Name: Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Poznaj nową metodę przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka do oceny potencjału komórek macierzystych śródbłonka naczyniowego. Technika umożliwia wizualizację tworzenia naczyń krwionośnych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31530045 i 31371500 do Y.A.Z., 31401245 do Q.C.Y.), Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2014CB964800), Chińską Akademię Nauk (XDB19000000 do Y.A.Z.) oraz Chińskie Towarzystwo Biologii Komórki (stypendium Early Career Fellowship dla Q.C.Y.).

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Biochemii i Biologii Komórki w Szanghaju, Chińskiej Akademii Nauk zgodnie z zatwierdzonym protokołem SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Izolacja VESCs od gruczołu sutkowego myszy
<ol>
	<li>Pobieranie gruczołów sutkowych i trawienie tkanek.
	<ol>
		<li>Jako dawców tkanek należy użyć 8-tygodniowych dojrzałych dziewiczych myszy reporterowych Actin-GFP o masie od 20 do 25 g. 
		Uwaga: Komórki pochodzące od dawcy można łatwo śledzić za pomocą ekspresji GFP.</li>
		<li>Przygotować podłoże do trawienia tkanek składające się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% wstrzykiwacza/paciorkowca i 25 mM HEPES w RPMI1640. Przefiltruj mieszaninę przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji i wstępnego ogrzania do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Poświęć myszy w komorze CO2 . Wypreparuj czwartą parę pachwinowych gruczołów sutkowych, wykonując najpierw pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha za pomocą skalpela (lub nożyczek chirurgicznych). Delikatnie oderwij skórę na bok, aby odsłonić pachwinowy gruczoł sutkowy za pomocą kleszczy. Pobrać czwarte pachwinowe gruczoły sutkowe z obu stron i pokroić je nożyczkami na drobne kawałki na 6-centymetrowej szalce Petriego.
		<ol>
			<li>Zmierz całkowitą masę zmielonej tkanki i umieść ją w probówce o pojemności 50 ml. 
			Uwaga: Upewnij się, że powstałe mięso tkankowe jest mniejsze niż 1mm3 dla każdego kawałka. Typowy plon wynosi około 5 000 VESC na zwierzę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować podłoże bazowe do wytrawiania w zakrytej 50 ml probówce wirówkowej o objętości 10 ml na 1 g mielonej tkanki. Dodać kolagenazę typu 3 w stężeniu 300 jednostek na 10 ml podłoża bazowego do wytrawiania, aby utworzyć bufor do wytrawiania. Wymieszaj równomiernie i dodaj do zmielonej tkanki.</li>
		<li>Umieść poziomo probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na platformie kołyszącej i ustaw prędkość na 100 obr./min, a temperaturę na 37 °C. Mieszaj tkankę sutkową przez 2 godziny. Sprawdzaj i ręcznie potrząsaj probówką co 20 minut, aby zapewnić prawidłowe trawienie. 
		Uwaga: Celem trawienia tkanek przed FACS jest przygotowanie roztworu jednokomórkowego z tkanki stałej. Dlatego pod koniec trawienia zawartość powinna być gęstym roztworem bez widocznych kawałków tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu jednokomórkowego.
	<ol>
		<li>Po roztrawieniu uzupełnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml wstępnie podgrzanym, sterylnym PBS i odwróć probówkę, aby równomiernie wymieszać. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
		<li>Usunąć supernatant i przesunąć spód probówki, aby poluzować osad komórkowy. Dodać 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (patrz tabela materiałów) i inkubować w kapturze do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.</li>
		<li>Dodaj 10 ml sterylnego PBS i odwróć probówkę, aby równomiernie wymieszać. Odwirować zawartość tkanek o sile 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Dodać 3 ml podgrzanej 0,05% trypsyny i przechowywać probówkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby dalej trawić pozostałą tkankę.</li>
		<li>Dodać 3 ml wstępnie podgrzanego IMDM, a następnie dodać 100 μl roztworu DNazy I (0,25 mg DNazy I rozcieńczonej w 1 ml PBS). Przechowywać probówkę w temperaturze 37 °C w celu rozdrobnienia włókien DNA. Przepuść mieszaninę tkanek przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm, aby uzyskać roztwór komórkowy. Przepłucz sitko dwukrotnie 2 ml PBS + 5% FBS, aby zneutralizować trawienie enzymatyczne.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę komórek przy 200 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 5% FBS w celu barwienia przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja Procr+ VESC oparta na FACS.
	<ol>
		<li>Mieszaninę komórek uzyskaną z tkanki sutka dawcy należy poddać barwieniu przeciwciałami zgodnie z opublikowanymi rutynowymi protokołami8. 
		Uwaga: Zastosowano następujące przeciwciała: anty-mysia linia krwi-FITC, anty-mysia CD31(PECAM1)-PECY7, anty-mysia CD105-APC (wszystkie stosowane w stężeniu 1 μg/ml), anty-mysie CD201 (Procr)-biotyna (stosowana w stężeniu 2,5 μg/ml) i streptawidyna-v450 (stosowana w stężeniu 0,5 μg/ml).
		<ol>
			<li>Po wybarwieniu przeciwciałami uzupełnić komórki PBS + 5% FBS, a następnie odwirować przy 200 g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki 1 ml PBS + 5% FBS. Przefiltrować przez sitko komórkowe o średnicy 40 μm. Umieść na lodzie do sortowania FACS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kontynuuj sortowanie oparte na FACS, aby wyizolować Procr+ VESCs.
