Name: Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę cięcia gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych u myszy. Technika ta zwiększa szansę na wykrycie zmian histopatologicznych niewidocznych w preparatach całych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pam Ovwigho, Tenette Jones i Natashy Clayton, NIEHS, za ich techniczną wiedzę i wsparcie przy tym projekcie.

Wszystkie zastosowania zwierząt i procedury w tym badaniu zostały zatwierdzone przez NIEHS Laboratory Animal
Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania oraz prowadzone w Stowarzyszeniu na rzecz Oceny i Akredytacji
Placówka akredytowana przez Laboratorium Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie całego wierzchowca sutkowego2,3,6,7
<ol>
	<li>Usuń pachwinowe gruczoły sutkowe z jednej strony samicy myszy CD-1, która nie jest w ciąży, zgodnie z opisem w reference3, i umieść je na szkiełku naładowanym elektrostatycznie.</li>
	<li>Przykryj dławik nieprzywierającym papierem lub folią i umieść na nim kolejne szkiełko. Zwiększ nacisk (tj. ciężarki wody) na szkiełko, aby rozłożyć gruczoł płasko, tak aby dławik przykleił się do szkiełka w celu zamocowania.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w utrwalaczu (np. 100% etanolu, chloroformie i lodowatym kwasie octowym w stosunku 6:3:1) na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń gruczoły z utrwalacza i myj w etanolu przez 15-30 min. Po 30-minutowym praniu stopniowo zmieniaj na wodę, wylewając 1/3 etanolu i dodając wody. Pozostaw pranie na około 5 minut za każdym razem i powtórz z dodaniem wody 3 razy.</li>
	<li>Bejca (np. roztwór ałunu karminowego) na 12-24 h. 
	UWAGA: Grubsze tkanki będą wymagały dłuższego czasu barwienia. Zobacz reference3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat barwienia.</li>
	<li>Po upływie wyznaczonego czasu należy zlać plamę i płukać szkiełka w wodzie przez 30 s. Odwodnić chusteczki myjąc szkiełka w 70% etanolu przez 15 min, następnie wykonać 15 minutowe mycie w 95% etanolu i końcowe mycie w 100% etanolu przez 20 min.</li>
	<li>Usuń tłuszcz z tkanek, umieszczając je w ksylenie na co najmniej 24 godziny lub dłużej, jeśli tkanka jest gruba, tak aby usunąć wszelkie nieprzezroczyste lub białe obszary.</li>
	<li>Usuń chusteczkę z ksylenu i szybko dodaj podłoże mocujące do szkiełka, aby uniknąć odwodnienia tkanki; umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na co najmniej 48 godzin.</li>
	<li>Oceń całą zamontowaną tkankę pod kątem nieprawidłowości, zgodnie z opisem w2. 
	UWAGA: W przypadku wykrycia zmian u całych wierzchowców i konieczności przeprowadzenia sekcji w celu ustalenia ich tożsamości, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.</li>
</ol>
2. Usunięcie całego uchwytu sutkowego ze szkiełka
<ol>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe i podłoże montażowe, zanurzając szkiełko sutkowe w całości w szklanym słoiku do barwienia wypełnionym ksylenem na noc. 
	UWAGA: Grubsze chusteczki i szkiełka z nadmiernym roztworem montażowym mogą wymagać dodatkowego czasu na usunięcie szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Po wstępnym namoczeniu przez noc umieść szkiełka w świeżym ksylenie i moczyć przez 6 godzin. Wykonaj ostatnie moczenie w świeżym ksylenie przez noc. 
	UWAGA: Szkiełko nakrywkowe łatwo spadnie ze szkiełka po ostatnim namoczeniu.</li>
	<li>Ręką w rękawiczce przytrzymaj szkiełko i ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że zostało usunięte w jednym kawałku. 
