Name: Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych. Technika ta zwiększa wydajność izolacji przy minimalnym wpływie na żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratoria Contreras i Watts oraz dr William Raphael. Eksperymenty te były wspierane przez NHLBI F31 HL128035-01 (standaryzacja protokołu trawienia tkanek), NHLBI 5R01HL117847-02 i 2P01HL070687-11A1 (zwierzęta) oraz NHLBI 5R01HL117847-02 (izolacja i hodowla komórek).

Wszystkie procedury opisane w tym artykule są zgodne z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan. Wszystkie i media należy chronić przed światłem.
1. Przygotowanie, mediów i instrumentów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór buforowany wodorowęglanem Krebsa Ringera (KRBB): 135 mM chlorku sodu, 5 mM chlorku potasu, 1 mM siarczanu magnezu, 0,4 mM dwuzasadowego fosforanu potasu, 5,5 mM glukozy, 1% antybiotyku/antybiotyku (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny, 25 μg/ml amfoterycyny B) i 10 mM HEPES (pH = 7,4). Roztwór ten jest stabilny przez 3 tygodnie, jeśli jest przechowywany w sterylnej temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór kolagenazy typu 1: 1 mg/ml w KRBB z 4% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Roztwór ten należy przechowywać w temperaturze 37 °C i jest stabilny przez 4 godziny.</li>
	<li>Przygotuj roztwór buforowy do lizy erytrocytów: 154 mM chlorku amonu, 10 mM wodorowęglanu potasu i 0,1 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotuj bufor blokujący MCS: baza pożywki DMEM / F12, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 5% normalna surowica osła, 40 μl / ml F (ab) Fragment osła IgG przeciw szczurom. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforowy MCS: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA i 2 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. Roztwór odgazowujący poprzez podgrzanie do temperatury 37 °C w szklanym pojemniku, a następnie zastosowanie próżni przez 15 s. Pozostawić niewykorzystany bufor szczelnie zamknięty.</li>
	<li>Przygotuj podłoże podstawowe frakcji naczyniowej zrębu (SVF): Pożywka Eagles-Modified Dulbecco (DMEM): F12, 15% płodowa surowica cielęca (FCS), 1% antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny, 25 μg/ml amfoterycyny B), 44,05 mM wodorowęglan sodu, 100 μM kwas askorbinowy, 33 μM biotyna, 17 μM pantotenian, 2 mM L-glutamina, i 20 mM HEPES. Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę APC: Pożywkę podstawową z dodatkowymi czynnikami wzrostu, w tym naskórkowym czynnikiem wzrostu 10 ng / ml), czynnikiem hamującym białaczkę (10 ng / ml), płytkowym czynnikiem wzrostu BB (10 ng / ml) i podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (5 ng / ml). Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę indukcyjną APC: pożywkę APC z 10% FBS, 2,5 μg/ml insuliny, 0,5 mM 2-izobutylo-1-metylolaksantyny (IBMX), 1 μM deksametazonu i 200 pM T3 (trójjodotyroninowy hormon tarczycy). Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
</ol>
2. Izolacja prekursorów adipocytów
<ol>
	<li>Znieczulić szczura zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Umieść szczura w pozycji leżącej grzbietowej. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi i utratę odruchowej reakcji na ten bolesny bodziec. 
	UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się 10-tygodniowe szczury Sprague Dawley i 70 mg/kg pentobarbitalu podawanego we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie linii środkowej nożyczkami wzdłuż mostka w okolicy klatki piersiowej i w okolicy krocza. Uzyskaj dostęp do jamy brzusznej i odsłoń tętnicę krezkową górną, małe naczynia oporowe krezki (mPVAT) i aortę piersiową (aPVAT).
