Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja miejsc integracji wektorów retrowirusowych w genomie gospodarza i ilościowe określenie względnych częstości populacji komórek klonalnych, z których każda ma to samo miejsce integracji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w retrowirusowej terapii genowej, takie jak to, która część wektora genomu gospodarza uległa integracji, w jaki sposób genetycznie zmodyfikowana komórka ponownie zasiedleje się po przeszczepie i jak różnią się funkcjonalnie. Główną zaletą tej techniki jest to, że sekwencje miejsc retrointegracji mogą być analizowane z większą dokładnością i czułością poprzez sekwencjonowanie jednocześnie połączeń DNA gospodarza zarówno przed, jak i za wektorem.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat bezpieczeństwa wektorów i komórek modyfikowanych genowo w badaniach nad terapią genową, może być również stosowana w innych podstawowych badaniach biologicznych w celu zbadania zachowania poszczególnych komórek in vivo. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest określenie stężenia DNA i stosunku absorbancji przy 260 i 280 nanometrach genomowego DNA, które ma być analizowane. Następnie rozcieńczyć od jednego do dwóch mikrogramów próbki genomowego DNA do końcowej objętości 170 mikrolitrów roztworu genomowego DNA przy użyciu wody wolnej od nukleaz.

Przygotuj 200 mikrolitrową reakcję PCR, mieszając następujące składniki w probówce mikrowirówkowej. 2,5 mikrolitra każdy ze starterów biotyny specyficznych dla HIV-1 lub łącznie 10 mikrolitrów dla czterech starterów specyficznych dla lentiwirusa, 20 mikrolitrów 10X termostabilnego buforu polimerazy DNA, cztery mikrolitry 10-milimolowych dNTP, trzy mikrolitry termostabilnej polimerazy DNA i 163 mikrolitry genomowego DNA. Podzielić roztwór równo na cztery probówki do PCR i przeprowadzić pojedynczy cykl przedłużania w następujących warunkach.

94 stopnie Celsjusza przez 5 minut, 56 stopni Celsjusza przez 3 minuty, 72 stopnie Celsjusza przez 5 minut i 4 stopnie C do przechowywania. Połącz wszystkie cztery reakcje PCR w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej. Postępuj zgodnie z procedurą producenta zestawu do oczyszczania PCR i eluuj za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego.

Przygotuj się do mineralizacji 100 mikrolitrów, dodając następujące składniki do probówki mikrowirówkowej. 50 mikrolitrów DNA, 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu A, dwa mikrolitry enzymu RSAI i 38 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze przez godzinę.

Następnie dodaj jeden mikrolitr enzymu CviQI do reakcji i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po zakończeniu trawienia RSAI i CviQI należy natychmiast przystąpić do zakończenia. Przygotuj mieszaninę o pojemności 4,5 mikrolitra zawierającą 2,5 mikrolitra polimerazy DNA I, dużego fragmentu i 2 mikrolitry 10 milimolowych dNTP.

Przenieś 1 mikrolitr mieszaniny do próbki DNA. Całkowita objętość wyniesie 102 mikrolitry. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po zakończeniu inkubacji natychmiast przystąp do wiązania kulek streptawidyny. Przygotuj kulki streptawidyny, krótko mieszając roztwór kulek i przenosząc 50 mikrolitrów do nowej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki. Usuń supernatant za pomocą podstawki magnetycznej i umyj ziarna 200 mikrolitrami roztworu wiążącego.

Zawieś koraliki w 100 mikrolitrach roztworu wiążącego i umieść rurkę z dala od stojaka magnetycznego. Przenieść 100 mikrolitrów próbki DNA do 100 mikrolitrów zawieszonego roztworu kulek i dokładnie wymieszać pipetując, aby uniknąć pienienia się roztworu. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 godziny na obracającym się kole.

Użyj podstawki magnetycznej, aby uchwycić koraliki i wyrzucić supernatant. Umyj kulki dwukrotnie w 400 mikrolitrach roztworu myjącego i dwukrotnie w 400 mikrolitrach buforu ligazy DNA 1X T4. Ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu ligazy DNA 1X T4 i umieść je z dala od stojaka magnetycznego.

Podwiązanie łącznika należy wykonać natychmiast po związaniu kulki streptawidyny. Przygotuj 400-litrowy roztwór reakcyjny ligacji, mieszając następujące składniki w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki. 0,5 mikrolitra łącznika DNA, 10 mikrolitrów bufora ligazy DNA 10X T4, 20 mikrolitrów buforu ligazy DNA 5X T4, 5 mikrolitrów ligazy DNA T4, 164,5 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i 200 mikrolitrów zawieszonych kulek.