	UWAGA: W przypadku, gdy szkiełko nakrywkowe jest nadal przymocowane do szkiełka, kontynuuj namaczanie, aż będzie można je usunąć przy niewielkim wysiłku.</li>
	<li>Po usunięciu szkiełka nakrywkowego trzymaj szkiełko prostopadle do szklanej szalki Petriego zawierającej ksylen, ostrożnie weź ostrą, jednorazową żyletkę i przesuń ostrze jednym ruchem w dół szkiełka. </li>
	<li>Po usunięciu tkanki szybko zanurz poduszkę sutkową w szklanej szalce Petriego wypełnionej ksylenem, aby upewnić się, że tkanka nie wyschnie na powietrzu. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność na tym etapie. Całe mocowanie jest cienkie (≤ 1 mm) i kruche od obróbki ksylenu. Wszelkie odciski lub rozdarcia mogą zmienić morfologię tkanki i skomplikować późniejsze oceny.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Gdy tkanka znajdzie się na szalce Petriego, ostrożnie przenieś ją do oznakowanej kasety histologicznej. Chwyć krawędź poduszeczki tłuszczowej kleszczami z nosem i ząbkowaną końcówką, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki.
	<ol>
		<li>Za pomocą brzytwy przetnij większe tkanki (szczególnie dla szczurów) na pół i umieść je w dwóch oddzielnych oznaczonych kasetach, które dostosują się do rozmiaru tkanki. Ułóż tkankę prawą stroną do góry (użyj węzła chłonnego jako odniesienia). Upewnij się, że tkanka bez węzła chłonnego jest utrzymywana w tej samej, pionowej pozycji po przeniesieniu do kasety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kasetę w pojemniku z ksylenem na maksymalnie 2 godziny przed umieszczeniem jej w procesorze tkankowym. 
	UWAGA: Zaleca się przetwarzanie próbek w tym samym dniu, w którym zostaną umieszczone w kasecie. Przedłużone moczenie w ksylenie nie zostało przetestowane.</li>
	<li>Ręcznie załaduj maksymalną liczbę kaset do procesora tkanek.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem zaprogramuj wszystkie odczynniki, które będą używane w tym procesie, na liście odczynników procesora. Aby zautomatyzować przemieszczanie się z jednej stacji do drugiej, skorzystaj z opcji menu i utwórz nowy program. Gdy wszystkie kroki zostaną wykonane, wybierz "OK", aby kontynuować. 
	UWAGA: Procesor pozwoli na przejrzenie wszystkich szczegółów stacji przed rozpoczęciem.
	<ol>
		<li>Zautomatyzuj procesor, aby namoczyć kasety w ksylenie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie ponownie zanurzyć je w świeżym ksylenie w tych samych warunkach. Zautomatyzuj procesor, aby wyjął kasety z roztworu ksylenu i przeniósł tkanki do następnej stacji zawierającej mieszaninę ksylenu i stopionej parafiny w stosunku 1:1, ustawioną na 60 °C, na 30 min. 
		UWAGA: Procesor następnie przeniesie kasety do nowej komory, która zawiera stopioną parafinę przez 1 godzinę. Po 1 godzinie próbki zostaną automatycznie przeniesione do nowej komory świeżej stopionej parafiny i będą przetwarzane przez dodatkowe 2 godziny. Oba etapy przeprowadza się w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Następnie procesor przenosi kasety do stacji zawierającej stopioną parafinę na 1 godzinę. Następnie próbki są automatycznie przenoszone do stacji końcowej świeżej stopionej parafiny i przetwarzane przez dodatkowe 2 godziny. Oba etapy przeprowadza się w temperaturze 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Osadzanie przetworzonej tkanki sutka
<ol>
	<li>Umieść kasety w zbiorniku parafiny o temperaturze 58 °C w stacji zatapiania, aż będą gotowe do zatopienia tkanki w formie. </li>
	<li>Zdejmij pokrywę kasety, aby określić najlepszy rozmiar formy dla chusteczki. Upewnij się, że forma jest wystarczająco duża, aby pomieścić tkankę i pozostaw wystarczająco dużo miejsca, aby na obwodzie znajdowała się wolna od tkanek granica parafiny.</li>
	<li>Dodaj 3-4 mm stopionej parafiny do formy i ustaw całą powierzchnię mocowania ssaka, która przylegała do dna szkiełka i dna kasety, skierowaną do góry w formie. </li>
	<li>Przenieś formę na płytę chłodzącą i szybko wyreguluj tkankę w razie potrzeby, tak aby była równoległa do dna formy. 