	<ol>
		<li>Odetnij wszystkie połączenia z krezką i aortą i usuń naczynia ze zwierzęcia. Wyizolować PVAT za pomocą mikroskopu preparacyjnego i szalki Petriego wypełnionej KRBB do oglądania naczyń i izolowania PVAT.</li>
		<li>W tym eksperymencie zbierz gonadalną (GON) tkankę tłuszczową, aby reprezentować magazyn tłuszczu niebędący PVAT. Umieść izolowane poduszeczki tłuszczowe na lodzie w KRBB z 10 mM HEPES (pH = 7,4).</li>
		<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przenieś około 50 mg tkanki do probówki o pojemności 1,7 ml z 1 ml roztworu kolagenazy typu I i zmiel nożyczkami do tkanek (kawałki 1 - 3 mm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki trawić przez inkubację w temperaturze 37 °C w inkubatorze z rożnem (lub inkubatorze z wytrząsarką orbitalną) przez 1 godzinę. W okapie bezpieczeństwa biologicznego sekwencyjnie filtruj strawiony materiał przez sitka komórkowe o pojemności 100 i 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować powstały filtrat w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 300 × g. 
	UWAGA: Wszystkie kroki w protokole od tego momentu należy wykonywać w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność komórek.</li>
	<li>Odlać supernatant i ponownie zawiesić granulki zawierające komórki SVF w 1 ml 1X roztworu buforowego do lizy erytrocytów i przenieść do probówki do mikrofuzy o pojemności 1,7 ml. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem i wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odlewać supernatant i ponownie zawiesić pozostały osad komórkowy w pożywce SVF Basal Media. Pobrać podpróbkę o objętości 20 μl, aby policzyć żywe komórki za pomocą roztworu błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Liczba komórek SVF, które można wyizolować, będzie się różnić w zależności od miejsca. Średnia liczba pobranych SVF na mg tkanki wynosi: aPVAT = 5,0 ±2,0x103, mPVAT = 1,04 ±0,62x104, GON = 2,4 ±1,2x105.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie
UWAGA: Wyizoluj APC z SVF na podstawie markerów powierzchni komórek CD34 i PDGFRα, wykonując wszystkie kroki w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze blokującym MCS przy 1 x 106 komórek/ml i inkubować przez 20 min. 
	UWAGA: Zawiesiny komórek 1 x 106 - 2 x 108 komórek/ml można skutecznie oddzielić.</li>
	<li>Inkubować komórki z 5 μl mysiego anty-CD34 sprzężonego z FITC (1 μg/1 x 106 komórek) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Obracać komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Inkubować z 4 μl mikrogranulek anty-FITC i 96 μl buforu MCS (całkowita objętość 100 μl) przez 5 minut w temperaturze 4 °C w ciemności w celu oddzielenia komórek CD34+ i CD34-.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj separator magnetyczny do stojaka i umieść kolumnę MultiSort (MS) ze skrzydłami kolumny do przodu, w separatorze. Umieść probówkę zbiorczą o pojemności 5 ml pod kolumną MS w górnym uchwycie probówki.</li>
	<li>Przygotować kolumnę MS, przepłukując ją roztworem buforowym MCS. Nanieść 500 μl buforu MCS na wierzch kolumny i pozwolić buforowi przepłynąć. Wyrzuć ścieki i wymień rurkę zbiorczą.</li>
	<li>Załadować zawiesinę komórek znakowaną przeciwciałami na przygotowaną kolumnę MS. Zbierz przepływ zawierający nieoznakowane komórki.</li>
	<li>Przemyć kolumnę MS 500 μl odgazowanego buforu MCS 3x. Zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą i łączą się z przepływem z poprzedniego kroku.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę MS z separatora magnetycznego i umieść ją na nowej probówce zbiorczej. Odpipetować 1 ml buforu MCS na kolumnę MS. Natychmiast wypłukać frakcję z magnetycznie znakowanymi komórkami, zdecydowanie, ale powoli, nakładając tłok dostarczony z kolumną, aby nie dopuścić do przedostania się nadmiaru gazu do kolumny. 
	UWAGA: Numery izolowanych komórek różnią się w zależności od lokalizacji. Średnia liczba CD34+ APC wyizolowanego z populacji SVF na mg tkanki wynosi: aPVAT = 2,6 ±0,43x102, mPVAT = 9,6 ±1,4x102, GON = 1,3 ±0,22x103.</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 × g w temperaturze 4 °C. Inkubować frakcję CD34+ zebraną w 10 μl roztworu 1:200/1 x 106 komórek anty-PDGFRα królika przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Ponownie odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C. Inkubować znakowane komórki z 4 μl mikrogranulek anty-króliczych IgG i 96 μl buforu MCS, powtarzając kroki od 3.3 do 3.7 w celu wyizolowania. 
