>
		<li>Połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu (nie prowokując żadnych pęcherzyków) i pozwól mu stwardnieć przez co najmniej 2 godziny.</li>
		<li>Hydrolizować 5 odcinków histologicznych (każdy z innego ścięgna) każdej grupy w 6 N HCl przez 3 godziny i oznaczyć stężenie kolagenu, mierząc hydroksyprolinę jako wskaźnik w 5 μm niebarwionych skrawkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizuj wyniki według obszaru przekroju za pomocą oprogramowania producenta.</li>
	<li>Zabarwić niektóre sekcje jasnozielonym barwnikiem, aby uwidocznić i określić ilościowo kolagen fibrylarny za pomocą analizy wspomaganej komputerowo.</li>
	<li>Zeskanuj sekcje i przekonwertuj zdjęcia w odcieniach szarości za pomocą oprogramowania IrfanView. Użyj oprogramowania do półkwantyfikacji (np. Ilość pierwsza).</li>
</ol>
6. Ocena molekularna
<ol>
	<li>Po zerwaniu ścięgna, do którego dochodzi podczas prób mechanicznych, należy pobrać próbki, zamrozić je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C (PRP i roztwór soli fizjologicznej)17.</li>
	<li>Użyj komercyjnego zestawu Total RNA, aby wyizolować total RNA17.</li>
	<li>Zmierz ekspresję kolagenu (Col I i Col III), metaloproteinaz macierzy (MMP-2, MMP-3 i MMP-9) oraz tenomoduliny (TNMD) za pomocą RT-PCR17,18.</li>
	<li>Znormalizuj poziomy ekspresji mRNA do poziomów 28S19.</li>
</ol>

<ol><li>Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/225039288_Platelet_rich_plasma_traitement_des_tendinopathies_chroniques_Revue_de_la_litterature">Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature.</a> J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).</li>
<li>Anitua, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+preparations+rich+in+growth+factors+promote+proliferation+and+induce+VEGF+and+HGF+production+by+human+tendon+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture.</a> J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).</li>
<li>Bosch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+platelet-rich+plasma+on+the+quality+of+repair+of+mechanically+induced+core+lesions+in+equine+superficial+digital+flexor+tendons%3A+A+placebo-controlled+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study.</a> J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).</li>
<li>Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendinopathies+and+platelet-rich+plasma+%28PRP%29%3A+From+pre-clinical+experiments+to+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Stem+Cells+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use.</a> J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).</li>
<li>Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+epidemiology+of+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Types and epidemiology of tendinopathy.</a> Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).</li>
<li>Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+growth+factors+in+tendon+and+ligament+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">The roles of growth factors in tendon and ligament healing.</a> Sports Med. 33, 381-394 (2003).</li>
<li>Lyras, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+platelet-rich+plasma+gel+in+the+early+phase+of+patellar+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Orthop.+Trauma+Surg%22%5BJournal%5D)">The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing.</a> Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).</li>
<li>Aspenberg, P., Virchenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+concentrate+injection+improves+Achilles+tendon+repair+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop.+Scand%22%5BJournal%5D)">Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats.</a> Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).</li>
<li>Visser, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factor-Rich+Plasma+Increases+Tendon+Cell+Proliferation+and+Matrix+Synthesis+on+a+Synthetic+Scaffold%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).</li>
<li>Zhang, J., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Rich+Plasma+Releasate+Promotes+Differentiation+of+Tendon+Stem+Cells+Into+Active+Tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes.</a> Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).</li>
<li>Kajikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+enhances+the+initial+mobilization+of+circulation-derived+cells+for+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing.</a> J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors-diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+size+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Sample size determination.</a> ILAR J. 43, 207-213 (2002).</li>
<li>Mähler Convenor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse%2C+rat%2C+hamster%2C+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).</li>
<li>Kaux, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%89tude+comparative+de+cinq+techniques+de+pr%C3%A9paration+plaquettaire+%28platelet-rich+plasma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma).</a> Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).</li>
<li>Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-jaw+designed+for+in+vitro+tensile+testing+of+the+healing+Achilles+tendons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats.</a> J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).</li>
<li>Kaux, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Endothelial+Growth+Factor-111+%28VEGF-111%29+and+tendon+healing%3A+preliminary+results+in+a+rat+model+of+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Muscles.+Ligaments+Tendons+J%22%5BJournal%5D)">Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury.</a> Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).</li>
<li>Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenomodulin+is+necessary+for+tenocyte+proliferation+and+tendon+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation.</a> Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).</li>
<li>Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathways+in+the+over-expression+of+matrix+metalloproteinases+in+human+fibroblasts+by+relaxation+of+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension.</a> Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).</li>
<li>Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Platelets and wound healing.</a> Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).</li>
<li>Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+platelet+rich+plasma%3A+a+study+on+HL-60+macrophage-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells.</a> Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).</li>
<li>Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+use+of+platelet-rich+plasma+in+sports+medicine+as+a+new+treatment+for+tendon+and+ligament+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+J.+Sport+Med%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries.</a> Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).</li>
<li>Mazzocca, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+positive+effects+of+different+platelet-rich+plasma+methods+on+human+muscle%2C+bone%2C+and+tendon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells.</a> Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).</li>
<li>McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+concentration+in+platelet-rich+plasma+for+the+treatment+of+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143(2012).</li>
<li>Boswell, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+platelet+concentrations+in+leukocyte-reduced+platelet-rich+plasma+decrease+collagen+gene+synthesis+in+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons.</a> Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).</li>
<li>Virchenko, O., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+one+platelet+injection+after+tendon+injury+lead+to+a+stronger+tendon+after+4+weeks%3F%3A+Interplay+between+early+regeneration+and+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation.</a> Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Płytki krwi są niezbędne we wczesnej fazie zapalnej procesu gojenia się ścięgien. Kiedy te płytki krwi są wystawione na działanie tkanki wiążącej lub czynników indukujących krzepnięcie, uwalniają czynniki wzrostu, które są przechowywane w α granulkach. W wyniku tej interakcji syntetyzowane są makrocząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej i namnażają się komórki mezenchymalne. Płytki krwi mają również działanie chemotaktyczne na komórki progenitorowe w krążeniu krwi, zwiększając angiogenezę i stymulując różnicowanie komórko...