	UWAGA: Gdy parafina stwardnieje, tkanka zostanie zabezpieczona na miejscu.</li>
	<li>Za pomocą ciepłych kleszczyków umieść oznaczoną, dolną połowę kasety na wierzchu formy; mocno dociśnij za pomocą kleszczyków.</li>
	<li>Dodaj dodatkową stopioną parafinę do formy ciągłym ruchem, aby pokryć całą kasetę. Przenieś formę z ciepłej płyty na zimną płytę, aby całkowicie utwardzić blok.</li>
	<li>Wyjmij blok z formy, gdy parafina całkowicie zastygnie, aby uniknąć pęknięć lub pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Chusteczki zatopione w parafinie należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do cięcia.</li>
</ol>
5. Cięcie tkanki sutka zatopionej w parafinie na mikrotomie
<ol>
	<li>Przed podziałem na sekcje inkubować bloki parafiny w temperaturze -20 °C przez 1 h. 
	UWAGA: W bloku pozostaną resztki podłoża montażowego z oryginalnej przykrytej chusteczki do montażu w całości. Schładzanie bloku poprawia jego sekcjonowanie i wstążkowanie.</li>
	<li>Przygotuj mikrotom, włączając łaźnię wodną zawierającą świeżą wodę destylowaną i ustaw temperaturę na 42-45 °C. Umieść świeże, niskoprofilowe ostrze na mikrotomie i ustaw je na 4 μm. 
	UWAGA: Jakość przekroju jest obniżona w przypadku odcinków grubszych niż 4 μm ze względu na obecność resztkowego podłoża montażowego w tkance.</li>
	<li>Włóż blok do mikrotomu z woskiem skierowanym w stronę ostrza i wyrównanym z płaszczyzną pionową. Następnie zwilż fragment gaziku w zimnej wodzie i umieść go na bloku na kilka minut.</li>
	<li>Przekrój blok, obracając duże koło w ruchu zgodnym z ruchem wskazówek zegara, w połączeniu z grubym zaawansowanym kołem, aż do uzyskania pełnej powierzchni lub reprezentatywnego przekroju bloku. 
	UWAGA: Tkanka jest cienka z powodu usuwania ksylenu podczas całego procesu montowania. Prawidłowo wyrównaj blok z ostrzem, aby zminimalizować liczbę cięć w celu uzyskania reprezentatywnego przekroju. </li>
	<li>Podnieść ręcznie odcinek wstążki, ostrożnie zanurzyć ją w ciepłej (45 °C) łaźni wodnej (przygotowanej wcześniej), pozostawić zmarszczki tkanek do rozproszenia i ostrożnie przesunąć fragment na czyste szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Umieść szkiełka pionowo na suszarce, aby usunąć nadmiar wody. Inkubować szkiełka w lekko otwartym pojemniku na szkiełka przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
6. Automatyczne i ręczne barwienie H&E tkanek sutkowych podzielonych na sekcje
<ol>
	<li>Przed barwieniem szkiełka są przechowywane w temperaturze pokojowej. </li>
	<li>W przypadku barwienia automatycznego wybierz H & E z opcji barwienia w menu głównym. Deparafinizacja, barwienie i odwadnianie są wykonywane w barwieniu automatycznym. Użyj medium montażowego i szkiełka nakrywkowego, aby zamontować sekcje. </li>
	<li>W przypadku ręcznego barwienia szkiełek należy odparafinować skrawki, zanurzając je w ksylenie na 5 minut. Przenieść na świeży ksylen i powtarzać przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie nawodnij szkiełka, zanurzając je dwukrotnie w 100% etanolu na 3 minuty każde, a następnie dwa powtórzenia w świeżym 95% etanolu i dwa oddzielne mycia w buforze do mycia 1X po 5 minut każde.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej. </li>
	<li>Dodaj szkiełka do hematoksyliny na 1-2 min. Wyjmij szkiełka i płucz je pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min. 