		<ol>
			<li>Przeanalizuj niebarwioną próbkę i każdą jednokolorową kontrolę, aby określić napięcie dla każdego koloru. Oblicz parametry kompensacji, aby uniknąć autofluorescencji lub barwienia tła. Skonfiguruj szablon do prawidłowego bramkowania i sortowania dla żądanych populacji komórek.</li>
			<li>Aby ustalić hierarchię sortowania FACS, najpierw wyeliminuj zanieczyszczenia ze wszystkich zdarzeń, a następnie odrzuć dublety lub skupiska komórek adhezyjnych, wyzwalając za pomocą szerokości. Wyodrębnij komórki linii krwi, a następnie użyj CD31+ i CD105+ do zdefiniowania populacji śródbłonka. 
			Uwaga: Komórki Procr+ wyizolowano z EC CD31+ CD105+ w porównaniu z kontrolą FMO. Reprezentatywny wykres analizy FACS jest pokazany na Rysunek 1. Izolowaną przez FACS populację VESC należy zawiesić w IMDM + 50% FBS i przechowywać na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test tworzenia naczyń VESC in vivo przy użyciu poduszeczki tłuszczowej ssaka
<ol>
	<li>Przygotuj pierwotne EC do przeszczepu.
	<ol>
		<li>Uzupełnij komórki posortowane przez FACS 10 ml PBS + 5% FBS, a następnie odwiruj przy 200 x g przez 5 minut, aby osadzić komórki na dnie.</li>
		<li>Ostrożnie odessać płyn, policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić osad komórkowy mieszaniną macierzy błony podstawnej (składającą się z 50% matrycy błony podstawnej i PBS z 20% FBS, uzupełnionego 100 ng/ml rmVEGF i 60 U/ml heparyny), aby osiągnąć stężenie robocze 15 000 komórek/15 μL. 
		Uwaga: Mieszanina matrycy błony podstawnej powinna być zawsze przechowywana na lodzie.</li>
		<li>Seryjnie rozcieńczać posortowane i policzone komórki, aby osiągnąć wymagane stężenia wejściowe w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, upewniając się, że końcowe objętości iniekcji nie przekraczają łącznie 15 μl. Dodaj 0,1% błękitu trypanowego do każdej probówki, aby uzyskać lepszą wizualizację zawartości podczas przeszczepu. Dokładnie odpipetować do wymieszania. Przechowuj probówki na lodzie do czasu użycia. 
		Uwaga: Pomyślne wygenerowanie statku można osiągnąć przy użyciu co najmniej 100 VESC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszczep pierwotne EC do poduszeczki tłuszczowej sutka.
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj narzędzia chirurgiczne i blat stołu. W przypadku używania tych samych narzędzi na wielu zwierzętach, do dezynfekcji można użyć sterylizatora perełek.</li>
		<li>Znieczulenie 3-tygodniowych nagich myszy BALB/c przy użyciu protokołu znieczulającego zalecanego przez lekarza weterynarii Twojej instytucji i IACUC. Połóż każdą mysz w pozycji leżącej, plecami do stołu operacyjnego. Unieruchomić jego kończyny za pomocą taśmy klejącej.</li>
		<li>Zanurz bawełniany wacik w roztworze antyseptycznym na bazie jodu. Dokładnie wytrzyj cały obszar brzucha myszy, aby wysterylizować powierzchnię skóry przed zabiegiem.</li>
		<li>Przytrzymaj i unieś skórę brzucha myszy za pomocą kleszczy. Za pomocą skalpela chirurgicznego wykonaj małe, pionowe nacięcie o długości 1 cm. Wykonaj dwa nacięcia o długości około 0,5 - 1 cm, każde w kierunku tylnej nogi, aby uzyskać odwrócone nacięcie w kształcie litery Y.
		<ol>
			<li>Użyj kleszczyków i bawełnianego wacika, aby delikatnie oddzielić skórę od brzucha i przypiąć skórę na boki, aby odsłonić pachwinowe gruczoły sutkowe. Umieść mysz pod stereoskopem i ustaw powiększenie na 2.0X. Upewnij się, że ustawiłeś ostrość tak, aby poduszeczka tłuszczowa sutka była wyraźnie widoczna i operowana.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść igłę 27G 1/2" na lodzie, aby wstępnie schłodzić. Zagruntować wcześniej strzykawkę o pojemności 1 ml mieszaniną macierzy membrany podstawnej, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza uwięzione w obszarze mocowania igły. Odpipetować 15 μl zmieszanego roztworu na nasadkę probówki do mikrowirówki, a następnie odessać całą objętość do zalanej strzykawki.</li>
		<li>Przytrzymaj poduszeczkę tłuszczową sutka przed pachwinowym węzłem chłonnym za pomocą cienkiej pęsety i lekko ją unieś, aby ułatwić wstrzyknięcie. Delikatnie włożyć około 1/4 igły strzykawki do poduszki tłuszczowej.
		<ol>
			<li>Zwolnij pęsetę z podkładki do ssania, aby chwycić i ustabilizować igłę strzykawki. Wstrzykiwać roztwór powoli, aby zapobiec wyciekowi płynu. Przytrzymaj przez kilka sekund, aby upewnić się, że mieszanina komórek zestaliła się, aby zminimalizować wyciek podczas wyciągania igły.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zamknij płat skóry za pomocą wchłanialnych szwów. Zszyj płat skóry za pomocą niereaktywnego szwu monofilamentowego w rozmiarze 5-0 i zamknij rany węzłami chirurgicznymi, każdy węzeł jest oddalony od siebie o około 0,3 cm. Alternatywnie zamknij skórę zszywkami do ran.</li>
		<li>Umieść operowane myszy w osobnej klatce w celu odzyskania zdrowia. Umieść lampę grzewczą nad klatką, aby znieczulone myszy nie cierpiały z powodu hipotermii. Umieść miękki papier i bawełnę na dnie klatki, aby utrzymać myszy w cieple po operacji.