Koagulacja, procesy zapalne i rola płytek krwi w modulacji odporności są dobrze znane1. Niedawno wykazano, że mają one również właściwości regenerujące2,3. Rzeczywiście, różne cytokiny i czynniki wzrostu (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I i HGF) są uwalniane przez płytki krwi podczas degranulacji. Te czynniki wzrostu sprzyjają angiogenezie, przebudowie tkanek i gojeniu się ran (kości, skóry, mięśni, ścięgien)2. Wirowanie krwi autologicznej wytwarza osocze bogatopłytkowe (PRP), które zawiera wysokie stężenia płytek krwi w zależności od metody izolacji (od 3 do 10 razy większe niż stężenie wyjściowe we krwi). Rzeczywiście, różne techniki przygotowania PRP nie są w stanie zapewnić identycznego produktu końcowego. Do tej pory nie osiągnięto w tej sprawie ogólnego porozumienia międzynarodowego. Ogólnie rzecz biorąc, PRP może być atrakcyjną opcją terapeutyczną w leczeniu przewlekłych schorzeń układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak tendinopatia, zapalenie rozcięgna podeszwowego, choroba zwyrodnieniowa stawów i brak zrostu4. Po raz pierwszy zastosowano go w chirurgii jamy ustnej i implantologii4 w celu poprawy i przyspieszenia gojenia kości po wszczepieniu implantu dentystycznego. W tym badaniu opisujemy powtarzalną metodę, która pozwala na pozyskanie PRP do eksperymentów na zwierzętach4.
Ponieważ uszkodzenia ścięgien są często obserwowane u sportowców i osób pracujących fizycznie, bardzo interesujące jest usprawnienie procesu gojenia, a tym samym skrócenie czasu rekonwalescencji5. Nowe metody leczenia, które się rozwijają, często obejmują stosowanie czynników wzrostu, a podawanie PRP jest prostym i minimalnie inwazyjnym sposobem dostarczania mieszanki endogennych czynników wzrostu4.
Kilka badań in vitro lub na zwierzętach wykazało, że podawanie osocza zawierającego wysoki poziom płytek krwi, poprzez uwalnianie biologicznych mediatorów, może stymulować naprawę ścięgien i więzadeł poprzez uwalnianie biologicznych mediatorów6,7,8,9. Ponadto inne badania wykazały, że PRP może stymulować syntezę kolagenu typu I i III w komórkach ścięgien9,10,11. Zasugerowano również, że PRP może zmniejszać aktywację metaloproteinaz macierzy (MMP), a tym samym zmniejszać degradację macierzy. Komórki biorące udział w procesie zapalnym mogą wytwarzać MMP-9, który odgrywa rolę w przebudowie tkanek (fizjologicznej i patologicznej) wywołanej stanem zapalnym12.
Na podstawie tych informacji, postawiliśmy hipotezę, że pojedyncze wstrzyknięcie PRP w przecięte ścięgna Achillesa szczurów może poprawić proces regeneracji i wytrzymałość mechaniczną naprawianej tkanki. Jest to testowane poprzez pomiar właściwości biomechanicznych gojących się ścięgien podczas procesu rekonwalescencji oraz poprzez przeprowadzanie analiz histologicznych i molekularnych w celu oceny przebudowy kolagenu w nowo powstałej tkance. Celem pracy było sprawdzenie, czy jednorazowe wstrzyknięcie allogenicznego PRP może wpływać na gojenie się przeciętych ścięgien Achillesa.