	UWAGA: Przefiltruj hematoksylinę przed każdym użyciem. </li>
	<li>Umieść szkiełka w 1% lodowatym kwasie octowym na 30 sekund, aby ułatwić różnicowanie kolorów, a następnie spłucz pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodaj szkiełka do 1X PBS przez 30 s do 1 minuty, aby zniebieścić skrawki tkanki, a następnie spłucz 5 minut w wodzie z kranu, a następnie w 95% alkoholu przez 15 - 20 s.</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne roztworem eozyny przez 30 s do 1 minuty. Następnie dwukrotnie odwodnij szkiełka w świeżym 95% etanolu, a następnie dwa świeże powtórzenia w 100% etanolu. Wykonuj każde pranie przez 5 minut.</li>
	<li>Oczyść szkiełka z ksylenu, z dwiema zmianami ksylenu przez 5 minut każda.</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe pokryć podłożem montażowym i wysuszyć płasko przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>

<ol><li>Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+exposures+and+mammary+gland+development%3A+State+of+the+science%2C+public+health%2C+implications%2C+and+research+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations.</a> Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).</li>
<li>Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+via+Nurture%3A+Effect+of+Diet+on+Health%2C+Obesity%2C+and+Safety+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment.</a> Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).</li>
<li>Stanko, J. P., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/55789/quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using">Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method.</a> J Vis Exp. , In press (2017).</li>
<li>Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf">http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf</a> (2011).</li>
<li>Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf">http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf</a> (2011).</li>
<li>Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm">http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm</a> (2016).</li>
<li>Whole mount preparations. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149">http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149</a> (2016).</li>
<li>Filgo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+evaluation+in+juvenile+toxicity+studies%3A+Temporal+developmental+patterns+in+the+male+and+female+Harlan+Sprague+Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+high-quality+hematoxylin+and+eosin-stained+sections+from+rodent+mammary+gland+whole+mounts+for+histopathologic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+preparation+of+tissue+sections+from+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Path%22%5BJournal%5D)">An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland.</a> Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).</li>
<li>Munoz-de-Toro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+exposure+to+bisphenol-A+alters+peripubertal+mammary+gland+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice.</a> Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).</li>
<li>Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+the+phytoestrogen+genistein+alters+mammary+gland+growth+and+developmental+programming+of+hormone+receptor+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels.</a> Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).</li>
<li>Nikaido, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+maternal+xenotestrogen+exposure+on+development+of+the+reproductive+tract+and+mammary+gland+in+female+CD-1+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring.</a> Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do złożenia w związku z badaniami, autorstwem i/lub publikacją tego artykułu.

Całe mocowanie gruczołu sutkowego jest potężnym narzędziem, które można wykorzystać do zilustrowania normalnego rozwoju sutka i zmian morfologicznych, które mogą powstać i utrzymywać się po narażeniu na chemikalia, w tym substancje zaburzające gospodarkę hormonalną. Kiedy cały wierzchowiec i sekcja H&E tego samego zwierzęcia są oceniane razem, mogą zapewnić dokładny wizualny obraz wczesnych zmian, które mogą przejść w bardziej chory stan.
Możliwość uzyskania tych przydatnych informacji polega ...

Całe wierzchowiec sutkowy jest użyteczną i tanią metodą zaimplementowaną w wielu badaniach na szczurach i myszach, aby zrozumieć zarówno normalny, jak i chemicznie indukowany, nieprawidłowy rozwój. Ogólnie rzecz biorąc, gruczoł sutkowy pobrany na różnych etapach rozwoju gryzoni (tj. okres dojrzewania, dojrzewania, w połowie i pod koniec ciąży oraz w fazie inwolucji) będzie wykazywał zmiany morfologiczne w architekturze tkankowej i komórkowej, na które wpływ miały czynniki parakrynne, endokrynologiczne i autokrynne1. U starzejącego się szczura nabłonkowa i zrębowa część gruczołu staje się coraz gęstsza, co utrudnia pomiar parametrów morfologicznych w całym wierzchowcu. Dlatego powszechną praktyką jest pobieranie gruczołu do oceny histologicznej w celu identyfikacji zmian na poziomie mikroskopowym. Oba procesy są szczególnie przydatne w badaniach związanych z narażeniem chemicznym (tj. środowiskowym lub farmaceutycznym) lub do badania zmian morfologicznych, którym towarzyszą zmiany genetyczne.