		<ol>
			<li>Uważnie obserwuj myszy, aż wszyscy biorcy będą w pełni obudzeni. Przez kilka następnych dni należy zapobiegawczo stosować pooperacyjne leki przeciwbólowe u wszystkich zwierząt lub zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii placówki. Zastosuj antybiotyki zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt, jeśli dojdzie do zakażenia rany. Jeśli rana pooperacyjna została zamknięta zszywkami, należy zdjąć klipsy do rany 10 dni po zabiegu, gdy rana całkowicie się zamknie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek do obserwacji mikroskopowych w całości
<ol>
	<li>Pobieranie tkanek
	<ol>
		<li>Po 2-4 tygodniach od implantacji należy znieczulić nagie myszy biorcy BALB/c wstrzyknięciem dootrzewnowym 2,5% środka znieczulającego w dawce 0,12 ml na 20 g masy ciała, jak w kroku 2.2.2. 
		Uwaga: Dodatni wzrost naczyń można wykryć 2 - 4 tygodnie po przeszczepie komórek.</li>
		<li>Oznaczyć krążenie ogólnoustrojowe biorcy wstrzyknięciem do żyły ogonowej barwnika izollektyny-647 w dawce 50 μg/25 g masy ciała, zawieszonego w 50 μl sterylnego PBS. Odczekaj okres odpoczynku 5 - 10 minut. Poświęć myszy za pomocą CO2 .</li>
		<li>Wyciąć obszar tkanki sutka, w którym komórki zostały początkowo wstrzyknięte zgodnie z krokiem 2.2.4; użyj nożyczek chirurgicznych. Za pomocą ostrza chirurgicznego pokrój tkankę w około 3-milimetrową kostkę o grubości od3 do 4 mm na 6-centymetrowej szalce Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie tkanek i przygotowanie do barwienia przeciwciał.
	<ol>
		<li>Trawić fragmenty tkanek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki bazowej do wytrawiania (etap 1.1.2) uzupełnionej kolagenazą III (300 j. na 10 ml).</li>
		<li>Umieść probówkę wirówkową o pojemności 15 ml poziomo na platformie kołyszącej z prędkością ustawioną na 100 obr./min i temperaturą ustawioną na 37 °C na około 1 godzinę, aby rozluźnić strukturę tkanki i usunąć nadmiar tkanki adipocytów. 
		Uwaga: Adipocyty mają tendencję do wytwarzania autofluorescencji, co może powodować głośne tło fluorescencyjne. Pod koniec trawienia kawałki tkanki powinny mieć miękki, mętny wygląd. Optymalny okres trawienia zależy od wielkości rozdrobnionych kawałków tkanek i dlatego powinien być odpowiednio dostosowany, aby uzyskać najlepsze wyniki. Ponieważ unaczynienie tkanek zostało już oznaczone znakowaną fluorescencyjnie izollektyną, wszystkie poniższe procedury należy przeprowadzać w celu ochrony przed światłem.</li>
		<li>Umyj kawałki chusteczki PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Utrwal całą zmontowaną chusteczkę, ostrożnie umieszczając kawałki na 6-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej do połowy z 4% PFA (pH 7,2 - 7,4), aby zachować fluorescencję. Umieść szalkę Petriego na platformie kołyszącej i delikatnie mieszaj tkankę przez 30 minut w temperaturze RT. 
		Uwaga: PFA jest substancją rakotwórczą i należy obchodzić się z nią ostrożnie.</li>
		<li>Usuń pozostały PFA i umyj utrwaloną chusteczkę trzykrotnie buforem do płukania w całości (0,1% w PBS), z 10-minutowym odstępem między każdym praniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciał tkankowych w całości.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze do barwienia przeciwciał w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Inkubować tkankę z pierwszorzędowym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Jako przeciwciała pierwszorzędowe zastosowano szczurzą anty-CD31 (stężenie: 10 μg/ml) lub szczurzą anty-VE-kadherynę (CD144/Cdh5; stężenie: 2,5 μg/ml). Zarówno CD31, jak i VE-kadheryna są markerami powierzchniowymi komórek używanymi do rozpoznawania śródbłonka. 5x bufor do barwienia przeciwciał przygotowuje się z 500 mM kwasu maleinowego o pH 7,5; 750 mM NaCl; i 0,5% (v/v) tween rozpuszcza się w PBS. Dodawaj tylko odpowiednią objętość surowicy (5%) podczas przygotowywania świeżego 1x roztworu roboczego9.</li>
		<li>Usunąć bufor do barwienia przeciwciał i przemyć całą tkankę trzykrotnie buforem do przemywania w odstępie 10 minut. Inkubować tkankę z przeciwciałem drugorzędowym (patrz tabela materiałów) oraz DAPI w temperaturze pokojowej przez 4 godziny na platformie kołyszącej lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Użyj DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) w końcowym stężeniu 5 μg / ml do wizualizacji jąder.</li>
		<li>Przemyj całą chusteczkę buforem do płukania 3 razy po 10 minut. Inkubuj kawałki tkanek w 80% glicerolu lub 80% sacharozie przez noc, aby odwodnić tkankę dla lepszej konserwacji.</li>
		<li>Umieść poszczególne kawałki tkanki na szkiełku podstawowym i usuń nadmierny bufor odwodnieniowy. Przykryj chusteczkę podłożem montażowym, umieść szkiełko nakrywkowe i delikatnie ściśnij chusteczkę, aby ją utrwalić.</li>
		<li>Wykonaj konfokalną akwizycję obrazu mikroskopowego. W przypadku całych gruczołów sutkowych uzyskaj obrazy za pomocą obiektywu 40X z NAW = 1,3 oleju. Skany kafelków stosów Z w rozdzielczości optycznej 1 024 x 1 024 i separacji warstw 1,0 - 1,2 μm. 