<table><tbody><tr><td>Ksylazyna (Xyl-M)</td><td>VMD</td><td>brak</td><td>znieczulający</td></tr><tr><td>Ketamin (J&eacute; tamine 1000 CEVA)</td><td>CEVA Sant&eacute; Animale</td><td>brak</td><td>znieczulenia</td></tr><tr><td>Buprenorfina (Veterg&eacute; sic Multidosis)</td><td>ALSTOE</td><td>brak</td><td>Przeciwbólowy</td></tr><tr><td>iso-Betadine</td><td>MEDA-Pharma</td><td>brak</td><td>Odkażająca</td></tr><tr><td>przędza resorbowalna Vicryl 6/0</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nembutal</td><td>CEVA Sant&eacute; Animale</td><td>brak</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Zachowuje strukturę tkanki</td></tr><tr><td>Izopropanol 100%</td><td>VWR</td><td>20,922,364</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td>VWR</td><td>20,823,362</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR</td><td>28973.363</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>VWR</td><td>LEIC3950.1006</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Millipore</td><td>1.15938.0025</td><td>Barwnik</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Millipore</td><td>1.15935.0100</td><td>Barwnik</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (prp) na proces gojenia przeciętych ścięgien achillesa szczurów: opis metodologiczny

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

Ten artykuł opisuje procedury eksperymentalne używane do obserwacji, czy PRP może pozytywnie wpływać na gojenie ścięgien. Istnieją 4 główne kroki, które należy wykonać: wywołanie zmiany w ścięgnie Achillesa; przygotować PRP i wstrzyknąć go (lub roztwór soli fizjologicznej); usunąć ścięgno; i przeprowadzaj oceny biomechaniczne, molekularne i histologiczne. Na każdym etapie wszystkie procedury i metody są szczegółowo opisane, dzięki czemu można je łatwo odtworzyć.
Ścięgna Achillesa zostały chirurgicznie przecięte (usunięcie odcinka o długości 5 mm). Następnie wstrzyknięto PRP lub roztwór soli fizjologicznej, aby zbadać, czy PRP ma pozytywny wpływ na gojenie się ścięgna. Trzy grupy po 40 zwierząt (w sumie w tym badaniu wykorzystano 120 szczurów) podzielono na 2 podgrupy: grupę iniekcji PRP i grupę kontrolną wstrzykiwania soli fizjologicznej. Szczury uśmiercano w coraz większych punktach czasowych (Grupa A: 5 dni; Grupa B: 15 dni; Grupa C: 30 dni) i usunięto ścięgna. 90 ścięgien poddano testom biomechanicznym przed wykonaniem analizy transkryptomicznej, a 30 pozostałych ścięgien poddano analizie histologicznej.

Wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe średniej i porównano za pomocą analizy wariancji (ANOVA). Zastosowano dwuczynnikową analizę ANOVA oraz parametryczny test post hoc de Scheffé.
Maksymalna wytrzymałość na rozciąganie (UTS) wymagana do spowodowania zerwania nieuszkodzonych ścięgien Achillesa u szczurów wynosiła 42,0 ± 5,7 N (n = 10). Wytrzymałość na rozciąganie wzrosła znacząco (p&lt;0,0001) w obu...

Ten protokół opisuje proces oceny gojenia ścięgien u szczurów, którym wstrzyknięto allogeniczne osocze bogatopłytkowe (PRP) lub roztwór soli fizjologicznej po usunięciu części ścięgna Achillesa. Postęp gojenia ścięgien jest oceniany w kilku punktach czasowych za pomocą różnych rodzajów analiz.

Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja wpływu pojedynczej iniekcji osocza bogatopłytkowego (PRP) na wytrzymałość oraz proces gojenia chirurgicznie przeciętych ścięgien Achillesa u szczurów w różnych punktach czasowych. Metoda ta pozwala na szybkie uzyskanie odpowiedzi na pytania z zakresu układu mięśniowo-szkieletowego dotyczące uszkodzeń ścięgien. Główną zaletą tej techniki jest wysoki stopień standaryzacji procedur chirurgicznych, biomechanicznych oraz etapów podawania PRP.Implikacje tych technik rozciągają się na zastosowanie PRP u ludzi, ponieważ tego rodzaju uszkodzenia oraz proces gojenia ścięgien są podobne u szczurów i ludzi. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat przygotowania PRP w przypadku urazów układu mięśniowo-szkieletowego, opisana technika iniekcji może zostać zastosowana również w innych układach, takich jak w chorobach serca lub skóry. Wizualna demonstracja metody jest bardzo ważna, ponieważ kroki chirurgiczne i biomechaniczne wymagają spójnej powtarzalności w celu uzyskania optymalnych wyników.Zacznij od zważenia szczura i założenia mu kolczyka ucha. Po potwierdzeniu odpowiedniego stopnia sedacji poprzez uciśnięcie palca, nanieś krople wody na rogówki zwierzęcia i usuń sierść z lewej kończyny tylnej. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę roztworem iso-Betadine w rozcieńczeniu 1:10, a następnie umieść zwierzę na podkładce grzewczej o temperaturze 20 °C pod mikroskopem stereoskopowym w pozycji bocznej, z lewą kończyną tylną ułożoną na górze.Chwyć opuszkę lewej kończyny tylnej pęsetą i wykonaj boczne nacięcie skóry o długości od 20 do 25 mm w okolicy ścięgna Achillesa. Za pomocą drobnych nożyczek rozdziel powięź, aby odsłonić kompleks ścięgna Achillesa, a następnie usuń ścięgno mięśnia płaszczkowatego. Przetnij ścięgno Achillesa w poprzek, 5 mm proksymalnie od jego przyczepu do kości piętowej, i usuń fragment o długości 5 mm.Następnie należy użyć nici wchłanialnej i kontynuować szycie w celu zamknięcia powięzi oraz skóry, a następnie umieścić szczura pod źródłem ciepła i monitorować go aż do pełnego powrotu do zdrowia. Podczas rekonwalescencji zwierząt biorców, należy pobrać 20 ml krwi pełnej z serca jednego szczura dawcy na każde zwierzę eksperymentalne do oddzielnych probówek zawierających 3,2% buforowanego cytrynianu sodu. Aby uzyskać osocze bogatopłytkowe, należy odwirować krew i za pomocą plastikowej pipety transferowej ostrożnie zebrać górną fazę zawierającą PRP do drugiej plastikowej probówki.Należy określić objętość pobranego PRP i zmierzyć liczbę płytek krwi za pomocą analizatora hematologicznego. PRP należy ponownie odwirować, a nadsącz ostrożnie przenieść do nowej plastikowej probówki. Pozostała objętość w probówce z PRP powinna wynosić około 2/3 objętości wymaganej do