Techniki i możliwości wykorzystania gruczołu sutkowego do oceny ryzyka wciąż ewoluują. Podczas gdy przygotowanie całego montażu jest rutynowe i ustandaryzowane, modyfikacje podziału na sekcje trwają2,3. Wiele grup badawczych z różnych środowisk (tj. środowiska akademickiego, rządu i przemysłu) zaadaptowało przekroje koronalne/podłużne tkanki sutkowej jako preferowaną metodę, podczas gdy niektóre laboratoria nadal używają przekrojów poprzecznych przez skórę4. Ta ostatnia metoda skutkuje nadmiernym odwzorowaniem naskórka (skóry), a nie tkanki będącej przedmiotem zainteresowania: nabłonka gruczołu sutkowego2. Przekroje koronalne lub podłużne są bardziej przydatne do charakteryzowania prawidłowych tkanek5 i znacznie poprawiają wykrywanie nieprawidłowości i zmian chorobowych ze względu na zwiększoną powierzchnię i liczbę obecnych struktur. Ogólnie rzecz biorąc, sprawia to, że cały wierzchowiec jest odpowiednią metodą do porównawczej oceny histopatologicznej gruczołu sutkowego1,2. Niezależnie od tego, czy używasz myszy, czy szczura, pobieranie i zachowanie 4. i 5. gruczołu pachwinowego jest wysoce zalecane w porównaniu całego wierzchowca z przeciwległym przekrojem H&E.
Gdy są używane w połączeniu, sekcja H&E i cała góra dostarczają dokładnego opisu zmian komórkowych i morfologicznych wywołanych ekspozycją środowiskową. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku niektórych szczepów gryzoni, w których model ma niską podatność na tworzenie się guza lub guz nie jest rażąco widoczny. W niektórych okolicznościach uzyskanie wymaganej tkanki może nie zawsze być możliwe przy użyciu obu technik (tj. niewystarczająca ilość tkanek, zasoby lub nieoczekiwane wyniki eksperymentalne). W naszym przypadku nieprawidłowości zaobserwowano w całym wierzchu sutka, podczas gdy wyniki histopatologiczne w przeciwległym gruczole H&E były w większości prawidłowe. Przytłaczająca rozbieżność między gruczołami przeciwległymi skłoniła nas do opracowania ekonomicznej i skutecznej procedury identyfikacji nieprawidłowości w całych wierzchowcach. Stosując zmodyfikowaną procedurę obróbki i zatapiania, przygotowano wysokiej jakości sekcje barwione H&E z całych mocowań zatopionych w parafinie. Przewidujemy, że protokół ten stanie się potężnym narzędziem do wykrywania skutków narażenia chemicznego, usprawniając porównania między laboratoriami.

<table><tbody><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>media montażowe do szkiełek nakrywkowych całych mocowań i H& Sekcje E</td></tr><tr><td>Automatyczny procesor Leica Leica</td><td></td><td>Model # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Automatyczny mikrotom</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>naładowane elektrostatycznie</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Automatyczny barwnik do szkiełek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>płynny klej; stosowany w kąpieli wodnej podczas cięcia</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana Harris Hematoxylin 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (część Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Węglan litu</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>potrzebny w utrwalaczu Carnoy's</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>potrzebny w utrwalaczu Carnoy's</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>potrzebny w utrwalaczu i szkiełkach myjących Carnoy's</td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dwunastowodny siarczan glinowo-potasowy, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do automatycznego mycia, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normalny rozwój gruczołu sutkowego może być zmieniony przez ekspozycję na toksyny środowiskowe i produkty farmaceutyczne, nadmierną ekspozycję na hormony i zmiany genetyczne. Mocowania gruczołu sutkowego w całości są niedrogą metodą uchwycenia postępu zmian morfologicznych, które mogą wystąpić po ekspozycji. Jednak w późniejszym życiu, kiedy nieprawidłowości są bardziej podatne na rozwój, poleganie wyłącznie na tej jednej metodzie może nie zawsze dostarczyć wystarczających informacji, aby postawić właściwą diagnozę nieprawidłowości. Historycznie, w badaniach z wytycznymi dotyczącymi badań chemicznych, pojedynczy gruczoł sutkowy jest usuwany podczas sekcji zwłok i przygotowywany jako wycinek barwiony hematoksyliną i eozyną (H&E). Włączenie kontralateralnego zbierania i analizy całego ssatka zmniejsza prawdopodobieństwo fałszywie ujemnej oceny. Ocena całego wierzchowca jest ograniczona przez obecność jednego lub dwóch całych gruczołów sutkowych na szkiełku, a w niektórych przypadkach nieprawidłowości zaobserwowane w całym wierzchowcu nie są jednolicie reprezentowane w sekcji BHP. Celem tego badania było opracowanie protokołu przekształcania zakrywanych całych mocowań sutka w skrawki barwione H&E, tak aby zmiany, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte lub które są trudne do zdiagnozowania można zidentyfikować. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę wytwarzania wysokiej jakości, zatopionego w parafinie przekroju H&E z gruczołu mlecznego, który początkowo został przygotowany jako całe mocowanie. W porównaniu z tkanką, która została celowo przygotowana do cięcia H&E, cały montaż wymaga dodatkowego przygotowania do usunięcia i przetworzenia tkanki. Jednak ta metoda jest uważana za niedrogą, ponieważ wymaga zwykłych odczynników laboratoryjnych i niewielkiego dodatkowego czasu. W rezultacie metoda ta może dostarczyć bezcennych informacji na temat tego, jak narażenie chemiczne i środowiskowe zmienia normalny rozwój sutka, a także wyświetla zmiany, które zachodzą z powodu modyfikacji genetycznych.