		Uwaga: Aby uchwycić prawidłowy sygnał świetlny fluorescencji, rozdzielacz wiązki filtra powinien być ustawiony na potrójny dichroiczny (TD) 488/553/638, z ustawieniem wzmocnienia na wzmocnienie PMT 600-800. Należy stosować następujące źródła wzbudzenia/emisji: mGFP, o maksimum wzbudzenia/emisji 488/509 nm; mTomato o maksimach wzbudzenia/emisji 532/588 nm; Alexa-647, z maksimum wzbudzenia/emisji 594/665; i DAPI, z maksimami wzbudzenia/emisji 350/470.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Śledzenie linii przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy
<ol>
	<li>Wykrywanie Procr+ VESCs przy użyciu modelu myszy.
	<ol>
		<li>Użyj szczepu myszy knock-in ProcrCreERT2-IRES-tdTomato/+ (określanego jako ProcrCreERT2). 
		Uwaga: W tym modelu myszy po pierwszym kodonie ATG klasy Procr<sup="xref">11 wstawia się CreERT2-IRES-tdTomato cassette10.
		<ol>
			<li>Skrzyżowanie myszy Procr CreERT2 ze szczepem reporterowym Rosa26mTtomatomGFP (określanym jako R26mTmG) w celu prześledzenia losów endogennych EC Procr+ in vivo11. Zidentyfikuj wszystkie znakowane endogenne EC Procr+ i ich potomków za pomocą wyrażenia GFP.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podawać roztwór tamoksyfenu11 (10 mg tamoksyfenu rozpuszczone w 1 ml oleju arachidowego + 10% etanolu w celu uzupełnienia roztworu podstawowego 10 mg/ml) dootrzewnowo w dawce 4 mg/25 g masy ciała w okresie dojrzewania (5 tygodni) w celu śledzenia losów rozwojowych EC Procr+.</li>
		<li>Przeanalizuj skuteczność tworzenia klonów znakowanych komórek przez barwienie immunologiczne w całości, postępując zgodnie z krokami przygotowania opisanymi w kroku 3. Uzyskaj poduszeczki tłuszczowe sutka od leczonych myszy zarówno po krótkim okresie (2 dni), jak i dłuższym (do 10 miesięcy). Zobacz Rysunek 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+infusion+of+bone+marrow+in+patients+receiving+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy.</a> N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).</li>
<li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li>
<li>Bompais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+derived+from+circulating+progenitors+display+specific+functional+properties+compared+with+mature+vessel+wall+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells.</a> Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).</li>
<li>Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+blood+vessels+from+a+single+c-kit%2B+adult+vascular+endothelial+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell.</a> PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).</li>
<li>Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+resident+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+population+in+preexisting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels.</a> EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracking adult stem cells.</a> Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).</li>
<li>Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+blood+vascular+endothelial+stem+cells+by+the+expression+of+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor.</a> Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+mammary+stemcells+by+protein+C+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression.</a> Nature. 517, 81-U201 (2015).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Retina+as+an+Angiogenesis+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The Mouse Retina as an Angiogenesis Model.</a> Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Fibrin+Gel+on+Mouse+Lung+to+Study+Lung-specific+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Testy angiogenezy stanowią dobre eksperymentalne podejście do badania dynamiki naczyń krwionośnych. Unaczynienie siatkówki myszy, które rozwija się po urodzeniu, okazało się atrakcyjnym modelem do badania angiogenezy12. Pomimo tego, że jest stosunkowo dostępna, rzeczywista manipulacja w łożysku naczyniowym siatkówki jest raczej trudna. Do tej pory najlepiej opisanym przeszczepem in vivo był test czopowy, który zamyka komórki w masie macierzy błony podstawnej i chirurgicznie wszczepia/wstr...

Podczas rozwoju i homeostazy, wzrost i przebudowa naczyń odbywa się wiernie zgodnie ze wzrostem i naprawą narządów. Angiogeneza opisuje tworzenie nowych naczyń z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych i jest uważana za główną siłę pośredniczącą w tych dynamicznych zmianach naczyniowych. Każde naczynie krwionośne jest wewnętrznie wyściełane warstwą komórek śródbłonka (EC) i wydają się one być podstawą architektury naczynia. Przez długi czas mechanizm, za pomocą którego pula EC jest uzupełniana podczas homeostazy, pozostawał niejasny i toczyły się spory o to, czy obrót naczyniowy jest wynikiem dojrzałej proliferacji EC, czy też jest wkładem aktywności naczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych. Ze względu na brak bezpośrednich dowodów fizjologicznych, istnienie i tożsamość komórkowa komórek macierzystych śródbłonka naczyń krwionośnych (VESC) również pozostały kontrowersyjne.