uzyskania stężenia 2,5 × 10⁶ płytek na mikrolitr.Następnie należy delikatnie resuspendować osad płytek krwi za pomocą pipetowania. Należy zmierzyć liczbę płytek krwi w tak otrzymanej skoncentrowanej osoczu bogatopłytkowej, dodając w razie potrzeby odpowiednią objętość autologicznego osocza ubogopłytkowego, aby osiągnąć docelowe stężenie. Płytki krwi należy aktywować, dodając 50 µL chlorku wapnia na 1 mL PRP i inkubując przez około jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie należy pobrać płytki krwi do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 21G i wstrzyknąć 50 µL płytek bezpośrednio w miejsce szwu każdego zwierzęcia. W odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu należy ogolić lewą tylną kończynę znieczulonego zwierzęcia doświadczalnego i umieścić szczura pod mikroskopem stereotypowym, tak jak właśnie zaprezentowano. Trzymając łapę palcami, należy wykonać 10-milimetrowe nacięcie w miejscu operacyjnym, aby odsłonić mięsień trójgłowy łydki (triceps suralis).Aby usunąć ścięgno Achillesa, należy przeciąć kość piętową w poprzek, 5 do 10 mm dystalnie od miejsca przyczepu i wypreparować fragment mięśnia trójgłowego łydki wystarczająco duży, aby zmieścił się w uchwycie kriogenicznym. Za pomocą pęsety należy natychmiast umieścić próbkę w górnym uchwycie urządzenia kriogenicznego i zamknąć instrument. Następnie należy pionowo umieścić uchwyt kriogeniczny w uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej i zamocować kość piętową pomiędzy dolnymi zaciskami.Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego, należy ustawić kamery prostopadle do siebie. Do obu zbiorników szczęki górnej należy wlać ciekły azot, aby zamrozić mięsień do stopnia sztywności o rząd wielkości większego niż w przypadku ścięgna, tak aby nie ulegał on odkształceniu podczas próby rozciągania. Gdy strefa zamrażania osiągnie krawędź metalowego zacisku, należy ustawić stałą prędkość przemieszczenia maszyny na poziomie 1 mm/s aż do momentu zerwania i rozpocząć próbę rozciągania, wykorzystując komputer do zapisu maksymalnej wytrzymałości na rozciąganie w niutonach.Aby uwzględnić różnice w powierzchniach przekroju poprzecznego gojących się ścięgien, należy znormalizować maksymalną wytrzymałość na rozciąganie do jednostki powierzchni, która reprezentuje naprężenie mechaniczne występujące w tkance. Następnie, po pęknięciu ścięgna, próbki pękniętych ścięgien należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA i analizy RTPCR. W tym reprezentatywnym eksperymencie w każdym z badanych punktów czasowych do wywołania pęknięcia ścięgna wymagana była większa siła w grupie z wstrzykniętym PRP niż w grupie kontrolnej traktowanej solą fizjologiczną, co sugeruje bardziej efektywny proces gojenia lub lepsze właściwości mechaniczne u zwierząt leczonych PRP.Chociaż w grupie PRP odnotowano większy rozrzut wewnątrzgrupowy niż w grupie z solą fizjologiczną, stwierdzono, że pole przekroju poprzecznego ścięgien było większe w grupie po wstrzyknięciu PRP w 15. i 30. dniu po wywołaniu uszkodzenia. Ponadto barwienie trichromem Massona wykazało większą obecność kolagenu włóknistego, kluczowego składnika morfologii i wytrzymałości ścięgien, u zwierząt leczonych PRP w piątym i piętnastym dniu, przy czym w obu grupach zaobserwowano podobną intensywność barwienia do 30. dnia po wstrzyknięciu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wywołać standardowe uszkodzenia u szczura oraz jak pobrać próbki ścięgien w celu oceny procesu ich gojenia po wstrzyknięciu PRP.