Metoda ta jest skuteczna w pomaganiu w stawianiu rozpoznań, które mogłyby zostać pominięte, gdyby pierwotny przekrój przeciwległej poduszki mlecznej barwiony H&amp;E nie wykazał żadnych zmian histologicznych. Wynik będzie jednak przydatny tylko wtedy, gdy zachowana zostanie staranność podczas początkowego przygotowania całego preparatu, a także podczas przygotowania tkanki do oceny histologicznej. Zanurzenie w parafinie zapewni ochronę i pomoże w konserwacji tkanki do przyszłego krojenia....

Opracowaliśmy metodę skutecznego usuwania, przetwarzania, cięcia i barwienia, w celu oceny histopatologicznej, tkanki sutka, która pierwotnie była utrwalona na szkiełkach jako całe wierzchowce. Metoda ta może sprzyjać gromadzeniu i ocenie całych wierzchowców gruczołu mlekowego w badaniach wytycznych dotyczących badań reprodukcyjnych i rozwojowych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie wysokiej jakości barwionych przekrojów z całych zamontowanych tkanek gruczołów mlekowych myszy w celu identyfikacji zmian na poziomie mikroskopowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oceny gruczołów mlekowych, takie jak histopatologiczna identyfikacja typów zmian rozpoznanych makroskopowo w całych preparatach gruczołów mlekowych. Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie szansy na zidentyfikowanie zmian, które mogą występować w gruczołach mlekowych przy zastosowaniu całych zamontowanych tkanek.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas porównywania fenotypów w preparatach całych organów z raportami histopatologicznymi dla przeciwległych gruczołów z tych samych zwierząt, utrwalonych w formalinie i barwionych H&amp;E. Zauważyliśmy rozbieżność w diagnozach – w preparatach całych organów widocznych było więcej zmian. Wizualna prezentacja tej metody jest istotna, ponieważ etapy usuwania i zatapiania całego organu mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury.Gruczoł jest delikatny ze względu na swoją cienką, łatwo ulegającą uszkodzeniu strukturę. Po przygotowaniu próbek pamięci do badań całego preparatu i analizie tkanki pod kątem nieprawidłowości zgodnie z protokołem tekstowym, należy usunąć szkiełka nakrywki oraz medium montażowe, zanurzając preparaty w szklanym naczyniu do barwienia wypełnionym ksylenem. Inkubować przez noc lub dłużej.Przenieś preparaty do świeżego ksylenu i mocz próbki przez sześć godzin. Następnie ponownie przenieś próbki do świeżego ksylenu i mocz przez noc. Następnie, trzymając preparat w rękawiczce, użyj pęsety, aby ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywką w jednym kawałku.Łatwość usunięcia szkiełka cover-slip może być różna w zależności od grubości medium montażowego oraz czasu, jaki upłynął od przykrycia preparatu. Dlatego niezbędne jest, aby preparat pozostawał w ksylenie do momentu, gdy szkiełko cover-slip będzie można łatwo odczepić. Po usunięciu szkiełka cover-slip należy użyć ostrego, jednorazowego ostrza żyletki, aby pobrać próbkę, przesuwając ostrze jednym ruchem wzdłuż szkiełka przedmiotowego.Następnie szybko zanurz poduszkę tłuszczową w szklanej płytce Petriego wypełnionej ksylenem, aby zapobiec wysychaniu tkanki na powietrzu. Za pomocą żyletki przetnij większe fragmenty tkanek na pół. Następnie, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, użyj pęsety z tępym końcem i ząbkowaną końcówką, aby uchwycić krawędź poduszki tłuszczowej i umieścić obie połowy stroną górną do góry w dwóch oddzielnych, opisanych kasetkach dostosowanych do rozmiaru tkanki.Umieść kasetkę w pojemniku z ksylenem na maksymalnie dwie godziny przed umieszczeniem jej w procesorze tkanek. Następnie ręcznie załaduj do