Jednym z najczęstszych podejść stosowanych do weryfikacji zachowania komórek macierzystych jest przeszczepianie domniemanych komórek macierzystych myszom biorcom. Metoda ta mierzy potencjał macierzysty kandydujących komórek macierzystych in vivo. Transplantacja została po raz pierwszy zastosowana do badania komórek macierzystych szpiku kostnego1, co przyczyniło się do ustalenia hierarchicznej charakterystyki układu krwiotwórczego2. W polu śródbłonka zatyczka macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) wprowadzana podskórnie pod skórę boku jest standardowym testem angiogenezy in vivo stosowanym w celu zbadania zdolności tworzenia naczyń przeszczepionych EC. Wiele metod eksperymentalnych, w tym tworzenie kolonii w systemach hodowli 3D i przeszczepianie, zasugerowało potencjalne populacje progenitorów EC/VESC3,4,5,6. Ponieważ jednak EC osadzone w macierzy błony podstawnej są stosunkowo oddzielone od otaczającej tkanki, nie zapewnia to optymalnego środowiska niszowego wymaganego do pełnego zbadania potencjału angiogennego przeszczepionych komórek. W rezultacie, naczynia utworzone w czopie matrycy są w przeważającej mierze kapilarne i są funkcjonalnie niemierzalne.
Gruczoł sutkowy rozwija się po urodzeniu, a najmocniejszy wzrost występuje w okresie dojrzewania i ciąży. W okresie dojrzewania nabłonek sutka ulega gwałtownemu rozszerzaniu, aby zająć całą poduszeczkę tłuszczową sutka, czemu towarzyszy sprawna przebudowa otaczających struktur naczyniowych. Tak więc gruczoł sutkowy stanowi doskonały model do badania angiogenezy. Zapewnia przestrzeń, matrycę i bogate bodźce angiogenne z rosnącego nabłonka sutka i dlatego jest idealnym miejscem przeszczepu do oceny potencjału angiogennego komórek egzogennych. Ponadto poduszeczka tłuszczowa sutka umożliwia utworzonym naczyniom egzogennym integrację z układem krążenia gospodarza, umożliwiając dalszą ocenę funkcjonalną i stanowiąc przewagę nad przeszczepem podskórnym.
Chociaż próby hodowli in vitro i transplantacji są równie skutecznym sposobem badania właściwości regeneracyjnych populacji komórek, wiadomo, że takie testy mogą stymulować plastyczność, gdy komórki są zabierane z ich naturalnego środowiska, a zmiany mogą być indukowane, gdy komórki są odłączone od swojego fizjologicznego otoczenia7. W związku z tym uzyskanie bezpośrednich dowodów in vivo na los komórek jest kluczowym podejściem do pogłębienia obecnego zrozumienia zachowania populacji śródbłonka.
Genetyczne mapowanie losu (tj. śledzenie linii in vivo) jest niezbędne do identyfikacji VESCs i badania ich właściwości w organizmie, ponieważ może ujawnić zachowanie komórek macierzystych in vivo w ich fizjologicznym kontekście, a rzeczywista tożsamość macierzysta może być oceniona. Śledzenie linii dostarcza bezpośrednich dowodów na długoterminową trwałość (tj. samoodnawianie) kandydatów na VESC i ich zdolność do wytwarzania typów komórek dla tkanki pochodzenia (tj. siłę różnicowania).
Ten protokół opisuje nowatorską technikę przeszczepiania poduszeczek tłuszczowych u sutków oraz metodę śledzenia linii w celu obserwacji zdolności generowania naczyń krwionośnych przez VESCs. Techniki te przezwyciężają niedociągnięcia obecnie dostępnych testów i zapewniają nowy sposób optymalnej oceny właściwości komórek macierzystych VESC. Podejścia te są skutecznymi narzędziami, które można wykorzystać do oceny zachowania i właściwości tworzenia naczyń krwionośnych w populacjach śródbłonka, a także do określenia zmiany siły działania komórek naczyniowych w środowisku patologicznym.