effects-allogeneic-platelet-rich-plasma-prp-on-healing-process

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę wstrzykiwania osocza bogatopłytkowego (PRP) do przeciętego ścięgna Achillesa u szczurów. Mały segment jest wycinany ze ścięgna Achillesa szczura biorcy, miejsce jest zszywane, a szczur może wyzdrowieć. Jednocześnie krew pełna jest pobierana od szczura dawcy i odwirowywana w celu uzyskania PRP, który jest następnie aktywowany i wstrzykiwany w miejsce zszycia szczura biorcy w celu wywołania naprawy ścięgien.

Wstrzyknięcie osocza bogatopłytkowego do przeciętego ścięgna Achillesa szczura

Zakażenie związane z implantem jest poważnym powikłaniem klinicznym. W niniejszym badaniu opisano podejście wykorzystujące osocze bogatopłytkowe (PRP) w celu zapobiegania zakażeniom związanym z implantami, przedstawiono protokół przygotowania PRP ze stałym stężeniem płytek krwi oraz opisano nowo zidentyfikowane właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP i powiązane protokoły badania takich właściwości przeciwdrobnoustrojowych in vitro.

PRP jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: przygotowanie i właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP in vitro

Ten artykuł ma na celu opisanie międzypęcherzykowych autologicznych ostrzyżeń osocza bogatopłytkowego (0,20 ml xcm2) w skórę głowy 23 pacjentów dotkniętych łysieniem androgenowym na głębokości 5 mm przy użyciu medycznego pistoletu iniekcyjnego wyposażonego w igłę o rozmiarze 30, w trzech sesjach.

Mechaniczne i kontrolowane iniekcje PRP u pacjentów dotkniętych łysieniem androgenowym

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego jest często obserwowana na oddziale ortopedycznym. Szczegółowo przedstawiamy cały proces leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego za pomocą iniekcji osocza bogatopłytkowego, w tym przygotowanie, zabiegi i ocenę.

Przygotowanie, procedury i ocena iniekcji osocza bogatopłytkowego w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania frakcji zrębowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej i jej zastosowanie do poprawy funkcji kolana poprzez regenerację tkanki chrzęstnej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Lizaty płytkowe stanowią nowe narzędzie do leczenia chorób powierzchni oka. W tym miejscu proponujemy metodę przygotowania, dozowania, przechowywania i charakterystyki lizatu płytkowego pobranego od dawców płytek krwi.

Lizat osocza bogatopłytkowego w leczeniu chorób powierzchni oczu

Osocze bogatopłytkowe (PRP) jest stosowane w leczeniu schorzeń układu mięśniowo-szkieletowego koni. Różne techniki dają PRP o różnych stężeniach płytek krwi i leukocytów. W artykule opisano metodę pozyskiwania PRP z krwi koni.

Prosta metoda podwójnej probówki wirującej do uzyskiwania osocza bogatopłytkowego z krwi koni

Nowy gatunek komórkowego białka prionowego (PrPC) został niedawno zidentyfikowany w niezakażonych ludzkich mózgach przy użyciu opisanych tutaj metod. Metody te mogą być wykorzystane do izolacji różnych gatunków PrP, a niektóre z nich są również przydatne w izolacji innych agregatów białek o błędnej strukturze z ludzkich mózgów.

Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Poznaj metodę oceny gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów po zastrzyku osocza bogatopłytkowego (PRP) lub soli fizjologicznej. Protokół obejmuje standaryzowane procedury chirurgiczne i biomechaniczne analizy wytrzymałościowe.

Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny (Wideo) | JoVE Journal

Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny

Przeglądaj więcej filmów