Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Ogólnym celem tych protokołów izolacji i różnicowania jest uzyskanie komórek progenitorowych adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i wywołanie ich różnicowania w dojrzałe adipocyty. Metoda ta pozwala na analizę specyficznych i zdefiniowanych populacji komórek progenitorowych adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej, przy minimalnym wpływie na ich morfologię, żywotność oraz potencjał do proliferacji i różnicowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zwiększoną izolację komórek prezentujących antygen na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją.

Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej wzdłuż mostka do okolicy krocza szczura, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Odsłoń tętnicę krezkową górną, małe naczynia oporowe krezki i aortę piersiową oraz przeciąć wszystkie połączenia z krezką i aortą. Zebrać tkankę tłuszczową gonad i przenieść izolowane poduszeczki tłuszczowe do nowego pojemnika z buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera lub roztworem KRBB, uzupełnionym 10 milimolowymi hałdami.

Przenieść naczynia na szalkę Petriego zawierającą roztwór KRBB i umieścić naczynie pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową z małych naczyń oporowych krezki i aorty. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przenieś około 50 miligramów tkanki do 1,7 mililitrowej probówki zawierającej 1 mililitr roztworu kolagenazy typu I i zmiel tkankę na 1 do 3 milimetrowych kawałków.

Ważne jest, aby odpowiednio rozdrobnić tkankę tłuszczową, aby kolagenaza mogła dokładnie naciekać tkankę łączną. Inkubować fragmenty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 1 godzinę. Następnie sekwencyjnie przefiltruj strawiony materiał przez pojedyncze sitka komórkowe o średnicy 100 i 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki.

Zebrać powstały filtrat przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu do lizy erytrocytów. Przenieś zawiesinę komórkową do nowej 1,7-mililitrowej probówki Microfuge na 5-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie zebrać komórki frakcji zrębu naczyniowego za pomocą kolejnego odwirowania i ponownie zawiesić osad w podłożu podstawowym frakcji zrębu naczyniowego w celu zliczenia.

Aby wyizolować komórki progenitorowe adipocytów przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie, zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w buforze blokującym sortowanie komórek aktywowanym magnetycznie w stężeniu 1 razy 10 do 6 komórek na mililitr przez 20-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Istotne jest, aby wszystkie etapy izolacji odbywały się w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a nie nad lodem. Następnie inkubuj komórki z 5 mikrolitrami mysiego anty-CD34 sprzężonego z FITC przez 30 minut.

Zebrać komórki przez odwirowanie. Następnie inkubuj komórki z 4 mikrolitrami mikrokulek anty-FITC w 96 mikrolitrach bufora do sortowania komórek aktywowanego magnetycznie przez 5 minut w ciemności. Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę wielosortową w separatorze magnetycznym z 5-mililitrową rurką odpływową pod kolumną.

Przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami aktywowanego magnetycznie buforu do sortowania komórek i wyrzucić rurkę ściekową i odpływową. Następnie umieść nową probówkę pod kolumną i załaduj komórki na górę kolumny, zbierając nieznakowane ujemne komórki CD34 w nowej probówce zbiorczej. Gdy wszystkie komórki przejdą przez górną część kolumny, przemyj kolumnę 3 razy 500 mikrolitrami odgazowanego, aktywowanego magnetycznie buforu do sortowania komórek, kontynuując gromadzenie eluatu w probówce zbiorczej.

Po ostatnim płukaniu przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i użyj tłoka kolumny, aby przepłukać 1 mililitr aktywowanego magnetycznie buforu do sortowania komórek przez kolumnę do probówki, aby zebrać komórki dodatnie CD34. Zebrać komórki progenitorowe adipocytów przez odwirowanie. Następnie inkubować frakcję dodatnią CD34 w 10 mikrolitrach receptora alfa króliczego czynnika wzrostu pochodzenia przeciwpłytkowego przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji ponownie odwirować komórki i inkubować osad w 4 mikrolitrach anty-króliczych mikrokulek IgG w 96 mikrolitrach aktywowanego magnetycznie buforu do sortowania komórek w celu izolacji kulek magnetycznych komórek alfa-dodatnich receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego, jak właśnie pokazano. Aby wyhodować komórki progenitorowe receptora alfa dodatnich adipocytów receptora CD34 płytkowego czynnika wzrostu, należy zasiać komórki na indywidualnych 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej w podłożu podstawowym i umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 3 sekwencyjnych pasażach zasiej komórki na czarnych 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w ilości 1 razy 10 do 2 komórek na dołek i oceń ich proliferację po 8, 24, 48 i 96 godzinach po 5 razy 10 do 4 komórek na dołek, na 24-dołkowych płytkach testowych, zgodnie ze standardowymi protokołami testów proliferacji.

Aby wywołać adipogenezę, gdy hodowla komórek progenitorowych adipocytów osiągnie zbieg, należy karmić komórki pożywką podstawową adipocytów progenitorowych przez 48 godzin, a następnie traktować kultury białkiem morfogennym kości 4 przez kolejne 48 godzin. Trzeciego dnia należy zastąpić pożywkę pożywką do indukcji komórek progenitorowych adipocytów, bez IBMX i badania etetazonu przez 14 dni. Stopień adipogenezy w kulturach można następnie ocenić na 1 razy 10 do 4 komórek na dołek na 48-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych, zgodnie ze standardowymi protokołami testów adipogenezy.

Chociaż obie metody wykazują podobny rozkład populacji komórek i żywotność, izolacja sortowania komórek aktywowana magnetycznie wytwarza większą liczbę komórek do hodowli w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją. W tym reprezentatywnym eksperymencie proliferację in vitro frakcji zrębu naczyniowego posortowanej komórkami aktywowanymi magnetycznie i komórek progenitorowych adipocytów, wyizolowanych z aorty piersiowej, małych naczyń oporowych krezki i tkanki tłuszczowej gonad samców szczurów, oceniano po 8, 24, 48 i 96 godzinach po posiewie, przy użyciu ilościowego testu DNA. W żadnym punkcie czasowym nie zaobserwowano różnic w tempie rozszerzania się frakcji naczyniowej zrębu, z wyjątkiem komórek progenitorowych adipocytów z aorty piersiowej, które wykazywały mniejszą proliferację o 96 godzin w porównaniu z komórkami naczyniowymi zrębu z tego samego miejsca.

Stymulacja zbiegających się komórek progenitorowych adipocytów z białkiem morfogennym kości 4 przez 48 godzin indukuje różnicowanie adipocytów, o czym świadczy większa akumulacja lipidów w kropelkach, co oceniano zarówno za pomocą fluorescencyjnego testu wychwytu lipidów, jak i barwienia czerwienią olejową O. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 8 godzin, jeśli zostanie wykonana poprawnie. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu temperatury 4 stopni Celsjusza podczas etapów izolacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i różnicować komórki progenitorowe adipocytów.