procesora tkanek maksymalną liczbę kasetek. Przed rozpoczęciem zaprogramuj procesor do przetwarzania tkanek.Aby zautomatyzować procedurę, należy wybrać stację, temperaturę oraz ustawić włączanie i wyłączanie próżni. Zaprogramuj procesor tak, aby kasety moczyły się w ksylenie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przeprowadź drugie moczenie w świeżym ksylenie w tych samych warunkach. Następnie zaprogramuj procesor tak, aby wyjął kasety z roztworu ksylenu i przeniósł tkanki do komory w procesorze zawierającej mieszaninę ksylenu i stopionej parafiny w stosunku 1:1, ustawioną na 60 °C przez 30 minut.Po zakończeniu wszystkich kroków wybierz przycisk „ok” lub „start”, aby kontynuować. Umieść kasety w zbiorniku kąpieli parafinowej o temperaturze 58 °C aż do momentu ich umieszczenia w formie. Zdejmij pokrywy kaset, aby dobrać odpowiednią wielkość formy dla tkanek.Dolej trzy do czterech milimetrów płynnej parafiny z wylewki do formy, a następnie ustaw tkankę w płynnej parafinie tak, aby powierzchnia całego preparatu piersi, która przylegała do dołu szkiełka przedmiotowego i dna kasety, była skierowana ku górze w formie. Przenieś formę na płytę chłodzącą i szybko skoryguj ułożenie tkanki w razie potrzeby, aby była ona równoległa do dna formy. Za pomocą pęsety mocno umieść opisaną kasetę na górze formy.Dolewaj stopioną parafinę do formy jednostajnym ruchem, aż całkowicie pokryje kasetkę. Przenieś formę z płyty grzewczej na płytę chłodzącą, aby utrwalić blok w dokładnie wybranej pozycji do cięcia. Gdy blok parafinowy całkowicie stężeje, oddziel go od formy.Następnie przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu przystąpienia do cięcia. Przed sekcjonowaniem inkubować bloki parafinowe w temperaturze -20 °C przez jedną godzinę. Następnie przygotować mikroton, włączając kąpiel wodną z jednoczesnym napełnieniem jej świeżą wodą destylowaną i ustawiając temperaturę w zakresie od 42 do 45 °C.Następnie należy umieścić na mikrotomie nową ostrze niskoprofilowe i ustawić grubość cięcia na 4 µm. Włożyć blok do mikrotomu tak, aby wosk był skierowany w stronę ostrza i wyrównany z płaszczyzną pionową. Następnie zwilżyć fragment gazy w zimnej wodzie i położyć go na bloku na kilka minut.Wyciąć plastry z bloku, obracając duże koło w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara przy jednoczesnym użyciu pokrętła przesuwu grubego, aż do uzyskania pełnego przekroju lub reprezentatywnego fragmentu bloku. Następnie przenieść ręcznie wycięty fragment tkanki do kąpieli w ciepłej wodzie, a następnie zebrać go za pomocą czystego szkiełka przedmiotowego. Umieścić szkiełka na statywie do suszenia w celu usunięcia nadmiaru wody.Następnie przechowywać przekroje tkankowe w temperaturze 37 °C przez noc. Po wyjęciu szkiełek z inkubatora o temperaturze 37 °C, przechowywać je w temperaturze pokojowej do momentu rozpoczęcia barwienia. W przypadku barwienia automatycznego, z opcji barwienia w menu głównym wybrać H and E, aby zabarwić szkiełka.Deparafinizacja, barwienie i odwodnienie są przeprowadzane w automatycznym aparacie do barwienia. Do montowania preparatów należy użyć medium montażowego oraz szkiełka nakrywkowego. Aby określić optymalną grubość tkanki gruczołu piersiowego, przygotowano skrawki o grubości 4 µm oraz 6 µm.Przekroje o grubości 4 µm dały optymalne wyniki, w których obszary nabłonkowe i zrębowe oraz odpowiadające im typy komórek były łatwo rozróżnialne. Rysunki te przedstawiają przekroje histologiczne prawidłowych gruczołów. W obu gruczołach widoczne są struktury przewodowe otoczone przez liczną i jednorodną populację adipocytów.Każdy przewód wyścielony jest pojedynczą warstwą