<table><tbody><tr><td>0,05% Kwas trypsynowo-etylenodiaminowy (EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0,05% Trypsyna</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Jednostka filtrująca</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0,22 &mikro; m Filtr</td></tr><tr><td>2-metylobutanol-2, Reodagent</td><td>Plus Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>Alkohol tert amylowy</td></tr><tr><td>222, Tribrometanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, Tribrometanol</td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol(DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &micro; m Sitko do komórek</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 &micro; m Sitko</td></tr><tr><td>komórkowe Szkiełka mikroskopowe adhezyjne</td><td>CITOGLAS 188105</td><td></td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, klon MJ7/18</td><td>do stosowania w analusie FACS przy 1 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 Biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>do stosowania w analizie FACS w 2,5 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 PE-Cyjanina 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82, klon 390</td><td>do stosowania w analizie FACS w 1 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz Sorter komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>Kolagenaza III</td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>Konfokalna</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnaza I</td></tr><tr><td>Osioł anty-Rat Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>Przeciwciało wtórne, stosować w 0,5 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont - Mikrostępione końcówki</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>Kleszcze</td></tr><tr><td>Hyklon do surowicy bydlęcej</td><td></td><td>płodu SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>Koktajl linii krwi do analizy FACS, stosować przy 25 &mikro; L na test</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Glicerol</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Ilbecco's Medium firmy Dulbecco</td><td>(Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4 firmy Griffonia simplicifolia, Alexa Fluora&nbsp; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>Isolectin-647</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; Matrix (obniżony czynnik wzrostu)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Szczep myszy (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>Szczep myszy (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Szczep myszy&nbsp; (BALB/c nago)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c nago</td><td>Nagie myszy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycyna</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td> Sól fizjologiczna buforowana <td>fosforanem długopisu/paciorkowca</td></tr><tr><td>(pH 7,2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcie ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Medium montażowe Szczur</td></tr><tr><td>anty CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>do analizy całego montażu, anty-VE-Kadheryna / Cdh5 antybdy do ścisłego połączenia śródbłonka, stosowanie przy 2,5 i mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Szczur anty CD31-biotyna</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>do analusy całomocnej, przeciwciało anty-CD31 / PECAM1 dla cząsteczki adhezji powierzchni śródbłonka, stosować przy 10 i mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td></tr><tr><td>Prosty / Ostry-/ 10 cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>Cienkie nożyczki</td></tr><tr><td>Streptawidyna eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>do analizy FACS przy 0,5 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>Pleciony jedwab powlekany woskiem (rozmiar 5-0 USP (1 metryczny), 18 cali (45 cm) na igle C-1)</td><td>Szew COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe łopatki</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>Skalpel</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng Medyczny</td><td>20160101</td><td>Roztwór antyseptyczny</td></tr></tbody></table>

nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Komórki śródbłonka (EC) są podstawowymi elementami budulcowymi architektury naczyniowej i pośredniczą we wzroście i przebudowie naczyń krwionośnych, zapewniając prawidłowy rozwój naczyń i homeostazę. Jednak badania nad hierarchią linii śródbłonka pozostają nieuchwytne ze względu na brak narzędzi do uzyskania dostępu, a także bezpośredniej oceny ich zachowania in vivo. Aby zaradzić temu brakowi, opracowano nowy model tkankowy do badania angiogenezy za pomocą poduszeczki tłuszczowej sutka. Gruczoł sutkowy rozwija się głównie w fazach poporodowych, w tym w okresie dojrzewania i ciąży, podczas których silnej proliferacji nabłonka towarzyszy rozległa przebudowa naczyń krwionośnych. Poduszeczki tłuszczowe sutka zapewniają przestrzeń, matrycę i bogate bodźce angiogenne z rosnącego nabłonka sutka. Ponadto poduszeczki tłuszczowe sutka znajdują się poza jamą otrzewnej, co czyni je łatwo dostępnym miejscem przeszczepu do oceny potencjału angiogennego komórek egzogennych. W pracy opisano również skuteczne podejście do śledzenia przy użyciu fluorescencyjnych myszy reporterowych do specyficznego znakowania docelowej populacji komórek macierzystych śródbłonka naczyniowego (VESC) in vivo. Ta metoda śledzenia linii, w połączeniu z późniejszą mikroskopią całych komórek, umożliwia bezpośrednią wizualizację docelowych komórek i ich potomków, dzięki czemu można określić ilościowo zdolność do proliferacji i zmapować zaangażowanie w różnicowanie. Korzystając z tych metod, zidentyfikowano ostatnio populację biopotencjalnego receptora białka C (Procr) eksprymującego VESCs w wielu układach naczyniowych. Procr+ VESCs, powodując powstawanie zarówno nowych EC, jak i perycytów, aktywnie przyczyniają się do angiogenezy podczas rozwoju, homeostazy i naprawy uszkodzeń. Ogólnie rzecz biorąc, manuskrypt ten opisuje nowy przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka i techniki śledzenia linii krwi in vivo, które można wykorzystać do oceny właściwości komórek macierzystych VESCs.

Izolacja VESC z gruczołów mlekowych:
W celu wyizolowania populacji śródbłonka do następczego testu transplantacyjnego, jako materiał dawczy pobrano dojrzałe (8-tygodniowe) gruczoły mleczne dziewiczych myszy. Komórki śródbłonka wyizolowano za pomocą techniki sortowania komórek opartej na przeciwciałach. Reprezentatywne wykresy analizy FACS populacji VESC w komórkach śródbłonka gruczołów mlekowych 8-tygodniowych myszy C57BL/6 przedst...