		UWAGA: Numery izolowanych komórek różnią się w zależności od lokalizacji. Średnia liczba PDGFRα+ APC wyizolowanego z populacji CD34+ na mg tkanki wynosi: aPVAT = 2,4 ±0,64, mPVAT = 8,4 ±2,4, GON = 10,4 ±1,9, co stanowi 0,5 - 10% wcześniej izolowanej populacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa i indukcja adipogenezy
<ol>
	<li>Hodować SVF i APC na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w pożywkach podstawowych z wymianą co 2 dni. Po 3 sekwencyjnych pasażach, płytka w czarnych 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych 1x102 komórki / dołek do testów proliferacji, które są oceniane po 8, 24, 48 i 96 godzinach, oraz przy 50 000 komórek / basenie na płytkach 24-dołkowych lub 10 000 komórek / dołku w 48-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych 48-dołkowych do testów adipogenezy, które są jakościowe i ilościowe.</li>
	<li>Uzupełnij podłoża podstawowe APC przez 48 godzin po konfluencji i przed indukcją białkiem morfogennym kości 4 (3,3 nmol/L), jak wskazano10 w celu różnicowania. Indukuj komórki po 48 godzinach 100% konfluencji (dzień 0) za pomocą pożywki indukcyjnej APC do inkubacji komórek.</li>
	<li>Po 48 godzinach zmień pożywkę, aby utrzymać komórki w pożywce indukcyjnej APC bez IBMX i deksametazonu, przez 14 dni ze zmianą pożywki co 48 godzin.</li>
	<li>Izolacja MCS zwalidowana przez FACS.
	<ol>
		<li>Pobrać podpróbkę o objętości 50 μl (50 000 komórek) z magnetycznie oddzielonych komórek i przemyć roztworem FACS.</li>
		<li>Odwirować komórki i ponownie zawiesić w 100 μl roztworu 1:1,000 anty-króliczej IgG Dylight 405 w celu znakowania komórek PDGFRα+. Inkubować przez 30 minut, chroniąc przed światłem i w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć komórki i ponownie zawiesić w 200 μl 2% roztworu formaldehydu do czasu analizy za pomocą filtrów 488 nm (FITC) i 405 nm (Dylight 405) na cytometrze przepływowym. 
		UWAGA: Akumulacja lipidów przez hodowane komórki ocenia się ilościowo za pomocą lipofilowego testu fluorescencji adipogenezy w czytniku mikropłytek mierzącym fluorescencję i wykorzystującym preadipocyty jako kalibratory akumulacji lipidów. Akumulacja lipidów jest również mierzona jakościowo za pomocą barwienia barwnikiem lipidowym i obrazowania wykonanego na odwróconym mikroskopie wyposażonym w kamerę, dzięki czemu można zaobserwować procent wszystkich komórek, które zawierają lub nie zawierają lipidów. Do analizy nadaje się każdy czytnik płytek, który jest w stanie zmierzyć fluorescencję ze wzbudzeniem przy 485 nm i emisją przy 572 nm, podobnie jak każdy mikroskop z kamerą zdolną do rejestrowania obrazów cyfrowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Watts, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemerin+connects+fat+to+arterial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemerin connects fat to arterial contraction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).</li>
<li>Dodson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+depots+differ+in+cellularity%2C+adipokines+produced%2C+gene+expression%2C+and+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems.</a> Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).</li>
<li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li>
<li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li>
<li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStacey%2C+G+%22in+eLS%22">in eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).</li>
<li>Swim, H. E., Parker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+characteristics+of+human+fibroblasts+propagated+serially%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially.</a> Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).</li>
<li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li>
<li>Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exaggerated+replication+in+culture+of+adipocyte+precursors+from+massively+obese+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons.</a> Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+fat+adipokine+secretion+is+associated+with+systemic+inflammation+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans.</a> Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+adipogenic+potential+of+perivascular+adipose+tissue+adipocyte+progenitors+is+dependent+on+sexual+dimorphism+and+vessel+location%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location.</a> Physiol Rep. 4 (19), (2016).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).</li>
<li>Ahrens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+bone+morphogenetic+proteins-2+or+-4+in+murine+mesenchymal+progenitor+C3H10T1%2F2+cells+induces+differentiation+into+distinct+mesenchymal+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages.</a> DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).</li>
<li>Bowers, R. R., Lane, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+bone+morphogenetic+protein-4+in+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development.</a> Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).</li>
<li>Schulz, T. J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+bone+morphogenetic+proteins+in+adipogenesis+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+normoxia+enhances+survival+and+proliferation+rate+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+without+increasing+the+risk+of+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis.</a> PLoS One. 10 (1), 0115034(2015).</li>
<li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest izolacja, ekspansja i indukcja adipogeniczna APC z magazynów PVAT. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji APC oparty na identyfikacji komórek wykazujących ekspresję markerów powierzchniowych CD34 i PDGFRα. Te białka powierzchniowe zostały wcześniej zidentyfikowane na APC o wysokich wskaźnikach proliferacji i potencjale do różnicowania się w białe lub brązowe adipocyty w różnych magazynach tłuszczowych14,15. Wybie...

Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa (PVAT), ze względu na bliskie sąsiedztwo naczyń krwionośnych, jest głównym elementem sygnalizacji parakrynnej w funkcji naczyń krwionośnych1. Ekspansja tej tkanki tłuszczowej jest zależna od fenotypu obecnych komórek progenitorowych adipocytów (APC)2,3. Izolacja komórek z tkanki tłuszczowej jest trudna, ponieważ pierwotne adipocyty są kruche, wyporne i mają różną wielkość. Niektóre techniki izolacji mogą również zmieniać fenotyp i morfologię komórek poprzez zwiększenie syntezy białek zapalnych i zmniejszenie ekspresji genów adipogennych4, podkreślając znaczenie protokołu, który utrzymuje integralność komórek.
Hodowla komórek pierwotnych i specyficznych subpopulacji preadipocytów daje redukcjonistyczne podejście do wzrostu in vivo i utrzymuje równoważny skład genetyczny komórek5, chociaż czas pracy z tymi komórkami jest ograniczony ze względu na pogorszenie wraz ze starzeniem się, czyli starzenie6. Preadipocyty z różnych magazynów tkanki tłuszczowej, w tym podskórnych i omentalnych, również wykazują różnice w proliferacji7, co podkreśla znaczenie pobierania komórek z określonych miejsc anatomicznych. Komórki prekursorowe z białych magazynów tłuszczowych innych niż PVAT zostały scharakteryzowane w poprzednich badaniach7,8,9, ale mniej wiadomo o fenotypach PVAT APC.
Techniki opisane tutaj pozwalają na analizę specyficznych i zdefiniowanych populacji APC przy minimalnym wpływie na ich morfologię, żywotność oraz potencjał do proliferacji i różnicowania. Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MCS) jest podatne na dalsze zastosowania, takie jak hodowla, ponieważ kulki rozpuszczają się bez zmiany komórki. MCS jest również ekonomiczny, a po standaryzacji stężeń przeciwciał potrzeba przeprowadzania testów cytometrii przepływowej jest minimalna. Badania in vitro z prekursorami PVAT mogą również dać wgląd w potencjał, jaki mogą mieć te pierwotne komórki.