prostych cylindrycznych komórek nabłonkowych i podtrzymywany przez drugą warstwę komórek podstawnych. Przeciwległe preparaty całych organów zawierały obszar o zwiększonej nieprzezroczystości obejmujący przewody gruczołów pamięci. Nie było jednak jasne, czy nieprzezroczystość wynikała ze zmian hiperplastycznych, zapalnych czy nowotworowych.Tutaj przedstawiono preparaty całych organów po przeciwnej stronie. Przekroje te zdiagnozowano jako zapalenie okołonaczyniowe ze względu na zwiększoną liczbę limfocytów wokół dużego naczynia krwionośnego w przekroju gruczołów mlekowych. W tych próbkach architektura pęcherzykowa gruczołu mlekowego została zachowana, lecz uległa powiększeniu wskutek zwiększenia liczby i wielkości prawidłowych pęcherzyków i przewodów w przebiegu hiperplazji pęcherzykowo-zrazikowej.Powiększone lobule zawierały zwiększoną liczbę pęcherzyków i przewodów wyścielonych dobrze zróżnicowanymi, często wakuolizowanymi komórkami nabłonkowymi, które tworzyły światła wypełnione płynem białkowym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że tkanka pod wpływem ksylenu staje się krucha i może łatwo pęknąć, co doprowadzi do zniszczenia próbki. Przed zastosowaniem tej metody zaleca się wykonanie wysokiej jakości zdjęć preparatów całych przy użyciu skanera płaskiego.Jest to okazja dla dziedziny patologii toksykologicznej do przejścia w kierunku oceny całych preparatów w badaniach przesiewowych substancji chemicznych. Dzięki temu, po zidentyfikowaniu zmian na tym poziomie, możliwe jest obecnie wykonanie wysokiej jakości skrawków do diagnozy histopatologicznej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak usuwać, zatapiać i kroić całe preparaty gruczołów mlekowych w celu identyfikacji zmian.Należy pamiętać, że podczas pracy z ksylenem należy stosować środki ostrożności, takie jak fartuchy laboratoryjne i rękawiczki, a prace powinny być prowadzone pod wyciągiem.

sectioning-mammary-gland-whole-mounts-for-lesion-identification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Nasz protokół opisuje sposób wycinania brzusznego gruczołu mlekowego szczura oraz przygotowywania preparatów całych gruczołów mlekowych. Opisuje on również analizę morfologii gruczołu mlekowego z wykorzystaniem trzech punktów końcowych (liczba pąków końcowych, elongacja nabłonka i różnicowanie) oraz wykorzystanie tych wyników do przewidywania ryzyka raka piersi u szczurów poddanych modyfikacjom diety in utero lub w okresie przedpokwitaniowym.

Zmiany w morfologii gruczołów mlekowych a ryzyko raka piersi u szczurów

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Prezentujemy podejście do rejestracji obrazów do trójwymiarowej (3D) histologicznej rekonstrukcji objętości, które ułatwia badanie zmian zachodzących w narządzie na poziomie makrostruktur składających się z komórek. Korzystając z tego podejścia, zbadaliśmy zmiany 3D między gruczołami sutkowymi typu dzikiego i Igfbp7-null.

Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Rozwój gruczołu sutkowego u gryzonia był zazwyczaj oceniany za pomocą ocen opisowych lub poprzez pomiar podstawowych cech fizycznych. Gęstość rozgałęzień jest wskaźnikiem rozwoju sutka, który jest trudny do obiektywnego oszacowania. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę ilościowej oceny charakterystyki rozgałęzień gruczołu mlekowego.

Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Poznaj metodę cięcia gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych u myszy. Technika ta zwiększa szansę na wykrycie zmian histopatologicznych niewidocznych w preparatach całych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Przeglądaj więcej filmów