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena potencjału do proliferacji, różnicowania i generowania naczyń przez naczyniowe macierzyste komórki śródbłonka poprzez technikę przeszczepu do podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego, a następnie przygotowanie całego preparatu tkankowego do obserwacji mikroskopowych. Metoda ta zapewnia nowy sposób optymalnej oceny właściwości macierzystości naczyniowych macierzystych komórek śródbłonka in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że podczas dojrzewania gruczoł piersiowy zapewnia idealne środowisko angiogenne dla generowania i integracji nowo powstałych naczyń.Umożliwia to funkcjonalną ocenę przeszczepionych komórek śródbłonka. Zastosowania tej techniki nie ograniczają się jedynie do badania funkcji śródbłonka. Mogą one obejmować również ocenę wpływu czynników angiogennych na lokalną przebudowę naczyń.Podejścia te stanowią wydajne narzędzia, które można zastosować w wielu dyscyplinach, w tym w badaniach populacji śródbłonka w środowisku nowotworowym oraz zmian w potencjale komórek. Procedurę zaprezentuje Wenqian Song, doktorant z naszego laboratorium. Po przygotowaniu pożywki do trawienia tkanek oraz uśmierceniu ośmiotygodniowych, dojrzałych, nieparujących myszy reporterowych Actin-GFP zgodnie z protokołem tekstowym, należy za pomocą skalpela wypreparować czwartą parę gruczołów mlekowych pachwinowych, wykonując najpierw pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha.Zważ posiekaną tkankę i umieść ją w probówce o pojemności 50 ml. Aby przygotować bufor trawienny, dodaj 300 jednostek kolagenazy typu III na 10 ml medium do trawienia. Wymieszaj dokładnie i dodaj do posiekanej tkanki.Połóż poziomo probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na platformie kołyszącej, ustawiając prędkość na 100 rpm oraz temperaturę na 37 °C. Agituj tkankę gruczołu mlekowego przez dwie godziny. Po trawieniu uzupełnij probówkę wirówkową 50 ml uprzednio ogrzanym sterylnym PBS i odwróć probówkę, aby równomiernie wymieszać zawartość.Następnie wirować probówkę przy 200 ×g przez pięć minut. Odpiwać supernatant i delikatnie uderzyć w dno probówki, aby rozbić osad komórkowy. Następnie dodać trzy mililitry buforu do lizy erytrocytów i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut w celu usunięcia krwinek czerwonych.Dodaj 10 ml sterylnego PBS i odwróć probówkę, aby dokładnie wymieszać zawartość. Następnie, po odwirowaniu tkanki i odlaniu supernatantu, dodaj 3 ml podgrzanej do odpowiedniej temperatury 0,05% trypsyny i inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C przez pięć minut, aby dodatkowo strawić pozostałą tkankę. Następnie dodaj 3 ml podgrzanego IMDM, a potem 100 µl roztworu DNazy I.Inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C, aby rozbić filamenty DNA. Następnie przepuść mieszaninę tkankową przez sito komórkowe o oczkach 70 µm, aby uzyskać zawiesinę komórkową. Użyj 2 mL PBS z dodatkiem 5% FBS, aby dwukrotnie wypłukać sito i zneutralizować trawienie enzymatyczne.Odwiruj mieszaninę komórek z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Odlej nadsącz, a osad komórkowy zawieś ponownie w 1 mL PBS z dodatkiem 5%FBS w celu barwienia przeciwciałami. Po barwieniu przeciwciałami uzupełnij objętość zawiesiny komórkowej roztworem PBS z 5%FBS, a następnie odwiruj próbkę z prędkością 200 ×g przez pięć minut.Następnie, po odlaniu supernatantu, użyj 1 mL PBS z dodatkiem 5% FBS, aby resuspendować komórki. Przefiltruj zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm. Następnie przeprowadź sortowanie metodą FACS, aby wyizolować naczyniowe komórki macierzyste śródbłonka wykazujące ekspresję receptora białka C, zgodnie z protokołem tekstowym.Uzupełnić komórki posortowane metodą FASC 10 mililitrami PBS z dodatkiem 5% FBS, a następnie odwirować próbki przy 200 ×g przez pięć minut, aby komórki osadziły się na dnie probówki. Po ostrożnym odessaniu cieczy, za pomocą hemocytometru policzyć liczbę komórek, a następnie zawiesić pellet komórkowy w mieszaninie matrycy błony podstawnej, aby uzyskać stężenie 15 000 komórek na 15 µL. Wykonać rozcieńczenia seryjne posortowanych i policzonych komórek w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, aby osiągnąć wymagane stężenia wejściowe, upewniając się, że końcowe objętości iniekcji nie przekraczają 15 µL.Następnie do każdej probówki dodaj 0,1% błękitu trypanowego w celu lepszej wizualizacji zawartości podczas transplantacji. Pipetuj dokładnie w celu wymieszania i przechowuj probówki na lodzie do momentu użycia. Aby przeszczepić pierwotne komórki śródbłonka lub EC do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego, ułóż każdą mysz w pozycji grzbietowej na stole operacyjnym.Następnie należy użyć taśmy klejącej, aby unieruchomić kończyny. Zanurz patyczek higieniczny w antyseptycznym roztworze na bazie jodu. Dokładnie przemyj cały obszar brzucha myszy, aby wysterylizować powierzchnię skóry przed operacją.Następnie za pomocą pęsety chwyć i unieś skórę brzucha myszy. Następnie za pomocą skalpela chirurgicznego wykonaj niewielkie, jednocentymetrowe nacięcie pionowe. Wykonaj dwa cięcia o długości około 0,5 do 1 cm każde w kierunku tylnej kończyny, aby uzyskać nacięcie w kształcie odwróconej litery Y.Za pomocą pęsety i patyczka higienicznego ostrożnie oddziel skórę od brzucha i przypnij ją z boku, aby odsłonić gruczoły piersiowe pachwinowe. Następnie umieść mysz pod stereomikroskopem i ustaw powiększenie 2X. Umieść igłę 27G o długości 1/2 cala w lodzie w celu wcześniejszego schłodzenia.Po przygotowaniu strzykawki nabiorem, nanieś 15 µL roztworu macierzy błony podstawnej na zakrętkę probówki do mikrowirówki, a następnie wciągnij całą objętość