Umieść probówkę reakcyjną na obracającym się kole w temperaturze pokojowej na 3 godziny. Umyj kulki dwukrotnie roztworem myjącym i dwukrotnie termostabilnym buforem polimerazy DNA 1X. Ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach 1X termostabilnego bufora PCR polimerazy DNA i umieść go z dala od stojaka magnetycznego.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 200 mikrolitrową reakcję PCR, dodając następujące składniki do zawieszonych kulek. 10 mikrolitrów jednego startera 1L, 10 mikrolitrów startera 1R, 20 mikrolitrów startera Link1, 10 mikrolitrów termostabilnego buforu polimerazy DNA 10X, cztery mikrolitry 10 milimolowych dNTP, osiem mikrolitrów termostabilnej polimerazy DNA i 88 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej rozdzielić na cztery probówki PCR i przeprowadzić PCR w następujących warunkach.

94 stopnie Celsjusza przez 2 minuty, 25 cykli po 94 stopnie Celsjusza przez 20 sekund, 56 stopni Celsjusza przez 25 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez dwie minuty, a końcowe przedłużenie w 72 stopniach Celsjusza przez 5 minut. Zebrać wszystkie cztery reakcje PCR w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Postępuj zgodnie z procedurą zestawu do oczyszczania PCR i eluuj za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego.

Określić stężenie DNA i stosunek absorbancji przy 260 i 280 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV widzialnego. DNA może być teraz przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dopóki nie będzie gotowe do następnego kroku. Ponieważ procedury dla amplifikacji specyficznych dla lewego i prawego złącza są identyczne, z wyjątkiem starterów stosowanych w PCR, zademonstrowane zostanie tylko wzmocnienie lewego złącza.

Przygotuj 50-mikrolitrową reakcję PCR, mieszając następujące składniki w probówce do PCR. Pięć mikrolitrów DNA, pięć mikrolitrów 10-mikromolowego startera 2L, pięć mikrolitrów 10-mikromolowego startera Link2, 5 mikrolitrów 10-krotnego termostabilnego buforu polimerazy DNA, jeden mikrolitr 10-milimolowych dNTP, dwa mikrolitry termostabilnej polimerazy DNA i 27 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Przeprowadź PCR z następującymi warunkami.

94 stopnie Celsjusza przez 3 minuty, 8 do 15 cykli po 94 stopnie Celsjusza przez 20 sekund, 56 stopni Celsjusza przez 25 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez dwie minuty, a końcowe przedłużenie w 72 stopniach Celsjusza przez 5 minut. Użyj zestawu do oczyszczania PCR, aby oczyścić DNA i wymyć 50 mikrolitrami buforu elucyjnego. Określ stężenie DNA i stosunek absorbancji przy 260 i 280 nanometrach.

Ostatnim krokiem w generowaniu bibliotek sekwencji lewych i prawych złączy jest analiza zmian długości amplikonu PCR poprzez wykonanie elektroforezy kapilarnej. Ten reprezentatywny wynik pokazuje różne długości amplikonów PCR w miejscach integracji wektorów lentiwirusowych zarówno dla węzłów wektorowych przed jak i za nim. Znacznik wielkości DNA znajduje się na pasie M.

Po sekwencjonowaniu amplikonów PCR, analiza sekwencji miejsca integracji obliczeniowej jest wykonywana przy użyciu wewnętrznego skryptu programistycznego. Test dwukierunkowej integracji miejsca generuje różne rozmiary amplikonów PCR zarówno dla wstępnych, jak i dalszych połączeń wektorowych gospodarzy, wizualizowanych za pomocą elektroforezy kapilarnej. Porównanie procentowej integracji w powtórzeniach genów Alu i L1 wektorów lentiwirusowych w humanizowanych komórkach rezasiedlających myszy w losowych zdarzeniach integracji generowanych przez silico wykazało, że miejsca integracji są znacznie wzbogacone w geny.

Względne częstotliwości detekcji integromów wektorowych obliczono przy użyciu tylko liczby sekwencji połączeń w miejscu integracji generujących amplikony PCR mniejsze niż 500 pz. Około 77% wektorów można było przeanalizować ilościowo za pomocą podejścia dwukierunkowego. W strategii kwantyfikacji klonalnej zakładamy, że każdy pojedynczy klon ma ten sam integrom wektorowy.

Względne częstości lewego i prawego skrzyżowania są łączone w celu przedstawienia względnych wielkości populacji klonów lub QVI. Ten schemat kolorów pokazuje względne częstości występowania 44 klonów QVI w humanizowanych komórkach zasiedlających myszy. Na podstawie analizy całkowania losowego in silico 10 000 oczekuje się 1,25-krotnego przeszacowania częstości klonów w przypadku stosowania enzymów motywu GTAC i 2,56-krotnego przeszacowania w przypadku stosowania enzymu motywu TCGA.

Po opanowaniu tej techniki można podzielić na części i ukończyć w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, że etapy PCR są niezwykle wrażliwe i należy podjąć środki ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia. Technika ta utorowała drogę do zbadania bezpieczeństwa terapeutycznych wektorów retrowirusowych oraz do zbadania długoterminowych wzorców ponownego zasiedlania klonów hemopoetycznych komórek macierzystych po przeszczepie makakom rezusom.