<table><tbody><tr><td> Sekcja tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Naczynia preparacyjne</td><td>Ręcznie robione z kulturą silikonową</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Szklany</td></tr><tr><td>elastomer silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 170</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>plecionych szwów jedwabnych</td><td>Aparat Harvard</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Mikroskop Stereomaster Światłowodowe źródło światła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-150</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do odłamków</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-55</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek</td><td>George Tiemann & Co</td><td>105-400</td><td></td></tr><tr><td>KRBB Rozwiązanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-114</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><<tr><td>silny>Trawienie tkankowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1</td><td>Worthington Biochemiczna</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td>1X Roztwór roboczy</td></tr><tr><td>do kąpieli wodnej</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2876</td> Kabina bezpieczeństwa biologicznego do <td>kąpieli z wzajemnym wytrząsaniem</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>1385</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z rożna</td><td>Daigger</td><td>EF4894C</td><td></td></tr><tr><td>100 & Mikro; m Sitko do komórek</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td>Żółty</td></tr><tr><td>40 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Niebieski</td></tr><tr><td>hemocytometr</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Cell Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Kit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM):F12 Medium</td><td>Corning</td><td>90-090</td><td>Średniobazowa</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35016CV</td><td>USA Origins</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>AbCam</td><td>AB7475</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD34</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7324</td><td>FITC-sprzężona</td></tr><tr><td>z anty-PDGFR&alpha;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>PA5-17623</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10X</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>1X Roztwór roboczy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO 2 Inkubator komórkowy</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td>Heracell 160i&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 48-dołkowe</td> poddane działaniu TC <td>Płytki 96-dołkowe Corning</td><td>3548</td><td>poddane TC</td></tr><tr><td>, czarne ścianki</td><td>Corning</td><td>353376</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td> poddany działaniu TC <td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td> Surowica cielęca <td>potraktowana TC</td></tr><tr><td>(FCS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td>USA Origins</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>137-08-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>61-030</td><td></td></tr><tr><td>Białko morfogenne kości 4 (BMP4)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-081</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>400-25</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>PeproTech</td><td>250-02</td><td></td></tr><tr><td>Płytkowy czynnik wzrostu BB</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-740</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Corning</td><td>25-800-CR</td><td>Roztwór ITS</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28822-58-4</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-02-2</td><td></td></tr><tr><td>T3 (trójjodotyronina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6893-023</td><td></td></tr><tr><td>Analiza komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT Test proliferacji</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Scientific C7026</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed Odczynnik do oznaczania fluorescencji</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do barwników lipidowych Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391</td><td>In Solution</td></tr><tr><td>M1000 Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celownik cyfrowy Celownik cyfrowy DS-Qil</td><td>Aparat fotograficzny Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Ekspansja okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT), głównego regulatora funkcji naczyń krwionośnych poprzez sygnalizację parakrynną, jest bezpośrednio związana z rozwojem nadciśnienia podczas otyłości. Zakres przerostu i hiperplazji zależy od lokalizacji magazynu, płci i rodzaju obecnych fenotypów komórek progenitorowych adipocytów (APC). Techniki stosowane do izolacji APC i preadipocytów w ciągu ostatnich 10 lat drastycznie poprawiły dokładność, z jaką można identyfikować poszczególne komórki na podstawie określonych markerów powierzchniowych komórek. Jednak izolacja APC i adipocytów może być wyzwaniem ze względu na kruchość komórki, zwłaszcza jeśli nienaruszona komórka musi zostać zachowana do zastosowań w hodowli komórkowej.
Magnetycznie aktywowane sortowanie komórek (MCS) zapewnia metodę izolowania większej liczby żywotnych APC na jednostkę masy tkanki tłuszczowej. APC pozyskany przez MCS może być wykorzystany do protokołów in vitro w celu namnażania preadipocytów i różnicowania ich w adipocyty poprzez zastosowanie koktajli czynników wzrostu, co pozwala na analizę potencjału płodnego i adipogennego zatrzymywanego przez komórki. Eksperyment ten koncentrował się na magazynach PVAT aorty i krezki, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju chorób sercowo-naczyniowych podczas ekspansji. Protokoły te opisują metody izolacji, rozszerzania i różnicowania zdefiniowanej populacji APC. Ten protokół MCS pozwala na zastosowanie izolacji w każdym eksperymencie, w którym potrzebne jest sortowanie komórek, przy minimalnym sprzęcie lub szkoleniu. Techniki te mogą pomóc w dalszych eksperymentach mających na celu określenie funkcjonalności określonych populacji komórek w oparciu o obecność markerów na powierzchni komórki.

Zdolność proliferacyjna preadipocytów oraz potencjał adipogenny prekursorów adipocytów są cechami utrzymywanymi in vitro11. Proliferację in vitro wyizolowanej SVF oraz APC z aPVAT, mPVAT i GON samców szczurów oceniano w 8., 24., 48. i 96. godzinie po wysianiu, stosując ilościowe badanie DNA. Nie zaobserwowano różnic w tempie ekspansji SVF w zależności od miejsca pobrania w żadnym z punktów czasowych, z wyjątkiem APC z aPVAT, które wykazywały mniej...

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Ogólnym celem tych protokołów izolacji i różnicowania jest uzyskanie komórek progenitorowych adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej oraz indukowanie ich różnicowania w dojrzałe adipocyty. Metoda ta umożliwia analizę specyficznych i zdefiniowanych populacji komórek progenitorowych adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej, przy minimalnym wpływie na ich morfologię, żywotność oraz potencjał do proliferacji i różnicowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zwiększenia izolacji komórek prezentujących antygen z jednego grama tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją.Po potwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy, wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej wzdłuż mostka aż do obszaru krocza szczura, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Odsłoń tętnicę krezkową górną, małe naczynia oporowe krezkowe oraz aortę piersiową, a następnie przetnij wszystkie połączenia z krezką i aortą. Zbierz tkankę tłuszczową gonadalną i przenieś wyizolowane zapasy tłuszczu do nowego pojemnika z buforem Krebsa-Ringera z wodorowęglanem, czyli roztworem KRBB, uzupełnionym o 10 mM HEPES.Przenieś naczynia do szalki Petriego zawierającej roztwór KRBB i umieść szalkę pod mikroskopem dissectingowym. Usuń tkankę tłuszczową okołonaczyniową z małych naczyń oporowych krezkowych oraz z aorty. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś około 50 mg tkanki do probówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 1 ml roztworu kolagenazy typu I, a następnie posiekaj tkankę na kawałki o wielkości od 1 do 3 mm.Ważne jest, aby odpowiednio rozdrobnić tkankę tłuszczową, co pozwoli kolagenazie na dokładną infiltrację tkanki łącznej. Fragmenty inkubować w temperaturze 37°C przy potrząsaniu przez 1 godzinę. Następnie sekwencyjnie filtrować strawiony materiał przez poszczególne sita komórkowe o oczkach 100 i 40 µm do probówki o pojemności 50 mL.Zebrane poprzez wirowanie filtrate przelej, a osad zawieś ponownie w 1 mililitrze buforu do lizy erytrocytów. Przenieś zawiesinę komórkową do nowej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,7 mililitra i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie odzyskaj komórki frakcji naczyniowej szpiku poprzez ponowne wirowanie i zawieś osad w podstawowej pożywce dla frakcji naczyniowej szpiku w celu ich policzenia.Aby wyizolować komórki progenitorowe adipocytów za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS), należy zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie zawiesić osad w buforze blokującym do MACS w stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Niezbędne jest, aby wszystkie etapy izolacji były przeprowadzane w temperaturze 4 °C, a nie na lodzie. Następnie inkubować komórki z 5 µL przeciwciał przeciwko CD34 mysich sprzężonych z FITC przez 30 minut.Komórki należy zebrać poprzez wirowanie. Następnie inkubować komórki z 4 µL anti-FITC MicroBeads w 96 µL buforu do magnetycznego sortowania komórek (magnetic-activated cell sorting buffer) przez 5 minut w ciemności. Podczas inkubacji komórek należy umieścić kolumnę do wielokrotnego sortowania (multi-sort column) w separatorze magnetycznym, umieszczając pod kolumną probówkę na odpady o pojemności 5 ml.Przepłucz kolumnę 500 µL buforu do magnetycznej separacji komórek, a następnie wylej odciek i wyrzuć probówkę z odpadami. Następnie umieść nową probówkę pod kolumną i nałóż komórki na górną część kolumny, zbierając nieznaczone komórki CD34-ujemne do nowej probówki zbiorczej. Po przejściu wszystkich komórek przez górną część kolumny, przemyj kolumnę 3 razy 500 µL odgazowanego buforu do magnetycznej separacji komórek, kontynuując zbieranie eluatu do probówki zbiorczej.Po ostatnim przemyciu przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i za pomocą tłoka kolumny przepłucz 1 milliliter buforu do magnetycznej separacji komórek przez kolumnę do probówki, aby zebrać komórki CD34 dodatnie. Zbierz progenitorowe komórki adypocytów poprzez wirowanie. Następnie inkubuj frakcję CD34 dodatnią w 10 microliters przeciwciała królika przeciwko receptorowi alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego przez 30 minut.Po zakończeniu inkubacji ponownie odwiruj komórki, a osad inkubuj w 4 µL MicroBeads z przeciwciałami anty-IgG przeciw królikowi w 96 µL buforu do magnetycznej separacji komórek (MACS) w celu izolacji komórek wykazujących ekspresję receptora PDGF-α za pomocą kulek magnetycznych, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Aby hodować progenitorowe komórki adypocytów CD34+ PDGF-α+, wysiej komórki w osobnych 6-dołkowych płytkach do hodowli tkanek w podłożu podstawowym i umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Po 3 pasażach seryjnych wysiej komórki do czarnych 96-dołkowych płytek do hodowli tkanek w zagęszczeniu 1 × 10² komórek na dołek, a następnie oceń ich proliferację po 8, 24, 48 i 96 godzinach przy zagęszczeniu 5 × 10⁴ komórek na dołek w 24-dołkowych płytkach analitycznych, zgodnie ze standardowymi protokołami testów proliferacji.Aby indukować adipogenezę, po osiągnięciu przez hodowlę komórek progenitorowych adipocytów stanu konfluencji, należy hodować komórki w podstawowej pożywce dla progenitorów adipocytów przez 48 godzin, a następnie traktować hodowle białkiem morfogenetycznym kości 4 przez kolejne 48 godzin. Trzeciego dnia należy zastąpić pożywkę pożywką indukującą dla komórek progenitorowych adipocytów, bez dodatku IBMX i eksametazonu, na okres 14 dni. Stopień adipogenezy w hodowlach można następnie ocenić przy gęstości 1 × 10⁴ komórek na studzienkę w 48-dołkowych płytkach do hodowli tkanek, zgodnie ze standardowymi protokołami testów adipogenezy.Choć obie metody wykazują podobny rozkład populacji komórek i ich żywotność, izolacja za pomocą magnetycznego sortowania komórek pozwala na uzyskanie większej liczby komórek do hodowli w porównaniu z fluorescencyjnym sortowaniem komórek. W tym reprezentatywnym eksperymencie oceniono za pomocą ilościowego testu DNA proliferację in vitro frakcji naczyniowo-strolmalnej oraz komórek progenitorowych adipocytów, wyizolowanych za pomocą magnetycznego sortowania z aorty piersiowej, małych naczyń oporowych krezki oraz tkanki tłuszczowej gonadalnej samców szczurów, w odstępach 8, 24, 48 i 96 godzin po wysianiu. W żadnym z punktów czasowych nie zaobserwowano różnic w tempie ekspansji frakcji naczyniowo-strolmalnej w zależności od miejsca pobrania, z wyjątkiem komórek progenitorowych adipocytów z aorty piersiowej, które wykazały mniejszą proliferację po 96 godzinach w porównaniu z komórkami naczyniowo-strolmalnymi z tego samego miejsca.Stymulacja konfluencyjnych komórek progenitorowych adipocytów białkiem morfogenetycznym kości 4 przez 48 godzin indukuje różnicowanie adipocytów, co potwierdza zwiększona akumulacja lipidów w kroplach, oceniana zarówno za pomocą fluorescencyjnego testu poboru lipidów, jak i barwienia Oil Red O. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w 8 godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas realizacji tej procedury ważne jest pamiętanie o utrzymaniu temperatury 4 °C podczas etapów izolacji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować i różnicować komórki progenitorowe adypocytów.

expansion-adipogenesis-induction-adipocyte-progenitors-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Celem tego protokołu jest przetestowanie zdolności komórek progenitorowych pochodzących z ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Różnicowanie porównano z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z ludzkiego szpiku kostnego, o których wiadomo, że różnicują się w linie adipocytów, osteocytów i chondrocytów.

Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy izolację, hodowlę i indukcję adipogenną preadipocytów pochodzących z frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej okołoaortalnej, co pozwala na badanie funkcji okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i jej związku z komórkami naczyniowymi.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna preadipocytów pochodzących z frakcji zrębu naczyniowego z mysiej tkanki tłuszczowej okołooortalnej

Ten protokół opisuje izolację mięśni szkieletowych i mięśni sercowych włóknisto-adipogennych (FAP) od myszy kolczastej (Acomys) poprzez dysocjację enzymatyczną i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. FAP uzyskane z tego protokołu mogą być skutecznie rozszerzane i różnicowane do miofibroblastów i adipocytów.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Poznaj metodę izolacji progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych. Technika ta zwiększa wydajność izolacji przy minimalnym wpływie na żywotność komórek.

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych (Wideo) | JoVE Journal

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Przeglądaj więcej filmów