do przygotowanej strzykawki. Aby zapewnić całkowite wstrzyknięcie zawiesiny komórkowej, upewnij się, że po przygotowaniu strzykawki i pobraniu komórek w igle nie pozostały pęcherzyki powietrza. Za pomocą precyzyjnej pęsety przytrzymaj podskórną tkankę tłuszczową gruczołu mlekowego przed węzłem chłonnym pachwinowym i lekko ją unieś, aby ułatwić iniekcję.Następnie delikatnie wprowadź około 1/4 igły strzykawki do tkanki tłuszczowej. Puść pęsetę z tkanki tłuszczowej, aby uchwycić i ustabilizować igłę strzykawki. Powoli wstrzyknij roztwór, aby zapobiec wyciekowi cieczy.Następnie przytrzymaj igłę w miejscu przez kilka sekund, aby upewnić się, że mieszanina komórkowa zastygła, co zminimalizuje wyciek podczas wyciągania igły. Użyj wchłanialnych szwów jelitowych 5-0 do zamknięcia i zszycia płata skóry, a następnie zamknij rany węzłami chirurgicznymi, rozmieszczając każdy węzeł w odstępach około 0,3 centymetra. Aby pobrać tkankę, oznakuj systemowy krwiobieg biorcy, wykonując wstrzyknięcie barwnika Isolectin 647 w PBS do żyły ogonowej.Pozostawić na 5 do 10 minut w celu odpoczynku. Po uśmierceniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą nożyczek chirurgicznych wyciąć obszar tkanki gruczołowej piersiowej, w który początkowo wstrzyknięto komórki. W szalce Petriego o średnicy sześciu centymetrów, za pomocą skalpela, posiekać tkankę na sześciany o wymiarach około 3 do 4 mm³.Następnie, aby strawić fragmenty tkanki, przenieś je do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml uprzednio ogrzanego medium do trawienia uzupełnionego o kolagenazę III. Umieść probówkę wirówkową 15 ml poziomo na platformie kołyszącej przy 100 rpm i 37 °C przez około jedną godzinę, aby rozluźnić strukturę tkanki i usunąć nadmiar tkanki tłuszczowej. Następnie użyj PBS, aby przemyć tkankę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie, aby zachować fluorescencję, utrwal tkankę w całości, ostrożnie umieszczając fragmenty w sześciocentymetrowej płytce Petri wypełnionej w połowie 4% PFA. Umieść płytkę Petri na platformie kołyszącej i delikatnie mieszaj tkankę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po przemyciu tkanki i inkubowaniu jej z rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym zgodnie z protokołem tekstowym, usuń barwnik i przemyj tkankę trzy razy buforem do mycia, po 10 minut każdorazowo.Następnie inkubuj tkankę z przeciwciałem wtórnym oraz DAPI w temperaturze pokojowej przez cztery godziny na platformie kołyszącej lub przez noc w temperaturze 4°C. Po przemyciu próbki zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś tkankę do 80% glicerolu lub 80% sacharozy na noc, aby ją odwodnić w celu lepszej konserwacji. Zamontuj tkankę i przeprowadź mikroskopię konfokalną zgodnie z protokołem tekstowym.Przedstawiono reprezentatywny wynik izolacji komórek za pomocą FACS. Linie krwi zostały wykluczone poprzez bramkowanie, a komórki CD31 pozytywne i CD105 pozytywne posłużyły do zdefiniowania komórek śródbłonka, po czym przeprowadzono wzbogacenie w komórki macierzyste śródbłonka pozytywne pod kątem receptora białka C. Ten obraz konfokalny przedstawia tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego biorcy w miejscu transplantacji.Naczynia krwionośne utworzone z przeszczepionych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję receptora białka C zintegrowały się i przyczyniły do powstania naczyń w gruczole mlekowym biorcy. Na tej ilustracji przedstawiono unaczynienie gruczołu mlekowego biorcy. Dożylne wstrzyknięcie izolektyny u myszy biorców wykazało, że komórki śródbłonka z receptorem białka C utworzyły funkcjonalne naczynia z widocznym światłem.Po opanowaniu techniki procedura transplantacji może zostać wykonana w czasie krótszym niż pięć minut, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o uważnym monitorowaniu zwierząt biorców po operacji. W przypadku zaobserwowania objawów stresu lub infekcji należy zastosować odpowiednie procedury pielęgnacyjne.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak śledzenie linii komórkowych, aby zbadać zachowanie wybranych komórek podczas różnych procesów biologicznych in vivo. Po opracowaniu ta technika umożliwiła badaczom z dziedziny biologii naczyniowej zbadanie potencjału subpopulacji śródbłonka zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania transplantacji tkanki tłuszczowej z poduszki mlecznej oraz przygotowania preparatów tkanek w całości (whole-mount) w celu zbadania zdolności do tworzenia naczyń przez populacje śródbłonka, a także oceny funkcjonalności utworzonych naczyń.

a-novel-mammary-fat-pad-transplantation-technique-to-visualize-vessel

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Przedstawiamy protokół izolowania fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które reprezentują obiecujące jednostki unaczynienia. Można je szybko wyizolować, nie wymagają przetwarzania in vitro, a tym samym mogą być stosowane do jednoetapowej prewaskularyzacji w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej.

Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

W pracy przedstawiono protokół precyzyjnego dostarczania naczyniowych komórek macierzystych pod kontrolą USG do ściany naczynia aorty. Technika ta skutecznie celuje w ścianę naczynia i wspomaga naprawę naczyń w tętniakach i rozwarstwieniach aorty.

Precyzyjne dostarczanie komórek macierzystych pod kontrolą ultradźwięków w celu naprawy naczyń krwionośnych w chorobach aorty

Poznaj nową metodę przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka do oceny potencjału komórek macierzystych śródbłonka naczyniowego. Technika umożliwia wizualizację tworzenia naczyń krwionośnych in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów